망막 신경절 세포의 정의 된 서브 세트의 단일 세포 RNA-Seq

요약

여기에서, 우리는 단클론 성 전 사체의 단리 및 후속 특성 규명을 위해 연결 세포 유형을 분류하기위한 조합 접근법을 제시한다. 이 프로토콜은 성공적인 RNA 시퀀싱 (RNA-Seq)을위한 샘플 준비를 최적화하고 세포 다양성의 강화 된 이해를 위해 특별히 고안된 방법을 설명합니다.

초록

세포 유형별 마커의 발견은 세포 기능과 세포 이질의 기원에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 최근 뉴런의 다양성에 대한 이해를 높이기 위해 발현이 세포의 여러 하위 집단을 정의하는 유전자를 확인하는 것이 중요합니다. 망막은 중추 신경계의 다양성 연구를위한 훌륭한 모델로, 여러 주요 세포 유형으로 구성되어 있습니다. 각 주요 부류의 세포에 대한 연구는 이러한 개체군의 동정을 용이하게하는 유전자 마커를 산출했다. 그러나, 세포의 여러 하위 유형이 각각의 주요 망막 세포 클래스 내에 존재하며, 이들 아형의 유형 중 일부는 형태 학적 또는 기능적 특징으로 특징 지어졌지만 유전 적 마커를 가지고있다. 개별 망막 아형에 대한 유전 적 마커에 대한 지식은 특정 시각 기능과 관련된 뇌 표적의 연구와지도 작성을 가능하게하고 유전자 네트워크에 대한 통찰력을 제공한다.세포 다양성을 유지하라. 아형의 유전 적 표지자를 확인하는 데 사용되는 현재의 방법은 서열 분석에 따른 세포 유형의 분류와 같은 단점을 가지고있다. 이는 데이터 분석에 대한 도전 과제이며 클러스터에 동일한 기능의 셀이 포함되도록하기 위해 엄격한 검증 방법이 필요합니다. 우리는 분리 및 시퀀싱 이전에 세포의 형태 및 기능을 확인하여 하위 유형별 마커를 쉽게 식별 할 수있는 기술을 제안합니다. 이 기술은 비 신경 세포 유형뿐만 아니라 사소한 변형이있는 희귀 한 세포 집단까지 확장 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 우수한 품질의 데이터를 제공하며, 많은 라이브러리가 단일 셀에 대해 2,000 만 건 이상의 읽기 깊이를 제공합니다. 이 방법론은 Single-cell RNA-Seq이 제시하는 장애물 중 많은 부분을 극복하고 직접적이고 매우 효율적인 방법으로 세포 유형을 규명하고자하는 연구자에게 적합 할 수 있습니다.

서문

뉴런의 다양성은 중추 신경계, 특히 척수 망막에서 관찰되며 망막 전구 세포 ^{1 , 2 , 3} 의 한 집단에서 유래 한 1 개의 신경교 세포와 6 개의 신경 세포 유형으로 구성된 고도로 전문화 된 조직이다. 세포의 많은 아형들은 기능적으로, 형태 학적으로, 그리고 유 전적으로 분류 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 목표는 세포 유형의 유전 적 다양성을 식별 가능한 기능적 및 / 또는 형태 학적 특성에 연결하는 것입니다. 세포의 분류를 위해 많은 유전자가 확인되었지만 많은 하위 유형은 전체 인구의 작은 부분을 대표하므로 특성화되지 않고 계속됩니다. 이러한 특정 아형 내에서의 유전자의 동정은 망막 내에서의 연결의 다양성에 대한 더 큰 이해를 가능하게 할 것이고, 다른 곳에서 신경 세포의 다양 화를 밝힐 수도있다. 부더구나, 단세포 연구는 새로운 세포 유형의 발견을 허용하며, 이는 전체 인구 중 낮은 수치로 인해 간과되었을지도 모르는 ^{4 , 5 , 6 , 7} .

단일 세포 transcriptomics의 이점 중 하나는 특정 세포 아형을 정의하는 고유 마커 또는 마커의 조합을 발견 할 수 있다는 것입니다. 이것들은 다른 조작을 위해 그 세포 유형에 대한 유전자 접근을 얻기 위해 사용될 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 photopigment melanopsin을 표현하는 망막 신경절 세포의 하위 집합의 세포 유형 특정 유전자를 특성화하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다. 망막 신경절 세포를 나타내는 멜라닌 신 (melanopsin)을 발현하는 세포에서 형광 마커를 사용하면 알려진 유전자의 발현으로 인해 이들 세포가 함께 모이기 때문에 이들 세포를 연구 할 수 있습니다. 흥미롭게도,이 세포 popu의 다섯 가지 알려진 아형이 있습니다마우스 망막 ^8에서 . 따라서, 각 유형의 세포에서 RNA를 분리하기 위해, 우리는 세포 분리 전에 각 아형을 확인하기 위해 형질 전환 모델 내에서 확립 된 형태 학적 분류를 사용했다. 이 기술은 조직 해리가 필요없는 세포의 특성화와 망막에서의 직접적인 분리를 가능하게합니다. 조직 해리없이 세포 내에서 스트레스 반응을 일으키고 절단 된 수상 돌기로 인한 오염을 유발할 수 있습니다.

