Golgi-Cox Yöntemiyle Kalın Beyin Bölümler içinde Görüntüleme Nöronlar

Özet

Biz bir doku örnekleri içinde bulunan uzun dendritik ağaçlar nöronlar görselleştirmek amacıyla, kalın beyin bölümlerinde, Golgi-Cox boyama yöntemi kullanılarak bir protokol mevcut. Bu protokolün iki varyantları da cresyl menekşe karşıtboyama ve uzun süreli depolama için işlenmemiş beyinleri dondurulmasını içerdiğini sunulmaktadır.

Özet

nöron boyama Golgi-Cox yöntemi histolojik beyin numuneleri içinde nöron morfolojisi anlayışımızı ilerletmek için fazla iki yüz yıldan kullanılmıştır. tam olarak tek bir bölüm içinde bulunan lekeli nöronların tanımlama olasılığını arttırmak amacıyla, mümkün olan en büyük kalınlıkta beyin kesitler hazırlamak için pratik bir bakış açısından tercih edilir olsa da, bu yaklaşım, yüksek çalışma mesafesi ile teknik açıdan sınırlıdır -magnification mikroskop amaçları. Burada 500 um kalınlığında kesilir fare beyin bölümlerinde, Golgi-Cox yöntemiyle nöronlar leke ve yüksek çözünürlüklü 30X 1.05 NA silikon ile donatılmış dik bir mikroskop kullanarak bu bölümlerin derinliği boyunca nöronlar görselleştirmek için bir protokol rapor 800 um çalışma mesafesine sahip yağ daldırma objektif. Ayrıca yüzeyini counterstain için kullanılabilir bu protokolün iki faydalı varyantları raporkresil violet Nissl leke beyin bölümleri monte edilebilir veya önceden kesit ve son işlem uzun süreli depolama için bütün beyin dondurma. Ana protokolü ve iki varyantları, tam nöron dendritik ağaçları ve dendrit dikenleri güvenilir görüntülenmiştir ve sayısal edilebilen boyunca lekeli kalın beyin bölümleri üretir.

Giriş

Doku örnekleri içindeki tek tek nöronların görselleştirme beynin anlaşılmasını önemli ölçüde ve endojen hastalık veya eksojen çevresel faktörlerden etkilenebilir nasıl nöron morfolojik özelliklerinin yerinde analizi için izin verir. Golgi Cox boyama yöntemi beyin içindeki nöronların rasgele örnek boyama bir düşük maliyetli, nispeten basit bir yöntemdir. İlk 1800'lerde Golgi ¹ tarafından geliştirilen ve Cox ² modifiye araştırmacılar ^ayrıca, görselleştirmek ve dendritik bitkilerin morfolojik ve omurga yoğunluğu ^{3, 4,} hem ölçmek için kullanılabilecek net, iyi boyanmış nöronlar üretmek için yılda bu tekniği rafine ^{5, 6, 7, 8, 9}.

beyin bölümlerinde boyanan nöronların görüntülenmesi için önemli bir teknik göz mevcut olan, yüksek büyütme / yüksek çözünürlüklü mikroskop hedeflerin çalışma mesafesi ile sınırlıdır, maksimum kesit kalınlığı vardır. 60 ortak yağ daldırma amaçlar - 100X mükemmel çözünürlük temin aralığı, fakat tipik olarak 200 um daha büyük olan çalışma mesafesi ile sınırlıdır. 200 um aralığında kesilmiş beyin kesitleri serebral korteks ^10, CA1 bölgesindeki ^{11, 12,} piramidal nöronlar sığ tabakalarda, örneğin piramit nöronlar için bu dilim kalınlığı içinde ihtiva edilebilir bazı nöron türleri, görselleştirmek için yeterli olabilir hipokampus ¹⁵ dentat girus hipokampus ^{13, 14,} ve granül hücreleri. Nispeten uzun olan NöronlarBu tür beyinler bütün dendrit ağaç içeren bir mükemmel bir açıyla kesitli olması gerekir, çünkü hücre gövdesi ¹⁶ 'den fazla 800 um uzanabilir fare için, daha büyük bir meydan okuma sağlayan serebral korteksin derin katmanlannda içinde piramidal nöronlar gibi dendritik ağaçlar, 200 um dilimleri içinde. dendrit ya da dallarından herhangi rostral veya kaudal yönde uzanan, bu da mümkün olmayabilir. Birden çok bitişik beyin bölümleri arasında bir nöron takip ederek bu sınırlamayı ele almak mümkün olsa da, bu yaklaşım ¹⁷ izleme için doğru bölümlerini ayarlamak önemli bir teknik sorun tanıtır. Daha pratik bir yaklaşım, daha büyük bir kalınlıkta kesilir beyin kesitleri içinde bulunan tüm nöronlar görselleştirmek için olacaktır.

