Belichtung des Schweins CNS für die histologische Analyse: Ein Handbuch für Enthauptung, Schädel öffnen und Gehirn Removal

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Papier und Lehr-Video ist zu beschreiben, wie die Obduktion Schweinehirn und Hypophyse in einem intakten Zustand, geeignet für die anschließende makroskopische und histologische Analyse belichten und zu entfernen.

Zusammenfassung

Schweine haben in Großtier translationalen neurowissenschaftlichen Forschung als wirtschaftlich und ethisch möglich Ersatz für nichtmenschliche Primaten immer beliebter geworden. Die große Größe des Gehirn des Schweins ermöglicht die Verwendung von herkömmlich klinischem Gehirn Imager und der direkten Nutzung und Prüfung von neurochirurgischen Verfahren und Geräten aus der menschlichen Klinik. Weitere makroskopische und histologische Analyse erfordert jedoch postmortem Exposition des Schweins Zentralnervensystem (ZNS) und die anschließende Entfernung des Gehirns. Dies ist keine einfache Aufgabe, da das Schwein CNS durch einen dicken, knöchernen Schädels und der Wirbelsäule eingekapselt ist. Das Ziel dieses Papier und Lehr-Video ist zu beschreiben, wie die Obduktion Schweinehirn und die Hypophyse in einem intakten Zustand, geeignet für die anschließende makroskopische und histologische Analyse belichten und zu entfernen.

Einleitung

Translationale Neurowissenschaften Studien bei Schweinen immer beliebter in den letzten zwei Jahrzehnten worden. Die große Größe des Schweinehirns ermöglicht die Verwendung von herkömmlich klinischen brain Imager und der unmittelbaren Nutzung und Prüfung von neurochirurgischen Verfahren und Geräten aus der menschlichen Klinik ^{1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8.} In den letzten 20 Jahren, Schweine, insbesondere Minipigs (zB minipig Göttingen), wurden verwendet , neuromodulatorischen Behandlungsmodalitäten, wie beispielsweise Stammzelltransplantation zu untersuchen; viraler Vektor Transfektion; und tiefe Hirnstimulation gerichtet gegen Parkinson - Krankheit, Übergewicht, Depression und Alzheimer Krankheit ^{2, 6,}= "Xref"> ^{9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17.} Dies wurde durch die Entwicklung von Stereotaxierahmen und chirurgische Ansätze folgte dem minipig CNS ^{3, 18, 19, 20, 21} zu manipulieren. Die eingeleiteten CNS Veränderungen in lebenden Tieren unter Verwendung von brain imaging (PET ^{10, 13, 22, 24} und MR ^23), Zystometrie ^{11, 12, 25,} Ganganalyse evaluiert^17, neurologische Bewertung ^{9, 17} und Obduktion basierend auf der Histologie und stereologischen Analyse ^{14, 15, 17, 26, 27, 31.} Jedoch erfordert postmortale Analyse die Belichtung und die Entfernung des Schweinehirns, das keine leichte Aufgabe ist, als ein dicker, knöcherner Schädel und ein faseriger dural das Schweinehirn abdeckt umgeben.

Das Ziel dieses Papiers und Lehr-Video ist zu beschreiben, wie die Obduktion Schweinehirn und Hypophyse können unter Verwendung von nicht-motorisierte chirurgische Instrumente in 15-20 min in einem intakten Zustand belichtet und entfernt werden. Das Lehr-Video und fotografische Abbildungen zeigen männlich minipigs (Alter: 6 Monate, Körpergewicht: 20-25 kg) für eine anatomische Studie über die minipig Hypophyse verwendet.

Protokoll

Tier Anästhesie und euthanesia wurden gemäß „Principles of Labortierhaltung“ (NIH Publikation Nr 86-23, überarbeitet 1985) und genehmigt vom dänischen Rat für Tierforschung Ethik durchgeführt.