RNA-Seq 방법이 계속 발전함에 따라 지난 몇 년 동안 수많은 새로운 기술이 밝혀졌습니다. 이 도구를 사용하면 ^{4 , 7 , 10 , 11 , 12 , 13} 번 문제에 접근하면서 최대의 셀 획득 및 비용 효율성을 극대화 할 수 있습니다. 그러나,이 기술은 우수한 디딤돌이었으며, 여전히이 프로토콜이 해결할 수있는 많은 장애물이 있습니다. 첫째, 현재의 많은 절차는 해리 된 조직으로부터 세포를 분리하고, 세포 분류를 결정하기 위해 주성분 분석 또는 사후 (post-hoc) 계층 적 클러스터링을 사용하려고 시도한다. 이러한 유형의 도구를 사용하여 하위 유형을 분류하면 신뢰할만한 결과를 얻을 수 없으며 기능성 세포 유형에 대한 유전 적 표지의 상관 관계에 대해이 데이터의 유효성을 검사하는 새로운 방법을 강요 할 수 있습니다. 다른 프로토콜에서 해리에 대한 요구 사항은 때때로 조직 손상을 초래할 수 있으며, 신경 프로세스가 절단되어 mRNA의 잠재적 손실을 초래할 수 있습니다. 또한, 해리 세포 준비에서 스트레스 반응은 이러한 세포의 transcriptomes ¹⁴ 영향을 시작할 수 있습니다. 이 프로토콜은 격리 이전에 기능 세포 유형을 결정함으로써 이러한 문제를 극복하고, h망막 조직을 손상시키지 않으면 서 세포의 증식.

한 기술은 2014 년에 도입 되었고 생체 내 전 사체의 생체 내 분석으로 구성되었습니다 ¹⁵ . 이 기술은 조직에 대한 기계적 파괴를 최소화하면서 전 사체의 검사를 허용하지만 매우 특이적인 기자 마우스를 사용하지 않고 전 사체를 검사하기 전에 조직 내 특정 세포 유형을 분류하는 능력이 부족합니다. 우리의 프로토콜은 특정 리포터를 필요로하지 않습니다. 왜냐하면 우리는 세포 충전 및 전기 생리학을 이용하여 격리 전에 세포를 특성화하기 때문입니다. 이 이전 프로토콜의 또 다른 한계는 특정 파장이 광활성 요소를 여기시키는 데 필요하다는 것인데, 우리 프로토콜은 형광 리포터와 형광 염료의 사용을 허용하고 있습니다.이 리포터와 형광 염료는 쉽게 사용할 수 있거나 각 실험실별로 개별적으로 선택할 수 있습니다. 아직도, 다른 실험실은 electr의 2 가지의 방법을 결혼했다세포 다양성 연구를위한 생리학 및 전이 학. 분리 이전에 세포의 기능을 특성화하기위한 패치 - 클램프 기록의 사용은 해리 된 뉴런 ^{16에서 수행} 되었고, 어떤 경우에는 이러한 연구를 위해 마이크로 어레이 분석 ¹⁷ 을 사용하기도했다. 이러한 접근법에서 동일한 합병증이 발생합니다. 조직 분해 또는 이용 가능한 프로브에 대한 시료의 하이브리드 화에 의존하는 마이크로 어레이 기술의 사용이 필요하기 때문입니다. 가장 최근의 진보 중 하나는 전체 뇌 조각에서 세포를 이해하기 위해 패치 클램프 녹음과 RNA-Seq 기술을 결합한 기술인 Patch-Seq의 개발이었습니다. 이 기술은 여기에 제시된 프로토콜과 유사하지만, 우리의 접근 방식은 조직이 세포의 건강을 유지하기 위해 그대로 유지된다는 것을 다시 한번 주목하는 것이 중요합니다. 여기서는 최적화를위한 프로토콜을 제시합니다.이는 RNA-Seq을 사용하여 높은 판독 깊이와 매핑 범위를 얻기 위해 고품질의 단일 세포 라이브러리를 생성합니다.

프로토콜

모든 절차는 Northwestern University의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다.

1. 전기 생리학 솔루션 준비 (4 시간)

1. 역삼 투 정제 된 H ₂ O 999 mL에 디 에틸 피로 카보네이트 (DEPC) 1 mL를 첨가하여 0.1 % DEPC 처리 H ₂ O를 만든다. 완전히 혼합하고 혼합물을 실온 (RT)에서 1 시간 동안 배양시킨다. 그런 다음 액체 순환에서 15 분 동안 DEPC 혼합 H ₂ O를 고압 멸균합니다. DEPC 처리 H ₂ O를 실온에서 냉각시킨다.
2. Ames의 배지 1L과 중탄산 나트륨 1.9g (23mM)을 1L의 H ₂ O에 섞어 세포 외 용액을 만듭니다. 세포 외 용액을 버블 링합니다.
   95 % O ₂ / 5 % CO ₂ 로 유지하고 pH 7.3-7.4로 유지한다.
3. 125 mM K-gluconate, 2 mM MgCl ₂ , 10 mM EGTA, 10 mM HEPES 및 0.1 % DEPC 처리 된 H를 혼합하여 세포 내 용액을 생성한다₂ O. -20 ° C에서 1 ML aliquots에 보관하십시오. 각 실험의 시작 부분에 형광 트레이서 10 μM을 추가합니다.
4. 4.15 mL의 세포 외 용액에 10,000 단위의 콜라게나 제와 83 mg의 히알루로니다 제를 첨가하여 효소 용액을 만든다. 효소 용액은 -20 ° C에서 50 μL 나누어 져 저장해야합니다.

