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Biology

यांत्रिक तनाव के जवाब में सेल सतह आसंजन Remodeling का विश्लेषण चुंबकीय मोतियों का उपयोग

Published: March 8th, 2017

DOI:

10.3791/55330

1Institute for Advanced Biosciences, Centre de recherche UGA - INSERM U1209 - CNRS UMR
* These authors contributed equally

कोशिका की सतह आसंजन, mechanotransduction में केंद्रीय हैं के रूप में वे यांत्रिक तनाव संचारित और संकेतन ऊतक homeostasis और विकास में शामिल रास्ते आरंभ करें। यहाँ, हम जैव रासायनिक मार्ग है कि तनाव के जवाब में सक्रिय कर रहे हैं विदारक, ligand लेपित चुंबकीय microbeads और आसंजन रिसेप्टर्स करने के लिए बल प्रयोग करने के लिए आवेदन एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे।

Mechanosensitive कोशिका की सतह आसंजन परिसरों कोशिकाओं वे अपने आसपास के यांत्रिक गुणों भावना के लिए अनुमति देते हैं। हाल के अध्ययनों से आसंजन स्थलों पर बल संवेदन अणुओं, और बल पर निर्भर प्रतिलेखन कारक है कि वंश विशेष जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने और प्ररूपी outputs ड्राइव दोनों की पहचान की है। हालांकि, जैव रासायनिक रास्ते में यांत्रिक तनाव परिवर्तित संकेतन नेटवर्क मायावी बनी हुई है। सिगनल कोशिका की सतह रिसेप्टर के लिए लागू यांत्रिक तनाव पर लगे हुए रास्ते का पता लगाने के लिए, superparamagnetic microbeads इस्तेमाल किया जा सकता है। यहाँ हम कोशिका की सतह आसंजन प्रोटीन के लिए बलों को लागू करने के लिए चुंबकीय मोतियों का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। इस दृष्टिकोण का प्रयोग, यह आसंजन ligand लिपटे मोतियों से जुड़ी परिसरों के चुंबकीय अलगाव द्वारा विभिन्न जैव रासायनिक दृष्टिकोण से न केवल बल पर निर्भर cytoplasmic संकेत दे रास्ते, लेकिन यह भी आसंजन remodeling जांच करने के लिए संभव है। इस प्रोटोकॉल ligand-सह की तैयारी भी शामिलपैदा superparamagnetic मोती, और के आवेदन जैव रासायनिक विश्लेषण के द्वारा पीछा तन्य बलों को परिभाषित। इसके अतिरिक्त, हम चाहते हैं कि तनाव इंटीग्रिन आधारित आसंजन के लिए आवेदन किया प्रदर्शन कर डेटा का एक प्रतिनिधि नमूने आसंजन remodeling से चलाता है और प्रोटीन tyrosine फोस्फोराइलेशन बदल प्रदान करते हैं।

Metazoa में, यांत्रिक तनाव इस तरह के प्रसार, भेदभाव और अस्तित्व 1, 2 के रूप में सेलुलर प्रक्रियाओं की एक बहुत बड़ी संख्या के विनियमन के माध्यम से ऊतक विकास और homeostasis निर्देशन। यांत्रिक तनाव बाह्य मैट्रिक्स से पैदा कर सकते हैं या पक्षपाती कोशिकाओं है, जो नमूना actomyosin सिकुड़ा मशीनरी है कि बाह्य मैट्रिक्स पर खींचती है और तनाव के प्रति संवेदनशील अणुओं के माध्यम से अपनी कठोरता जांच के माध्यम से अपने बाह्य वातावरण के द्वारा उत्पन्न की जा सकती है। तनाव के जवाब में, mechanosensitive आसंजन प्रोटीन गठनात्मक परिवर्तन है कि जटिल cascades संकेत ट्रिगर से गुजरना। बदले में, इन संकेत दे रास्ते कि बाह्य वातावरण के लि....

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1. Ligand संयुग्मन चुंबकीय मोती

नोट: Ligand विकार एक 2.8 माइक्रोन व्यास के साथ superparamagnetic Tosyl सक्रिय मनकों का उपयोग किया जाता है (शेयर समाधान एकाग्रता 10 8 मोती / एमएल, 30 मिलीग्राम मोती / एमएल)। निम्नलिखित प्रो?.......