Golgi Cox yöntemi kullanılarak farelerin 500 um kalınlığında beyin bölümleri ve bunların mo görselleştirmek için - Burada 400 içindeki nöronlar leke bir teknik raporrphology 800 um çalışma mesafesine sahip bir yüksek çözünürlüklü silikon yağ daldırma objektif kullanarak. Bizim tarif Golgi Cox emdirme ve işleme protokol literatürde ^6'da en çok atıf modern protokoller birinden modifiye edilir. Kalın beyin kesitleri ile Yaklaşımımız tam bölüm içinde yer alan herhangi bir tipte nöronları belirlenmesi ihtimalini arttırmaya yönelik bir avantaj sağlar. Ana protokole ek olarak, aynı zamanda eşsiz yararlar sağlar, bu iki varyasyon: sırayla monte kesitlerin yüzeyi üzerinde kresil menekşe karşıt (1) Golgi Cox boyama beyin bölgelerinin sınırları tayin ve tabakalarını tanımlamak için kesit ve son işlem öncesi emdirilmiş tüm beyinlerinden uzun süreli depolama için bir ara dondurma adımı ile serebral korteks, ve (2) Golgi Cox boyama.

Protokol

Yetişkin dişi CD1-türü fare Bu çalışmada kullanıldı. Benzer boyama çeşitli yaşlarda her iki cinsiyeti kullanılarak gerçekleştirilebilir. Deney hayvanları ilke ve Hayvan Bakımı Kanada Konseyi kurallarına uygun olarak bakıldı ve deneysel protokol Guelph Hayvan Bakım Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Golgi Cox Boyama