2. 망막 조직의 준비 (2 시간)

참고 :이 섹션의 모든 절차는 어두운 적색 조명 하에서 수행해야합니다

1. 해부되기 최소 1 시간 전에 어둠 적응 동물. 희미한 적색 조명 하에서 모든 절차를 수행하십시오.
2. 이산화탄소 질식으로 동물을 안락사시키고 이전에 산소가 공급 된 세포 외 용액이 담긴 페트리 접시에 안구를 적출하십시오.
3. 바늘로 각막을 찔러 각막과 공막의 경계에서 안과 가위로 잘라서 잘라냅니다 ¹⁹ .
4. 렌즈를 사용하여 제거# 5 집게. 부드럽게 포셉로 공막에 눈물을 만들고 망막과 공막이 만나는 시신경을 절단하십시오. 조심스럽게 망막에서 공막 제거를 마칩니다.
5. # 5 포 셉를 사용하여 투명한 유리를 제거하십시오; 한 번 제거하면 유리체는 포셉에 붙어 젤라틴 물질로 나타납니다. 망막을 반으로 썰어 (4 개 / 동물이 있도록) 사용하기 전까지 RT에서 산소가 공급 된 세포 외 용액에 저장하십시오.
6. 기록 챔버에 조직을 장착 준비가되면, 산소화 된 세포 외 용액 500 μL로 희석 한 효소 용액에서 배양하기 위해 망막 조각을 놓습니다. 셰이커에서 실온에서 2 분 동안 페트리 접시에서 품어 라.
   1. 산소가 공급 된 세포 외 용액에서 망막 조각을 씻고 유리 바닥 기록 챔버에 조직을 놓습니다. 팁을 잘라내어 플라스틱 전달 피펫을 사용하여 망막이 조직에 손상을주지 않으면 서 전달되도록합니다.
7. 사용ceps를 사용하여 photoreceptor layer가 아래를 향하게하여 조직을 조심스럽게 평평하게하십시오. 피펫을 사용하여 여분의 액체를 제거하십시오. 나일론 메쉬가있는 백금 링을 사용하여 조직을 고정시킵니다.
   참고 :이 방법은 또한 라벨 amacrine 및 양극성 세포에서 RNA를 분리하기 위해 조직을 준비하는 데 사용할 수 있습니다.
8. 산소가 공급 된 세포 외 용액으로 챔버를 채우고 현미경 스테이지에 장착하십시오. 2 ~ 4 mL / min의 산소가 공급 된 세포 외 용액으로 조직을 관통시킵니다.

GFP + 망막 신경절 세포의 시각화 및 타게팅 (10 분)

참고 :이 섹션의 모든 절차는 어두운 적색 조명 하에서 수행해야합니다

1. 시작하기 전에 마이크로 피펫 풀러 (micropipette puller)를 사용하여 전기 생리 학적 기록을 위해 유리 마이크로 피펫 (OD : 1.2 mm, ID : 0.69 mm)을 당깁니다. 전극에 대해 다음 프로토콜을 사용하십시오 (매개 변수는 원하는 저항과 목적을 달성하기 위해 적절히 조정해야합니다.풀러 및 다른 유리로 다양 함) : 열 : 램프 +10; 당기기 : 0; Vel : 23; 지연 : 1; 압력 : 500; 프로그램 루프 : 5 번. 팁의 직경이 ~ 1 μm이고 큰 셀을 타겟팅 할 때 2-4 MΩ, 작은 셀을 타겟팅 할 때 5-7 MΩ의 저항이 있는지 확인하십시오.
2. 적외선 차동 간섭 대조 (IR - DIC) 광학 ( 그림 1A )을 사용하여 신경절 세포 레이어를 관찰하십시오. epifluorescence (~ 480 nm)를 사용하여 GFP + 망막 신경절 세포 (RGCs)를 확인하십시오 ( 그림 1B ).
3. DIC에서 세포 내 솔루션으로 가득 피펫을 찾습니다. 약간의 양의 압력을 가하고 앰프의 모든 전압 오프셋을 제로로하십시오.
4. GFP + 세포에 대한 유리 micropipette을 누르고 피펫과 세포막 사이에 GΩ 인감을 형성하는 부정적인 압력을 적용합니다. 테스트 전압 명령 단계 ( 예 : 5 mV)를 적용하여 씰 저항을 모니터링하십시오. 안정한 밀봉을 형성 한 후, n의 짧은 펄스를가함으로써 멤브레인을 파열시킨다전체 세포 접근을 얻기위한 압력.
5. 형광 추적자를 채우기 위해 세포의 수상 돌기가 1-2 분 동안 기다리십시오.
   참고 : 세포는 epifluorescence ( 그림 1C )의 형태학을 검토하여 morphologically 입력하실 수 있습니다. melanopsin을 발현하는 RGCs의 경우, 내부 plexiform 층의 돌기 층화는 epifluorescent 조명 하에서 형광 추적자로 채워진 수상 돌기를 검사하고 ganglion 근처의 off sublamina (M1 ipRGCs)의 soma로부터 멀리 계층화 하는지를 결정함으로써 시각화된다 (M2 & M4 ipRGCs) 또는 둘 모두 (M3 ipRGCs)에 영향을 미칠 수 있습니다. soma 크기 (M4s는 다른 모든 ipRGC 아형에 비해 현저히 큰 somas를 가짐)와 결합 된이 관찰은 세포 유형 ^{20 , 21 , 22의 확인을 허용} 합니다. 따라서,이 기술은 RNA iso 전에 시험 관내에서 세포 유형의 동정을 허용한다준비. 이 방법은 수지상 형태 또는 세포 생리를 포함하는 다른 세포 유형 식별 프로토콜을 위해 변형 될 수있다.