1. Instrumente

1. Sammeln Sie die Instrumente in dem Video dargestellt und in der Tabelle der Materialien aufgeführt.

2. Enthauptung

HINWEIS: Die Anästhesie wurde durch eine intramuskuläre Injektion von 5 ml Midazolam (5 mg / ml) und 5 ml Ketamin (25 mg / ml) induziert. 5-10 min später, als das Tier sediert tief war, wurde eine kanülierte Ohrvene und eine letale Überdosis (100 mg / kg Körpergewicht) von Natriumpentobarbital (200 mg / ml) wurde intravenös verabreicht. Um sicherzustellen , dass das Tier vollständig eingeschläfert wurde, wurde der Kammschmerzreflex , wie durch Ettrup et al getestet. (2011) ^20. Komplette Euthanasie wurde wie beschrieben gewährleistet inDie Ethik - Aussage über und durch eine transkardialer Perfusion mit 5 l isotonischer Kochsalzlösung folgte, wie von Ettrup et al. (2011) ^20. Alle zeigten Verfahren sind Obduktion durchgeführt, Ausschließen der Notwendigkeit, dass die Wohlfahrtsmaßnahmen notwendig für die Langzeit Anästhesie und postprocedural Überleben.

1. Köpft das Schwein durch einen hohen Kreis cervikale Inzision, ein chirurgisches Skalpell, direkt unterhalb dem Unterkieferwinkel (1A).
2. Immer noch mit dem chirurgischen Skalpell, weiterhin die Inzision ventral durch das weiche Gewebe des Halses einschließlich dem Larynx und die Speiseröhre, bis die knöcherne Wirbelsäule erreicht ist, etwa auf der Höhe des kraniozervikalen Übergangs.
3. Voraus, um den Schnitt mit einem Chirurgisches Skalpell aus der vorderen Seite des kraniozervikalen Übergangs über dem anterioren Bogen von Atlas, und durch das vordere atlanto Membran, um dadurch den Spinalkanal Belichtungs- und das Rückenmark (1B). Gleichzeitig einen Assistenten bitten, den Schweinekörper vom Schwein Kopf zu ziehen, den Zugang zwischen der Schädelbasis und dem ersten Halswirbel zu erleichtern.
4. Weiterhin den chirurgischen Schnitt durch den Duralsack und dem Rückenmark (1B). Besondere Vorsicht, um sicherzustellen, dass ein vollständiger Querschnitt des Rückenmarks erreicht wird.
   HINWEIS: Bei Nichtbeachtung des vorhergehenden Schritt durchzuführen, in unerwünschtem Zuge auf das Rückenmark und Gehirn während der folgenden Schritte des Prozesses Dekapitation führen.
5. Zwangsweise erweitert den cranocervical Übergang an der Abschnittsebene (1C). Zur gleichen Zeit, verwenden, um das chirurgische Skalpell Abschnitt die restlichen Bänder atlanto das Gelenk zwischen dem Condylus occipitalis zu lösen und dem oberen artikulierten Prozess des Atlas. Trennt den Schweinekopf aus dem Körper.

Abbildung 1: Minipig Enthaupten. (A) Halsschnitt (Pfeil, Kieferwinkel). (B) durch die Incision atlanto Bänder und die Dura-Rückenmark umgibt (SC) an dem kraniozervikalen Übergang (C1, anteriore Bogen von Atlas; OC, occipitalen Kondylen). (C) Der hintere Teil des Gelenkes atlanto wird durch eine kraftvolle Erweiterung (Pfeile) auf der Abschnittsebene freigegeben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