1. Beyinlerin Golgi-Cox Emprenye
   1. ayrı ayrı, yüksek kaliteli su içine potasyum dikromat ve potasyum kromat eritilerek% 1 Golgi-Cox çözeltisi (ağırlık / hacim) potasyum dikromat,% 0.8 (ağırlık / hacim) potasyum kromat ve% 1 (ağırlık / hacim) cıva klorür yapmak . Çözeltiler karıştırın cıva klorür ekleyin ve sınıf 1 filtre kağıdı kullanılarak nihai çözelti filtre. en fazla bir ay süreyle karanlıkta çözüm saklayın.
   2. % 5 izofluran kullanılarak fare anestezisi.
   3. kafaları kesilmek suretiyle fare Euthanize ve hızlı bir şekilde beyin kaldırmak.
   4. Golgi Cox çözeltisi 17 mL içeren 20 mL'lik bir cam sintilasyon şişesi içine beyin yerleştirin ve 25 gün süreyle oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edilir.
   5. 24 saat boyunca 4 ° C'de karanlıkta (0.1 M fosfat tampon maddesi, pH 7.4 içinde / hacim) sukroz (% 30) sükroz, dondurarak saklama 40 mL içeren 50 ml konik bir tüp içine yerleştirerek beyin cryoprotect.
      NOT: Aşağıdaki isteğe bağlı üç adım, uzun süreli depolama için bu aşamada beyin dondurmak amacıyla, ana protokol için bir alternatif olarak kullanılabilir.
   6. kuru buz üzerinde soğutulmuş olan 200 ml izopentan içine daldırarak tüm beyin dondurun.
   7. -80 ° C'de karanlıkta, 50 ml konik bir tüp ve deposuna dondurulmuş beyin yerleştirin.
   8. Hazır devam etmek için zaman, 24 saat boyunca 4 ° C'de karanlıkta sükroz dondurarak saklama koruyucusunun 40 mL içeren 50 ml konik bir tüp içine yerleştirerek beyin Çözülme.
2. Beyin Kesit
   1. sükroz ve bloktan beyin çıkarınBir ustura kullanılarak beyincik keserek ve beynin kalan kuyruk ucunda düz bir kenar bırakarak kesit için k.
   2. Isı agar (% 3 (w / v) su içinde) eritilmiş ve erime noktasının biraz üzerinde olduğu kadar soğuması kadar.
   3. onun kaudal ucu aşağı bakacak şekilde, küçük bir tek kullanımlık tartmak çanak içinde beyin yerleştirin ve beyin kapsayacak şekilde erimiş agar yeterli miktarda ekleyin.
   4. Agar katılaşmasından sonra, yaklaşık 2 ayrılan fazla agar Döşeme - beyni çevreleyen, 4 mm ve etil siyanoakrilat yapıştırıcı bir miktar kullanarak kuyruk tarafındaki ucu aşağı bakacak şekilde, bir vibratome aşamasına beyin tutkal.
   5. 400 bir dilim kalınlığında beyin ve bölüm beyin kapsayacak şekilde sükroz dondurarak saklama koruyucusunun yeterli bir miktarı ile vibratome sahne alanı doldurmak - 86 Hz'lik bir titreşim frekansı kullanılarak (incelenecek olan beyin bölgesine bağlı olarak) 500 um ve 0,125 mm / s bir bıçak ilerleme hızı.
   6. küçük bir boya fırçası kullanarak, Ticari olarak temin edilebilen ağ alt uçlar ihtiva eden bir 6-yuvalı doku kültür plakasının bir kuyuya yer beyin kesitleri önceden doldurulmuş 6 10 mL% 0.1 M fosfat tamponu, pH 7.4 (w / v) sakaroz ile.
   7. 4 ° de CO / N karanlıkta bölümleri inkübe edin.
3. Beyin Bölümler Gelişmekte
   1. ağ-alt uçlar kullanılarak, 0.1 M fosfat tamponu, pH 7.4 içinde içinde% 2 5 mL paraformaldehid (w / v) (PBD) içeren yeni içine beyin bölümleri aktarın. 15 dakika süre ile karanlıkta, oda sıcaklığında yavaş bir hızda hareket eden bir rocker üzerinde inkübe edin.
   2. 5 mL su ihtiva eden yeni gözlere aktarılması iki kez bölümleri yıkayın. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta bir orta hızda hareket eden bir rocker yıkayın.