4. 세포 분리 (2 분)

1. 시작하기 전에 탁상용 미세 원심 분리기를 2,000 x g으로 설정하십시오. 1cc 주사기로 호스 (OD : 3/32 in, ID : 1/32 in)를 연결하여 시료 배출 장치를 준비하십시오.
2. 얼음에 용해 버퍼와 1 % β - mercaptoethanol의 10 μL를 포함하는 장소 0.2 ML PCR 튜브. 피펫 팁을 씻어 DEPC - 처리 H ₂ O를 포함하는 1 CC 주사기를 준비합니다. 샘플 수집 후 lysis buffer를 동결시키기 위해 드라이 아이스 용기를 준비하십시오.
3. 조심스럽게 10 ML 주사기를 사용하여 부정적인 압력을 적용하여 세포 피펫의 세포질 콘텐츠를 추출; 가능한 경우 세포 기관을 포함하여 모든 세포질 함량을 추출해야한다.
   1. 크기가 감소하는 세포체를 시각화하여 DIC에서 추출을 모니터하십시오. 추출한 후 세포질 내용, 조직의 신중하게 피펫을 들어 올려 신속하게 솔루션에서 피펫을 제거합니다.
4. 신속하게 헤드 - 스테이지 홀더에서 피펫을 제거하고 1 ML 주사기를 사용하여 DEPC - 치료 H ₂ O로 피펫 팁을 짧게 씻어. 시료를 배출하기 위해 꽉 조이는 튜브를 통해 1 mL 주사기에 피펫을 연결하십시오.
5. 즉시 0.2 ML PCR 튜브에 1 % 베타 - mercaptoethanol를 포함하는 용해 버퍼 1 10 μL에 세포를 추방.
   참고 : 세포와 함께 전체 aspirate는 거품을 유입시키지 않도록 부드럽게 배출해야합니다.
   1. 튜브를 탁상 형 미니 원심 분리기에 2,000 xg에서 10 초간 간단히 원심 분리하십시오. 드라이 아이스로 5 분간 샘플을 즉시 플래시 동결하십시오. 동결 후 최상의 결과를 위해 최대 2 주 동안 -80 ° C에서 보관하십시오. 샘플은 더 오래 지속될 수 있지만 가능한 빨리 처리하는 것이 좋습니다.

RNA 정제 (30 분)

1. 시작하기 전에 뒤집힌 P20 또는 P200 팁 홀더의 상단 부분을 96- 웰 마그네틱 스탠드 ²³ 에 테이프로 고정하여 자기 분리 장치를 설치하십시오.
2. 신선한 70 % 에탄올 (EtOH)을 준비하십시오 - 샘플 당 약 1 mL로 충분합니다. 4 ° C 보관에서 RNA 자석 구슬을 제거하고 적어도 30 분 RT에서 해동.
   참고 :이 프로토콜의 많은 단계는 효율성과 신속한 처리에 의존하기 때문에 한 번에 최대 8 개의 샘플을 처리 할 수 ​​없습니다.
3. 일단 자기 구슬이 실온에있게되면, 용액이 잘 섞여 있는지 30 초 동안 볼텍스하십시오.
   참고 : 비드는 RNA에 선택적으로 결합하는 RNA 특이 적 완충제를 사용하며, 자성 플레이트 스탠드와 함께 사용할 경우 다른 세포 낭성 물질을 제거 할 수 있습니다.
4. RT에서 1 분 동안 세포를 해동시킨 다음 각 샘플에 RNase가없는 H ₂ O 5 μL를 첨가하십시오. 피펫 위아래. 각 튜브와 pipett에 RNA 비즈 22 μL를 추가e를 철저히 섞어 라. RNA가 상호 작용하고 자기 구슬과 바인딩 수 있도록 RT에서 샘플을 품어 5 분.
5. 튜브를 자기 분리 장치에 놓고 8 분 동안 그대로 두십시오. 계속하기 전에 상층 액이 깨끗한 지 확인하십시오. 한 펠릿에서 구슬을 관찰하고 pipetting 동안 분리하지 않도록하십시오.
6. 샘플에서 뜨는을 제거하고 70 % EtOH 150 μL를 추가합니다. EtOH를 제거하고 두 번 더 세탁을 반복하십시오.
7. 샘플을 6 분 동안 공기 건조시킵니다. EtOH가 튜브의 바닥에 모아 졌는지 간헐적으로 확인하십시오. 적절하게 제거하십시오.
8. 시료가 건조되는 동안 19㎕의 용해 완충액 2와 1㎕의 RNase Inhibitor (40U / μL)를 혼합하여 10X 반응 완충액을 준비하십시오. 간단히 회전시키고 얼음 위에 올려 놓으십시오.
9. 샘플이 건조하고 비드 알갱이가 더 이상 광택이 보이지 않으면 자성 분리기에서 튜브를 꺼내고 9.5 μL의 RNase-free H ₂ O샘플을 다시 수화합니다. 얼음에 샘플을 놓고 각 샘플에 10x 반응 버퍼 1 μL를 추가합니다.