3. Schädelöffnung

1. Positionieren Sie den Schweinekopf auf einem Tisch.
2. Führte einen dorsalen Längsinzision mit einem chirurgischen Skalpell durch die Haut und das darunterliegende Weichgewebe von der Rückseite des Mauls, über den Scheitel des Kopfes, und nach unten durch den hinteren Teildie Okzipitalregion.
3. Belichten des dorsalen und posterioren Teil des Schädels durch das Weichgewebe zu entfernen, um den anfänglichen Einschnitt mit einem chirurgischen Skalpell entfernt lateral.
4. Lassen Sie den Schläfenmuskel bilateral aus dem Schädel (2A) mit einem chirurgischen Skalpell. Stellen Sie sicher, dass der hintere Hinterhauptsbein ist aus weichem Gewebe gereinigt.
5. Verwenden Sie die posterior Eingang des Foramen Magnum okzipitalen Knochen mit einem Kerrison Knochenstanze und Knochen Rongeurs belichten und die Dura-bedeckten Cerebellum (2B) zu entfernen.
6. Kehrt zu der freiliegenden vorderen Seite des Schädels und wählen einen Eintrittspunkt in dem Stirnbein, direkt vor den Augen. An diesem Punkt wird eine Knochenmeißel mit einem Hammer den Schädel eindringt und die Stirnhöhle (2C) eingegeben werden .
7. Verwenden, um die Ausdehnung der Stirnhöhle das dorsoposterior Entfernen des äußeren Schädel Lamina mit einer Knochen-Rongeur oder Knochenstanze zu fördern und setzen die inneren, dünnenknöcherner Schädel Lamina das Cerebrum Belag (Figur 2D).
8. Öffnet sanft den inneren knöchernen Schädel lamina ventral mit einem Hammer und einem Meißel Knochen zur Dura bedeckte Cerebrum (Abbildung 2E) zu belichten.
9. Weiterhin die Knochenentfernung seitlich einen Knochen Meißel und einen Knochen - Rongeur durch die zeitliche und Scheitelbein , um das endgültige dorsoposterior Teil des Schädels freizugeben, der sich zwischen den bereits belichteten Teile der dura bedeckten Cerebrum und Cerebellum (Figur 2F).
   HINWEIS: Es ist oft möglich, im letzten Schritt dieses Verfahrens, den Meißel zu verwenden, öffnen Sie die restlichen hinteren Schädelknochen von einer Seite zu brechen, so wie man eine Tür öffnet.

Abbildung 2: Minipig Schädelöffnung. (A) Die Exposition der dorsoposterior Schädeloberfläche, einschließlich der Entfernung des okzipitalen und temporalen Muskeln. (B) Entfernen des Hinterhauptbeins (CB, dura bedeckten Cerebellum; OB, okzipitalen Knochen; OC, occipitalen Kondylen, und SC, Rückenmark). (C) ein Hammer und ein Meißel Knochen verwendet , um den Schädel ventral zu durchdringen und die Stirnhöhle auf der Höhe der Augen ein. (D) Das Ausmaß der Stirnhöhle (FS) werden verwendet , um die äußeren dicken Schädelknochen (1) zu entfernen, eine inneren dünnen Knochenplättchen (2) , die die Cerebrum aussetzt. (E) Entfernen der dünnen Knochen Lamina, Freilegung der Dura bedeckten Cerebrum (Pfeil). (F) Schließlich wird ein Hammer und ein Knochenmeißel verwendet , um die ventral seitlich anschließen und die hinteren Schädelöffnungen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

4. Gehirn Removal

1. Verwenden chirurgische Zange der Dura heben und einen sanften Einschnitt nahe dem venösen Sinus sagittalis superior mit einem feinen Chirurgisches Skalpell (3A) zu erstellen.
2. Verwenden Mikro Schere oder ein Dura-Messer weiter die Dura öffnen Abdecken der dorsale Oberfläche des Gehirns.
   HINWEIS: Besondere Vorsicht ist geboten, wenn die Dura an das Klein tentorium (3B) entsprechende Entfernung, wie Erhaltung dieses dural Blattes wird nachfolgende Gehirnentfernung zu verhindern.
3. Platzieren Sie den Schweinekopf vertikal (3C).
4. Verwenden , um die Knochenmeißel oder Dissektor die ventroanterior Cerebrum zur Freigabe durch stumpfe Dissektion des Riechkolbens aus dem Dura-bedeckten Boden der Schädelhöhle (Abbildung 3D).
5. Verwenden , um ein feines Chirurgisches Skalpell Abschnitt des belichteten Chiasma (Figur 3E). Freizulegen, und den Abschnitt Hypophysenstiels und die oculomotor Nerven.
6. Lassen Sie die ventrale brainstem durch die lo sectioningWer Hirnnerven (Abbildung 3F) mit einem feinen chirurgischen Skalpell. Sicherstellen , dass die duralen cerebellar tentorium vollständig eingeschnitten wurde (3B), da diese sonst durch durale Blatthirnstamm während des Freisetzungsprozesses geschnitten wird.