   3. % 2.7 (h / h) amonyum hidroksit, 5 ml ihtiva eden yeni bir kuyu içine aktarın bölümleri. 15 dakika süre ile karanlıkta, oda sıcaklığında yavaş bir hızda hareket eden bir rocker üzerinde inkübe edin.
   4. 5 mL su ihtiva eden yeni gözlere aktarılması iki kez bölümleri yıkayın. o yıkayın5 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta bir orta hızda hareket na külbütör.
   5. Iyi Sabitleme A'nın 5 mL içeren yeni içine aktarın bölümler orjinal satın konsantrasyona su 10x içinde seyreltilmiş olduğunu (Malzeme Tablo). 25 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta yavaş bir hızda hareket eden bir rocker üzerinde inkübe edin.
   6. 5 mL su ihtiva eden yeni gözlere aktarılması iki kez bölümleri yıkayın. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta bir orta hızda hareket eden bir rocker yıkayın.
4. Beyin Bölümler Montaj
   1. Küçük bir boya fırçası kullanarak, mikroskop lamı üzerine bölümleri monte. fazla suyu çıkarın ve cımbız ve küçük bir doku kullanılarak agar. Tüm Agar dehidratasyon devam etmeden önce kaldırılmış olduğundan emin olun.
   2. yaklaşık 45 dakika boyunca (400 um'lik kesitler) ya da 90 dakika (500 um bölümler), oda sıcaklığında hava içinde kurumasına bölümleri izin verin.
      Not: kuruyana zamanlaması ve uygun seviye kritiktir ve her tespit edilmesi gerekebilirLaboratuar ortam sıcaklığı ve nem miktarına göre değişir. Çok kısa bir kurutma süresi müteakip dehidrasyon adımları sırasında slaytların düşme bölümlere yol açar ve çok uzun bir kurutma süresi çatlama bölümlere yol açar. Bölümler hala kuruluk uygun düzeyde parlak olmasını görünecektir.
   3. belirtildiği gibi Coplin boyama kavanoz içine slaytlar koyarak, kresil moru ile Leke bölümleri.
      NOT: Bu isteğe bağlı adım kresil moru ile nöronal çekirdekleri leke amacıyla, dondurulmuş asla bölümler için kullanılabilir. Biz temizlenmesi ve kresil menekşe inkübasyon öncesi bölümler cildimizi hatta boyama ve bölümleri arasında düşük arka plan yol bulduk.
      1. 5 dakika boyunca madde temizleme yerleştirin. bir kez tekrarlayın.
      2. 5 dakika boyunca% 100 etanol içinde yerleştirin. bir kez tekrarlayın.
      3. su içinde, daha sonra su içinde% 95 etanol içinde% 75 etanol yerleştirin ve 2 dakika her biri için daha sonra su içerisinde% 50 etanol.
      4. 5 dakika su içinde yerleştirin.
      5. % 0.5 koyun CRE (w / v)7 dakika su içinde Syl mor.
      6. 2 dakika için su içinde yerleştirin. bir kez tekrarlayın.
   4. belirtildiği gibi Coplin boyama kavanoz içine slaytlar koyarak bölümleri kurutmak.
      1. su içinde, daha sonra su içinde% 50 etanol içinde% 75 etanol yerleştirin ve 2 dakika her biri için daha sonra su içerisinde% 95 etanol.
      2. 5 dakika boyunca% 100 etanol içinde yerleştirin. bir kez tekrarlayın.
      3. 5 dakika boyunca madde temizleme yerleştirin. bir kez tekrarlayın.
         NOT: Bu dehidratasyon ve takas süreleri Bu yazıda anlatılan şekilde fare beyinleri işlemek için yeterlidir. Bununla birlikte, son temizleme aşaması 15 dakika toplam kadar uzatılabilir gerekebilir, sıçan ve inek kuşu dahil olmak üzere diğer türler için gözlenmiştir.
   5. susuz bir montaj ortamı kullanılarak Lamel bölümleri.
   6. slaytlar en az 5 gün süreyle karanlıkta oda sıcaklığında yatay kurumaya bırakın.