6. 역전사 (10 분)

참고 : 시작하기 전에 얼음에 역전사 (RT; 효소를 제외하고)를 위해 필요한 시약을 녹입니다. 여기에는 프라이머 II, 완충액 1, 올리고 뉴클레오티드 및 RNase 억제제가 포함됩니다.

1. 각 튜브에 2μL의 프라이머 II (AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT ₍₃₀₎ N _-1 N, N _-1 은 A, C 또는 G가 될 수 있고 N은 A, C, G 또는 T, 12 μM이 될 수 있음)를 첨가하십시오. 72 ° C에서 3 분간 예열 된 thermocycler에 튜브를 넣으십시오.
2. 배양하는 동안 RT 마스터 믹스를 준비하십시오. 각각의 반응에 대해 완충액 1 (250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 30 mM MgCl ₂ ) 4 μL, 올리고 뉴클레오타이드 (48 μM) 1 μL 및 RNase 억제제 (40 U / μL).
3. 부화 직후에 튜브를2 분 동안 얼음.
4. 마스터 믹스와 피펫으로 역전사 효소 (100 U / μL)의 반응 당 2 μL를 철저히 첨가하십시오. 각 튜브에 7.5 μL의 마스터 믹스를 첨가하고 부드럽게 피펫 팅하여 혼합하십시오. 짧게 내용물을 수집하기 위해 튜브를 회전시키고 다음 프로그램을 사용하여 예열 된 열 순환기에 넣으십시오 : 42 ° C에서 90 분, 70 ° C에서 10 분간, 그리고 4 ° C에서 멈춤.
5. 계속하기 전에 -20 ° C / N에 튜브를 보관하십시오. 장기간 보관하기 전에 샘플을 증폭 단계로 옮기는 것이 좋습니다. 다른 소식통은 4 ° C에서의 O / N 저장이이 단계 ²⁴ 에서도 받아 들여질 수 있다고 제안했다.

cDNA 증폭 (2.5 시간)

참고 : 시작하기 전에 PCR 버퍼와 PCR 프라이머를 얼음 위에서 녹이고 PCR 마스터 믹스를 만들기 전에 탁상 미니 원심 분리기에서 튜브를 회전 시키십시오.

1. 각 반응에 대하여, pPCR 완충액 25 μL, PCR 프라이머 (12 μM) 1 μL, DNA 중합 효소 1 μL 및 핵산 분해 효소가없는 H ₂ O 3 μL가 들어있는 PCR 마스터 믹스를 다시 채 웁니다. 추가하기 직전에 DNA 중합 효소를 마지막으로 첨가하십시오 마스터 믹스를 샘플에 적용합니다.
2. 각 튜브에 30 μL의 마스터 믹스를 첨가하고 10 초 동안 2,000 xg으로 스핀하여 튜브의 바닥에서 내용물을 수집합니다.
3. 다음 프로그램과 함께 예열 thermocycler에 튜브를 놓으십시오 : 1 분 95 ° C; 98 ℃에서 10 초, 65 ℃에서 30 초, 및 68 ℃에서 3 분의 34 사이클; 72 ℃에서 10 분; 4 ℃에서 유지.
   참고 :이 PCR의 사이클 수는 제안 된 제조업체의 지침과 달리 34로 증가되었습니다. 반복 테스트 후이 사이클 번호는 지속적으로 안정적인 결과를 산출하는 것으로 확인되었습니다.
4. 진행하기 전에 최대 1 년 동안 -20 ° C에서 튜브를 보관하십시오.