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तकनीक के योजनाबद्ध चित्रा 1 ए में सचित्र है। ligand विकार के बाद, चुंबकीय मोती 20 मिनट के लिए कोशिकाओं के साथ incubated रहे हैं, और फिर एक स्थायी चुंबक समय के विभिन्न राशि के लिए 30-40 के बारे में पी.एन. की तन्यता बल.......

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विधि यहाँ वर्णित कोशिका की सतह आसंजन रिसेप्टर्स करने के लिए तनाव लागू करते हैं और उनके बाद शुद्धि की अनुमति के लिए एक स्पष्ट दृष्टिकोण का गठन किया। हालांकि, कुछ चरणों को पूरा करने के लिए कुशल आसंजन शुद?.......

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तटरक्षक एजेसीं राष्ट्रीय डी ला Recherche (ANR-13-JSV1-0008), यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम से (मैरी क्यूरी कैरियर एकता n˚8304162) से और यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) यूरोपीय संघ के क्षितिज के नीचे से अनुदान द्वारा समर्थित है 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम (ईआरसी शुरू अनुदान n˚639300)।

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NameCompanyCatalog NumberComments
Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish)K&J Magnetics, IncDX88-N52grade N52 dimension: 1 1/2" dia. x 1/2" thick
Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish)K&J Magnetics, IncD84PC-BLKgrade N42 dimension: 1/2" dia. x 1/4" thick Black Plastic Coated 
Dynabeads M280 TosylactivatedThermofisher14203superparamagnetic beads 
DynaMag-2 MagnetThermofisher12321D
Fibronectin Sigma-AldrichF1141-5MGFibronectin from bovine plasma
Poly-D-LysineSigma-AldrichP7280-5MG
Apo-TransferrinSigma-AldrichT1428-50MGBovine Apo-Transferrin
Bovine serum albuminSigma-AldrichA7906-500G
DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate Life Technologies31966-021DMEM+GlutaMAX-I 500 ml 
60*15 mm culture dishFalcon353004