Kalın Beyin Bölümler içinde 2. Görüntüleme Vitray Nöronlar

1. Görüntü Yığınları yakalama
   1. Mikroskop ampul, kamera ve sahne kontrolörü açın.
   2. Mikroskop yazılımı (örneğin Neurolucida) açın.
   3. Mikroskop sahnede bir slayt yerleştirin.
   4. Bu tür 1.25x 0.4 NA PlanAPO veya 4X 0.16 NA gibi düşük büyütme objektif kullanarak beyin kesitinin bir 2D geniş açılı görüntü yakalama
      1. Görüntüyü odaklayın ve maruz kalma süresi ve beyaz dengesi gibi kamera ayarlarını yapın.
      2. bölümünde herhangi bir yerinde sol tıklayarak bir referans noktası oluştur
      3. görüntü elde etme penceresinde "tek görüntü elde" seçerek görüntüyü yakalama.
   5. 10X 0.3 NA UPlan FL, N objektif kullanılarak, ilgi konusu nöronlar (ler) i ihtiva eden alanın orta çözünürlükte görüntü yığınları çeker.
      1. Görüntüyü odaklayın ve maruz kalma ve beyaz dengesi gibi kamera ayarlarını yapın.
      2. Bölüm A üstüne odaklanarak görüntü yığını için üst ve alt sınırları ayarlamand seçerek görüntü elde etme penceresinde "yığının en üstüne" yanında, sonra da bölümün altına odaklama ve görüntü elde etme penceresi içinde yanında "alt yığının" "set" seçerek "set".
      3. görüntü elde etme penceresinde "görüntü arasındaki mesafeye" nın yanındaki "5 mikron" girerek 5 um adım uzaklığını ayarlayın.
      4. görüntü elde etme penceresinde "acquire görüntü yığınını" seçerek görüntü yığını yakalama.
      5. Tüm görüntü yığınları X ve Y eksenlerinde en az% 10 üst üste emin, ilgi konusu tüm alanı yakalamak için yukarıdaki adımları tekrarlayın.
   6. bir 30X 1.05 NA silikon yağ daldırma objektif kullanarak, ilgi konusu nöron içeren bölgenin yüksek çözünürlüklü görüntü yığınları çeker.
      1. objektif ve oi ile ilişki kurmak için sağlanması, sürgünün silikon immersiyon 4 damla ve slayt üzerinde amacı yer - 3 uygulal.
      2. Görüntüyü odaklayın ve maruz kalma ve beyaz dengesi gibi kamera ayarlarını yapın.
      3. bölümün üstüne odaklanan ve "set" seçerek görüntü yığını için üst ve alt sınırları ayarlayın sonraki ardından görüntü elde etme penceresi içinde ve "yığının üst" bölümünün altına odaklama ve seçmenin "set" görüntü elde etme penceresinde "yığının altında" yanında yer almaktadır.
      4. görüntü elde etme penceresinde "görüntü arasındaki mesafeye" nın yanındaki "1 mikron" girerek 1 um adım uzaklığını ayarlayın.
      5. görüntü elde etme penceresinde "acquire görüntü yığınını" seçerek görüntü yığını yakalama.
      6. Tüm görüntü yığınları X ve Y eksenlerinde en az% 10 üst üste emin, ilgi konusu tüm alanı yakalamak için yukarıdaki adımları tekrarlayın.
   7. veri dosyasını kaydedin ve dış işleme için TIFF formatında tüm resim dosyalarını kaydedin.
2. Z-projeksiyon Görüntüleri ve Görüntü Montajları Oluşturma
   1. ImageJ Z-projeksiyon görüntüler oluşturun
      1. Biyo-Biçimleri eklentisi yüklü olan Açık ImageJ yazılımı.
      2. "Plugins" Seç -> "Biyo-Biçimleri" -> "Biyo-Biçimleri İthalatçı".
      3. Görüntü yığını dosyasını seçin açılacak.
      4. > "Tür" - -> "RGB Renk" dosya açıldığında, "Resim" i seçerek RGB'ye biçimini değiştirmek.
      5. "Image" seçeneğini seçerek Z-projeksiyon oluşturma -> "Yığınlar" -> "Z Projesi ...".
      6. TIFF dosyası olarak iki boyutlu Z-projeksiyon görüntüsünü kaydedin.
   2. bütün ilgilendiren alanın iki boyutlu görüntü montaj oluşturun.
      1. (Örneğin, Adobe Photoshop) yazılımını açın.
      2. "Dosya" seçin -> "Otomatik" -> "Photomerge".
      3. Seç "Gözat" ve sonra tüm imag eklemekes dosyalar birleştirilecek.
      4. "Birlikte Görüntüleri Blend" seçilirse ve ardından "Tamam" seçeneğini emin olun.
      5. TIFF dosyası olarak ilgilenilen bölgenin tamamını çıkan montaj görüntüsünü kaydedin.