8. 증폭 된 cDN의 정제A (30 분)

1. 정화를 시작하기 전에 적어도 30 분 동안 DNA 비드 및 용리 완충액을 실온으로 가져온다. 신선한 80 % EtOH를 준비하십시오; 1 mL 당 1 mL로 충분합니다. 각 샘플에 10X 용해 버퍼 1 μL를 추가합니다.
2. 30 초 동안 DNA 비즈를 와동시키고 각 샘플에 DNA 비즈 50 μL를 첨가한다. pipetting으로 철저히 섞어 준 다음, 2,000 xg에서 10 초 동안 짧게 돌립니다. 8 분 RT에서 튜브를 품어.
3. 튜브를 자기 분리 장치에 5 분 동안 놓습니다. 부드럽게 상청액을 위아래로 두 번 피펫 팅하고 샘플을 2 분 동안 앉게하십시오. 샘플이 자기 장치에있는 동안, 뜨는 물을 제거하고 버린다.
4. 각 샘플에 새로 만든 80 % EtOH 150 μL를 넣고 30 초 동안 RT에 놓습니다. EtOH를 제거하고 EtOH 세척을 한 번 반복하십시오.
5. 샘플을 잠시 회전시키고 1 분 동안 자기 분리기에 다시 올려 놓습니다. 남은 EtOH를 제거하고 샘플을 5 분 동안 공기 건조시킵니다.
6. 시료를 간헐적으로 점검하여 EtOH가 모아 지는지 확인하고 피펫으로 EtOH를 제거하십시오.
7. 구슬 펠렛이 더 이상 광택이 보이지는 않지만 균열이 나타나기 전에 자기 분리기에서 튜브를 꺼내고 용리 완충액 17 μL를 넣으십시오. 부드럽게 구슬을 완전히 resuspend 위아래로 피펫.
8. resuspended 샘플을 2 분 RT에서 품어.
9. 샘플을 간단히 회전시켜 바닥에있는 모든 액체를 모으고 2 분 동안 자기 분리기에 놓습니다. 15 mL의 깨끗한 상등액을 1.5 mL RNase-free tube에 옮기고 -20 ° C에 보관하십시오.
10. cDNA 1 μL를 사용하여 고감도 생체 분석기 칩으로 cDNA 라이브러리의 품질과 크기를 검사합니다. cDNA 라이브러리의 이상적인 크기는 0.3-2 Kb이며, 농도는 적어도 10 ng / μL입니다 ( 그림 2 ).
    참고 : 샘플 pr으로 진행하기 전에 알려진 마커의 발현을 확인하기 위해 샘플을 스크리닝하는 방법으로 PCR을 채택 할 수 있습니다eparation.

9. 농도 및 Tagment cDNA 결정 (20 분)

1. 시작하기 전에 분석 시약, 희석 버퍼 및 표준을 30 분 동안 실온으로 가져온다. 1 μL의 분석 시약과 199 μL의 희석 완충액이 포함 된 마스터 믹스를 반응마다 준비하십시오. 500 μL 분석 튜브에이 혼합물 199 μL를 나누어주십시오. 1 μL의 시료를 넣고 철저하게 혼합합니다.
2. 분주 한 190 μL의 마스터 믹스를 튜브 1 & 2에 넣습니다. 10 μL의 표준 1을 튜브 1에 넣고 10 μL의 표준 2를 튜브 2에 넣습니다. 모든 샘플 튜브와 표준 튜브를 5 초 동안 보텍스합니다. 3 분 동안 실온에서 배양한다.
3. 고감도 형광 측정기로 시료의 농도를 결정하십시오. "calculate stock solution"옵션을 선택하고 "1 μL"을 강조 표시하여 올바른 샘플 양을 입력했는지 확인하십시오. RNase-free H ₂ O에 최종 농도가 0.2 ng / μL가되도록 별도의 1.5 mL 튜브에 희석한다.
   노트:제조업 자의 지시에 따라 1ng / μL의 총 DNA로 시작해야한다고 제안되어 있지만, 우리는 더 작은 시작 량을 사용했으며이 개정안을 설명하기 위해 프로토콜을 조정했습니다.
4. 새로운 0.2 ML PCR 튜브에서 피펫 2.5 μL 버퍼 2. 총 250 PG에 대한 적절한 튜브에 cDNA의 1.25 μL를 추가합니다. 마지막으로, 혼합하기 위해 철저히 각 튜브와 피펫에 1.25 μL의 tagmentation 믹스를 추가하십시오; tagmentation mix 내의 transposase는 DNA를 짧은 가닥으로 절단하고 어댑터를 각 strand의 한쪽 끝으로 어닐링하여 나중에 sequencing instrument에서 사용할 수 있습니다.
   NOTE : tagmentation과 index coupling에 사용되는 볼륨은 제조자의 지시에 의해 제시된 양의 일부분이다. 이것은 시약의 보존을 허용 할뿐만 아니라 우리의 경험에서 일관되게 tagmented 샘플을 생산해 냈습니다.
5. 1 분 동안 싱크대에 microcentrifuge에 튜브를 원심 분리기.
6. 튜브 놓기다음과 같은 프로그램으로 예열 thermocycler에서 : 55 ° C 10 분 및 10 ° C에서 개최.
   참고 :이 부화의 길이는 제조사의 지침서에서 제안 된 5 분과는 반대로 10 분입니다.
7. 이 프로그램이 완료되면 즉시 튜브를 제거하고 각각에 tagmentation 중화 버퍼 1.25 μL를 추가합니다. 5 분 동안 RT에서 혼합하고 배양하기에 충분하게 피펫을 넣는다. transposase가 효소를 중화하고 반응을 멈출 때까지 활성 상태를 유지하므로이 단계를 즉시 완료하십시오.