  1. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. L. . Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  2. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (5), 308-319 (2011).
  3. Guilluy, C., et al. The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins. Nat Cell Biol. 13 (6), 722-727 (2011).
  4. Matthews, B. D., Overby, D. R., Mannix, R., Ingber, D. E. Cellular adaptation to mechanical stress: role of integrins, Rho, cytoskeletal tension and mechanosensitive ion channels. J Cell Sci. 119 (3), 508-518 (2006).
  5. Zhao, X. -. H., et al. Force activates smooth muscle alpha-actin promoter activity through the Rho signaling pathway. J Cell Sci. 120 (Pt 10), 1801-1809 (2007).
  6. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  7. Austen, K., Kluger, C., Freikamp, A., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. Generation and analysis of biosensors to measure mechanical forces within cells. Meth Mol Biol. 1066, 169-184 (2013).
  8. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  9. Pelham, R. J., Wang, Y. l. . Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci USA. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  10. Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
  11. Chaudhuri, O., Parekh, S. H., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Combined atomic force microscopy and side-view optical imaging for mechanical studies of cells. Nat Meth. 6 (5), 383-387 (2009).
  12. Bays, J. L., et al. Vinculin phosphorylation differentially regulates mechanotransduction at cell-cell and cell-matrix adhesions. J Cell Biol. 205 (2), 251-263 (2014).
  13. Collins, C., et al. Localized tensional forces on PECAM-1 elicit a global mechanotransduction response via the integrin-RhoA pathway. Curr Biol. 22 (22), 2087-2094 (2012).
  14. Gordon, W. R., et al. Mechanical Allostery: Evidence for a Force Requirement in the Proteolytic Activation of Notch. Dev Cell. 33 (6), 729-736 (2015).
  15. Lessey-Morillon, E. C., et al. The RhoA guanine nucleotide exchange factor, LARG, mediates ICAM-1-dependent mechanotransduction in endothelial cells to stimulate transendothelial migration. J Immunol. 192 (7), 3390-3398 (2014).
  16. Osborne, L. D., et al. TGF-β regulates LARG and GEF-H1 during EMT to affect stiffening response to force and cell invasion. Mol Biol Cell. 25 (22), 3528-3540 (2014).
  17. Scott, D. W., Tolbert, C. E., Burridge, K. Tension on JAM-A activates RhoA via GEF-H1 and p115 RhoGEF. Mol Biol Cell. 27 (9), 1420-1430 (2016).
  18. Glogauer, M., Ferrier, J., McCulloch, C. A. Magnetic fields applied to collagen-coated ferric oxide beads induce stretch-activated Ca2+ flux in fibroblasts. Am J Physiol - Cell Physiol. 269 (5), C1093-C1104 (1995).
  19. Glogauer, M., et al. Calcium ions and tyrosine phosphorylation interact coordinately with actin to regulate cytoprotective responses to stretching. J Cell Sci. 110 (Pt 1), 11-21 (1997).
  20. Kuo, J. -. C., Han, X., Hsiao, C. -. T., Yates, J. R., Waterman, C. M. Analysis of the myosin-II-responsive focal adhesion proteome reveals a role for β-Pix in negative regulation of focal adhesion maturation. Nat Cell Biol. 13 (4), 383-393 (2011).
  21. Schiller, H. B., et al. β1- and αv-class integrins cooperate to regulate myosin II during rigidity sensing of fibronectin-based microenvironments. Nat Cell Biol. 15 (6), 625-636 (2013).
  22. Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nat Cell Biol. 16 (4), 376-381 (2014).
  23. Plopper, G. E., McNamee, H. P., Dike, L. E., Bojanowski, K., Ingber, D. E. Convergence of integrin and growth factor receptor signaling pathways within the focal adhesion complex. Mol Biol Cell. 6 (10), 1349-1365 (1995).
  24. Roca-Cusachs, P., Gauthier, N. C., Del Rio, ., A, M. P., Sheetz, Clustering of alpha(5)beta(1) integrins determines adhesion strength whereas alpha(v)beta(3) and talin enable mechanotransduction. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (38), 16245-16250 (2009).
  25. Ajeian, J. N., et al. Proteomic analysis of integrin-associated complexes from mesenchymal stem cells. Proteomics Clin Appl. 10 (1), 51-57 (2016).
  26. Horton, E. R., Astudillo, P., Humphries, M. J., Humphries, J. D. Mechanosensitivity of integrin adhesion complexes: Role of the consensus adhesome. Exp Cell Res. , (2015).
  27. Jones, M. C., et al. Isolation of integrin-based adhesion complexes. Curr Protoc Cell Biol. 66, 9.8.1-9.8.15 (2015).
  28. Ng, D. H. J., Humphries, J. D., Byron, A., Millon-Frémillon, A., Humphries, M. J. Microtubule-dependent modulation of adhesion complex composition. PloS One. 9 (12), e115213 (2014).
  29. Byron, A., Humphries, J. D., Bass, M. D., Knight, D., Humphries, M. J. Proteomic analysis of integrin adhesion complexes. Sci Sign. 4 (167), pt2 (2011).
  30. Byron, A., Humphries, J. D., Craig, S. E., Knight, D., Humphries, M. J. Proteomic analysis of α4β1 integrin adhesion complexes reveals α-subunit-dependent protein recruitment. Proteomics. 12 (13), 2107-2114 (2012).
  31. Marjoram, R. J., Guilluy, C., Burridge, K. Using magnets and magnetic beads to dissect signaling pathways activated by mechanical tension applied to cells. Methods. , (2015).
  32. Pasapera, A. M., Schneider, I. C., Rericha, E., Schlaepfer, D. D., Waterman, C. M. Myosin II activity regulates vinculin recruitment to focal adhesions through FAK-mediated paxillin phosphorylation. J Cell Biol. 188 (6), 877-890 (2010).
  33. Sawada, Y., Sheetz, M. P. Force transduction by Triton cytoskeletons. J Cell Biol. 156 (4), 609-615 (2002).
  34. Grinnell, F., Geiger, B. Interaction of fibronectin-coated beads with attached and spread fibroblasts. Binding, phagocytosis, and cytoskeletal reorganization. Exp Cell Res. 162 (2), 449-461 (1986).
  35. Schroeder, F., Kinden, D. A. Measurement of phagocytosis using fluorescent latex beads. J Biochem Biophys Meth. 8 (1), 15-27 (1983).
  36. Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475 (7356), 316-323 (2011).
  37. Seo, D., et al. A Mechanogenetic Toolkit for Interrogating Cell Signaling in Space and Time. Cell. 165 (6), 1507-1518 (2016).

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