Analysera cellytan Adhesion Remodeling som svar på mekaniska spänningar med användning av magnetiska pärlor

Cellytan sammanväxningar är centrala i mechanotransduction, eftersom de sänder mekanisk spänning och initiera de signalvägar som är involverade i vävnadshomeostas och utveckling. Här presenterar vi ett protokoll för att dissekera de biokemiska vägar som aktiveras som svar på spänning, med hjälp av ligand-belagda magnetiska mikropärlor och kraft ansökan till vidhäftningsreceptorer.

Mechanosensitive cellyte vidhäftningskomplex tillåter celler att känna av de mekaniska egenskaperna hos sin omgivning. Nyligen genomförda studier har identifierat både kraftkännande molekyler på vidhäftningsställen och kraftberoende transkriptionsfaktorer som reglerar härstamning specifika genuttryck och driver fenotypiska utgångar. Emellertid har signaleringsnätverk omvandlar mekanisk spänning i biokemiska vägar förblev svårfångade. För att utforska de signalvägar som deltar vid mekanisk spänning som anbringas till cellytereceptor, kan superparamagnetiska mikropärlor användas. Här presenterar vi ett protokoll för användning av magnetiska pärlor för att tillämpa krafter till cellytans vidhäftningsproteiner. Med hjälp av denna metod är det möjligt att undersöka inte bara kraftberoende cytoplasma signalvägar av olika biokemiska metoder, men också vidhäftnings ombyggnad av magnetisk isolering av vidhäftningskomplex bundna till ligand-belagda pärlor. Detta protokoll omfattar framställningen av ligand-cointresse- superparamagnetiska pärlor, och tillämpningen av definiera dragkrafter följt av biokemiska analyser. Dessutom ger vi ett representativt urval av uppgifter som visar att spänning appliceras på integrin-baserad adhesion utlöser vidhäftning ombyggnad och förändrar proteintyrosinfosforylering.

I metazoer riktar mekaniska spänningar vävnadsutveckling och homeostas genom reglering av en myriad av cellulära processer såsom proliferation, differentiering och överlevnad ^{1, 2.} Mekaniska spänningar kan uppstå från den extracellulära matrisen eller kan genereras av vidhäftande celler, vilket prov deras extracellulära miljön genom aktomyosin sammandragnings maskiner som drar till extracellulär matris och utför sin styvhet genom spänningskänsliga molekyler. Som svar på spänning, mechanosensitive vidhäftningsproteiner genomgå konformationsförändringar som utlöser komplexa signaleringskaskader. I sin tur dessa....

1. Ligand Konjugering till magnetiska pärlor

Notera: Ligand konjugering utförs med användning av superparamagnetiska tosyl-aktiverade pärlorna med en 2,8 ^ m diameter (stamlösningens koncentration 10 ⁸ pärlor / ml, 30 mg pärlor / ml). Följande protokoll är baserat på prover av approximativt 2 x 10 ⁵ celler, som motsvarar MRC-5-celler odlade till 80% sammanflytning i en 60 mm vävnadsodlingsplatta. Justera volymen av kulor och reagens i enlighet med om du använd.......

Den schematiska av teknik illustreras i figur 1a. Följande ligand konjugering, är magnetiska pärlor inkuberas med cellerna under 20 min, och sedan en permanentmagnet används för att applicera dragkrafter på ca 30-40 pN för olika tid. Figur 1b visar 2,8 fim FN-belagda magnetiska pärlor bundna till MRC5 celladhesionsreceptorer.

Tvättstegen av superparamagnetiska pärlor efter cellys är avgörande och bestämma graden av rening. Ett minimum av tre tv?.......

Den här beskrivna metoden utgör en okomplicerad metod för att anbringa spänning till cellytans vidhäftningsreceptorer och tillåta deras efterföljande rening. Men några steg är avgörande för att utföra en effektiv vidhäftning rening och potentiella optimering kan göras beroende på de riktade vidhäftningsreceptorer. Vi presenterar potentiella problem användaren kan stöta nedan.

Vi använde magnetiska pärlor 2,8 um diameter men större pärlor kan användas, såsom 4,5 um dia.......

CG stöds av bidrag från Agence National de la Recherche (ANR-13-JSV1-0008), från Europeiska unionens sjunde ramprogram (Marie Curie Karriär Integration n˚8304162) och från European Research Council (ERC) under EU: s Horizon 2020 forsknings- och innovationsprogram (ERC Starting Grant n˚639300).