인덱스 커플 링 및 정제 (1 시간)

참고 : 시작하기 전에 적어도 30 분 동안 DNA 비드 및 resuspension 버퍼를 RT로 가져 오십시오. 각 샘플에 사용할 색인을 결정하십시오.

참고 :이 색인은 시퀀싱 후 샘플 식별을 위해 조각난 DNA의 각 5 '및 3'말단에 부착됩니다. 2 명pairings은 함께 시퀀싱 될 수있는 샘플에 대해 동일합니다. 예를 들어 표본 1이 흰색 1과 오렌지 1 색인을 사용하면 표본 2는 흰색 1과 주황색 2 또는 흰색 2와 주황색 2를 사용해야하지만 동일한 색인 조합은 사용하지 않아야합니다. 이 키트에는 4 개의 별개의 흰색과 6 개의 별개의 오렌지 인덱스가 들어 있습니다. 가능한 모든 조합으로 최대 24 개의 샘플을 하나의 시퀀싱 레인에 저장할 수 있습니다. 우리는 일반적으로 차선에 10 개의 시료만을 채우지 만 24 개의 색인을 포함하는 키트를 사용할 수 있습니다. 원하는 경우 단일 레인의 순서대로 96 개의 시료를 풀링 할 수 있습니다.

1. 각 튜브에 특정 표본에 대해 1.25 μL의 왼쪽 색인과 1.25 μL의 오른쪽 색인을 추가하십시오. 3.75 μL의 PCR 마스터 믹스를 첨가하고 잘 혼합합니다.
2. 1 분 동안 싱크대 마이크로 원심 분리기에서 원심 분리기.
3. 다음 프로그램과 함께 예열 thermocycler에 튜브를 놓습니다 : 3 분 72 ° C; 95 ℃에서 30 초; 95 사이클 12 회76 ℃, 10 초 C, 30 초 50 ℃, 1 분 72 ℃; 72 ℃에서 5 분; 4 ℃에서 유지.
   참고 : 처음 95 ° C 단계가 제조업체의 지침에 따라 제안 된 98 ° C에서 변경되었습니다. 또한 사이클 세부 사항은 온도와 시간 길이가 샘플의 최적의 태그 지정을 허용하도록 조정되었습니다. 최종 72 ° C 배양도 우리의 프로토콜에 추가되었으며 제조 업체의 지침에 포함되지 않았습니다.
4. 튜브를 살짝 돌려서 내용물을 수집합니다. 30 초 동안 DNA beads를 휘젓고 각 튜브에 30 μL를 넣고 pipetting으로 철저히 섞는다.
5. 5 분 동안 RT에서 샘플을 품어.
6. 샘플을 자기 분리기에 2 분 동안 놓습니다. 상청액을 위 아래로 두 번 피펫 섞고 1 분 동안 표본을 부화시킨다.
7. 깨끗한 상층 액을 제거하고 버린다. 각 샘플에 80 % EtOH 150 μL를 넣고 뺍니다. EtOH 세척을 한 번 반복하십시오.
8. 허용샘플을 10 분 동안 공기 건조시켰다. EtOH가 튜브 바닥에 모아 졌는지 간헐적으로 확인하고 필요하면 제거하십시오.
9. 균열이 DNA 비드 펠렛에 나타나기 시작하면 자성 분리기에서 샘플을 꺼내어 27.5 μL의 resuspension buffer를 넣어 펠렛을 재 수화하십시오. 펠렛이 완전히 resuspended 있는지 확인하고 2 분 RT에서 품어.
   참고 : resuspension 버퍼에 사용 된 볼륨은 프로토콜에서 시작 물질의 작은 금액을 설명하기 위해 수정되었으며 제조 업체의 지침에 제안 볼륨과 다릅니다.
10. 2 분 동안 자기 분리기에 튜브를 놓습니다. 깨끗한 상등액 25 μL를 RNase-free tube에 옮기고 -20 ° C에서 보관하십시오.
    참고 : 라이브러리 정규화를 완료하려면 제조업체의 지침을 따르지 마십시오. 샘플은이 단계에 따라 성공적으로 준비되며 그대로 시퀀싱을 준비합니다.
11. 분석하기bioanalyzer 칩과 각 샘플 1 μL를 사용하여 샘플의 agmentation.
    참고 : 얼룩의 분석은 이전에 수행됩니다; 그러나 cDNA는 이제 0.2-1 Kb의 크기 범위에서 검출되어야합니다 ( 그림 3 ). 이 지점 아래의 얼룩은 샘플의 품질 저하를 나타내는 반면 큰 얼룩은 불완전한 태미 네이션을 나타냅니다.

