Analisando celular superfície de adesão remodelação em resposta à tensão mecânica usando pérolas magnéticas

aderências na superfície celular são centrais na mecanotransdução, como eles transmitem tensão mecânica e iniciar as vias de sinalização envolvidos na homeostase e desenvolvimento do tecido. Aqui, apresentamos um protocolo para dissecar as vias bioquímicas que são ativadas em resposta à tensão, utilizando microesferas magnéticas revestidas com ligando e aplicação de força para receptores de adesão.

complexos de adesão da superfície celular Mechanosensitive permitir que as células para detectar as propriedades mecânicas dos seus arredores. Estudos recentes identificaram duas moléculas de detecção de força em locais de adesão e fatores de transcrição dependente da força que regulam a expressão de genes específicos de linhagem e impulsionam resultados fenotípicos. No entanto, as redes de sinalização de conversão de tensão mecânica em vias bioquímicas têm permanecido elusivos. Para explorar as vias de sinalização envolvidos em cima aplicada a tensão mecânica receptor da superfície celular, micropérolas superparamagnéticas pode ser usado. Aqui é apresentado um protocolo para a utilização de contas magnéticas para aplicar forças de proteínas de adesão da superfície celular. Utilizando esta abordagem, é possível investigar não apenas as vias de sinalização citoplasmática dependente da força por várias abordagens bioquímicas, mas também pode ser notada aderência por isolamento magnético de complexos de adesão ligados às esferas revestidas com ligando. Este protocolo inclui a preparação do ligando-coesferas superparamagnéticas ciados, e a aplicação de definir forças de tração, seguido por análises bioquímicas. Além disso, nós fornecemos uma amostra representativa de dados que demonstram que a tensão aplicada a aderência à base de integrina desencadeia adesão remodelação e altera a fosforilação da tirosina de proteína.

Em metazoa, tensão mecânica dirige o desenvolvimento do tecido e da homeostase através da regulação de uma miríade de processos celulares, como a proliferação, diferenciação e sobrevivência ^{1, 2.} tensão mecânica pode surgir a partir da matriz extracelular ou podem ser gerados por células aderentes, que amostra o ambiente extracelular através da maquinaria contrátil actomiosina que puxa na matriz extracelular e as sondas a sua rigidez por meio de moléculas sensíveis à tensão. Em resposta à tensão, proteínas de adesão mechanosensitive sofrer alterações conformacionais que desencadeiam cascatas de sinalização co....

1. Conjugação de ligando a esferas magnéticas

Nota: a conjugação ligando é realizada utilizando pérolas activadas por tosilo superparamagnéticas com um diâmetro de 2,8 uM (concentração da solução de estoque 10 ⁸ esferas / mL, 30 mg de esferas / ml). O protocolo seguinte baseia-se amostras de cerca de 2 x 10 ⁵ células, que correspondem a MRC 5-células cultivadas a 80% de confluência numa placa de cultura de tecidos de 60 mm. Ajuste o volume de contas e reag.......

O esquema da técnica é ilustrada na figura 1a. Após a conjugação ligando, esferas magnéticas são incubados com as células durante 20 minutos, e, em seguida, um íman permanente é usada para aplicar forças de tracção de cerca de 30-40 NP para várias quantidades de tempo. A Figura 1b mostra 2,8 ^ M FN-esferas magnéticas revestidas com destino a receptores de adesão de células MRC5.

Os passos de lavagem de grânulos superparamagnéticas após li.......

O método aqui descrito constitui uma abordagem simples para aplicar a tensão de receptores de adesão da superfície celular e permitir a sua purificação posterior. No entanto, alguns passos são essenciais para realizar a purificação eficiente de adesão e optimização de potencial pode ser feito em função dos receptores de adesão segmentados. Nós apresentamos os possíveis problemas que o usuário pode encontrar abaixo.

Utilizou-se 2,8 um de diâmetro, mas as esferas magnéticas.......

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