Sonuçlar

500 um kalınlığında beyin kesitleri - Bu Golgi Cox boyama protokolü ve iki tarif edilen isteğe bağlı varyantları 400 içindeki tek tek nöronlar görselleştirmek için kullanılabilmektedir. 10X objektif ve Z ekseninde 5 um adımlar kullanılarak çekilen iki boyutlu Z çıkıntıların Örnek görüntü montajları, Şekil 1 'de gösterilmiştir: A1 - ön singulat kortekste alanı 1 ve şunları içerir koronal beyin kesitleri büyük bir alan için

Tartışmalar

Biz kalın beyin bölümlerinde nöronların görselleştirilmesi için burada Golgi-Cox boyama protokolü iki yararlı varyantları ile birlikte açıklar. Temsili Sonuçlar gösterildiği gibi, uzun bir 800 mikron çalışma mesafesine sahip yüksek çözünürlüklü hedefi kullanımı 500 um kesilerek beyin bölümlerinin derinliği boyunca tüm nöronların güvenilir olarak gösterebilir. nispeten kalın beyin kesitlerinin Bu çalışma, her tür lekeli nöronlar olarak uzun ve karmaşık apikal dendrit ağaçlar ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
potassium dichromate	Fisher Scientific	P188-100	Hazardous
potassium chromate	Fisher Scientific	P220-100	Hazardous
mercuric chloride	Fisher Scientific	S25423	Hazardous
Whatman grade 1 filter paper	Fisher Scientific	1001-185
isoflurane	Pharmaceutical Partners of Canada	CP0406V2
20 mL scintillation vial	Fisher Scientific	03-337-4
sucrose	Bioshop Canada	SUC700.1
sodium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	S5011-500G
sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	S9390-500G
50 mL conical tube	Fisher Scientific	12-565-271
isopentane	Fisher Scientific	AC126470010	Also known as 2-methylbutane; hazardous
agar	Sigma Aldrich	A1296-100G
small weigh dish	Fisher Scientific	02-202-100
vibratome	Leica	VT1000 S
6-well tissue culture plates	Fisher Scientific	08-772-1b
mesh bottom tissue culture inserts	Fisher Scientific	07-200-214
paraformadelhyde (PFA), 16%	Electron Microscope Sciences	15710-S	Hazardous
ammonium hydroxide	Fisher Scientific	A669S-500	Hazardous
Kodak Fixative A	Sigma Aldrich	P7542
superfrost plus slides	Fisher Scientific	12-550-15
CitroSolv clearing agent	Fisher Scientific	22-143-975
anhydrous ethyl alcohol	Commercial Alcohols	N/A
cresyl violet	Sigma Aldrich	C1791
permount	Fisher Scientific	SP15-100
upright microscope	Olympus	BX53 model
colour camera, 12 bit	MBF Biosciences	DV-47d	QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12
3D motorized microscope stage, controller and enoders	MBF Biosciences	N/A	Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences
4X microscope objective	Olympus	4x 0.16 N.A. UplanSApo
10X microscope objective	Olympus	10x 0.3 N.A. UPlan FL N
30X microscope objective	Olympus	30x 1.05 N.A. UPlanSApo
60X microscope objective	Olympus	60x 1.42 N.A. PlanAPO N
silicone immersion oil	Olympus	Z-81114
Neurolucida software	MBF Biosciences	Version 10
ImageJ software	U. S. National Institutes of Health	Current version	With the OME Bio-Formats plugin installed
Photoshop software	Adobe	version CS6