11. 샘플 풀링 (10 분)

1. 고감도 형광 측정기로 초기에 tagmentation 샘플의 농도를 구하고 농도를 nM 단위로 결정하십시오.
   참고 :이 계산은 인터넷 변환 도구를 사용하여 계산할 수 있으며 생체 분석기 추적의 평균 단편 길이에 의존합니다. 평균 조각 길이를 결정하려면 각 샘플에 대한 추적을 개별적으로 관찰하고 평균 DNA 단편의 크기를 결정하십시오. 이것은 또한 스미어의 범위를 강조하고 th를 조사함으로써 생체 분석기 트레이스를 조사 할 때 계산 될 수있다프로그램에 의해 계산 된 몰 농도.
2. 풀이 같은 농도의 각 샘플을 포함하도록 샘플을 결합하십시오. 샘플을 희석하지 마십시오. 풀은 가장 농도가 낮은 시료와 같이 희석되어야하며 이상적으로는 적어도 15nM의 총 농도를 가져야합니다.
3. 시퀀싱하기 전에 풀링 된 샘플을 -20 ° C에 보관하십시오. 샘플을 풀 한 후 1 주 이내에 시퀀싱하는 것이 좋습니다. 하이 엔드 (HiSeq) 플랫폼으로 쌍방향 100 bp 시퀀싱을 수행합니다.

결과

세포 유형은 염료 주입에 따라 쉽게 분류됩니다.

그림 1 은 형광 추적 충전 전후의 GFP + RGC의 예를 보여줍니다. 이 세포는 유전자 변형 라인 ( 그림 1A )에서 GFP의 표현에 따라 확인되었습니다. 견고한 씰이이 셀의 소마 (soma) 위에 미세 팁의 인발 유리 전극으로 형성되었습니다. 아형을 특성화하기 위해, ?...

토론

우리의 프로토콜은 신속하고 사용하기 쉬운 가이드를 통해 표본에 거의 손상을주지 않으면 서 높은 수준의 서열 분석을 위해 확인 된 형태 학적 분류의 단일 세포를 준비하는 방법을 보여줍니다. 본 원고에서 본질적으로 감광성 망막 신경절 세포는 형태 학적으로 특성화되고 분리되고 RNA-Seq에 대해 준비된다. 망막 처리 도중 세포 응력이 발생할 수 있습니다. 이러한 이유로 우리는 4 시간 이상 사...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ames' Medium	Sigma Aldrich	A1420-10X1L
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S8875
K-gluconate	Spectrum Chemical	PO178
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758
Alexa Fluor 594 Hydrazide	Invitrogen	A10442
Collagenase	Worthington Biochemical	LS005273
Hyaluronidase	Worthington Biochemical	LS002592
Petri dish (35mm diameter)	Thermo Fisher Scientific	153066
Ophthalmologic scissors	Fine Science Tools	15000-00
#5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30
Microplate Shaker	Fisher Scientific	13-687-708
Glass Micropipette	Sutter	BF120-69-10
Micropipette Puller	Sutter		P-1000 horizontal pipette puller
1mL syringe	Fisher Scientific	14-823-2F
Flexible tubing	Fisher Scientific	14-171
TCL lysis buffer	Qiagen	1031576	Lysis Buffer 1
β-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148
RNase-Free Water	Qiagen	129112
0.2 ml PCR tubes	Eppendorf	30124359
Ethyl Alcohol, Pure	Sigma Aldrich	E7023	Ethanol
Analog Vortex Mixer	Thermo Fisher Scientific	02215365	Vortex
Mini Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	05-090-100
Agencourt RNAClean XP Beads	Beckman Coulter	A63987	RNA magnetic beads
MagnaBlot II Magnetic Separator	Promega	V8351	Magnetic stand
1.5 ml MCT Graduated Tubes	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
Smart-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit	Clontech	634888	Reagents for Reverse Transcription and PCR Amplification
10X Lysis Buffer			Lysis Buffer 2
5X Ultra Low First-Strand Buffer			Buffer 1
3' SMART-Seq CDS Primer II A			Primer II
SMART-Seq v4 Oligonucleotide			Oligonucleotide
SMARTScribe Rverse Transcriptase			Reverse Transcriptase
2X SeqAmp PCR Buffer			PCR Buffer
PCR Primer II A			PCR Primer
SeqAmp DNA Polymerase			DNA Polymerase
Mastercycler pro S	Eppendorf	950030020	Thermocycler
Agencourt AMPure XP Beads	Beckman Coulter	A63881	DNA magnetic beads
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939AA
HS Bioanalyzer Chips & Reagents	Agilent Technologies	5067-4626
Qubit HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	For the calculation of sample concentrations
Qubit Assay Tubes	Thermo Fisher Scientific	Q32856
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q32866
Nextera XT DNA Sample Preparation Kit	Illumina	FC-131-1024	Reagents for Tagmentation and Index Coupling
TD Buffer			Buffer 2
ATM			Tagmentation Mix
NT Buffer			Tagmentation Neutralizing Buffer
NPM			PCR Master Mix
Nextera XT Index Kit	Illumina	FC-131-1001	Indices for Tagmentation
N501			White 1
N502			White 2
N701			Orange 1
N702			Orange 2
HiSeq 2500	Illumina	SY-401-2501	For completing sequencing of samples