Abbildung 3: Minipig Hirnentfernung. (A) Dural Öffnung mit chirurgischer Pinzette und ein dura Messer. (B) Es muss vollständig genommen werden , um den Dural Blatt (Pfeil) einzuschneiden, zwischen Gehirn- und Cerebellum. (C) Der Schweinekopf positioniert ist , vertikal zur besseren Visualisierung der Schädelbasisstrukturen und damit die Schwerkraft in der beabsichtigten Verschiebung des Gehirns zu unterstützen. (D) Ein Dissektor oder ein Knochenmeißel wird verwendet , um den Riechkolben durch stumpfe Sektion von den Dura-covere zu entlastend Schädelbasis. (E) Die Präparation wird in einer posterioren Richtung entlang der Schädelbasis für die Belichtung und Sektionierung des Chiasma (Pfeil), infundibular Stiel und oculomotor Nerven fortgesetzt. (F) Das Gehirn Freisetzung wird mit dem Abschnitt der unteren Hirnnerven abgeschlossen , wie sie von der ventralen Oberfläche der brainstem abgehen (III, Oculomotorius; IV, Trochlearis; V, Trigeminus und VI, Abducens). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

5. Hypophysen Removal

1. Identifizieren Sie den Hypophysenstiel und seine Umgebung dural Blatt (die diapragma sellae) im Schädelboden (4A).
2. Einzuschneiden die durale Blatt lateral den Hypophysenstiels ein feines chirurgisches Skalpell (4B) verwendet wird .
3. Verwenden Sie einen Dissektor die Grube zu lösenuitary und hebt ihn aus der Hypophyse fossa (4C).

Abbildung 4: Minipig Hypophysen Entfernung. (A) Die Hypophyse fossa (*) in dem Schädelboden identifiziert (1, Bulbus olfactorius, 2, Chiasma; und PF, hintere Schädelgrube). (B) Die durale Abdeckung (sellar diagphragm, (Pfeil)) seitlich eingeschnitten. (C) Die Hypophyse (Pfeil) mit einem Dissektor freigegeben und aus der Hypophyse Fossa angehoben. Maßstabsbalken (AC) = 10 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Ergebnisse

Um das Gewebematerial vor dem Austrocknen zu verhindern, wird empfohlen, das Gehirn und Hypophyse entfernt in einem Glas mit Fixativ oder isotonischer Kochsalzlösung gefüllt zu speichern, unmittelbar nach makroskopischer Analyse durchgeführt wurde. Das Gewebematerial kann in der Fixiermittel für Jahre gespeichert werden, während der Lagerung in isotonischer Kochsalzlösung, auch in einem Kühlschrank wird auf Gewebezerfall mit der Zeit führen.

Diskussion

Die meisten experimentellen Neurowissenschaften Studien werden in kleinen Tierarten, wie Mäuse und Ratten durchgeführt, in denen den Zugang zum ZNS durch einen dünnen Schädel- und Dural-Dicke erleichtert wird. In größeren Versuchstieren , wie Schweine ^{1, 4, 8,} Schafe ^32, aber, und nicht-menschliche Primaten, erfordern die beträchtlichen Dicke dieser Strukturen , die die Verwendung von robusten Ins...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heavy Scalpel Handle #4	FST (Fine Science Tools)	10008-13	Good for skin incision and soft tissue removal
Non-Sterile Scalpel Blades #23	FST	10023-00
Scalpel Handle #7	FST	10007-12	Optimal for dural incision and precision work
Non-Sterile Scalpel Blades #11	FST	10011-00
Surgical Forceps	FST	11024-18	The tip of the surgical forceps ensure a firm grip
Kerrison Bone Punch	Aesculap Neurosurgery	FF713R	Must be robust, bite size 3-5 mm
Bone Rongeur	Aesculap Neurosurgery	MD615	Must be robust, bite size 15 x 5 mm
Bone Rongeur	Aesculap Neurosurgery	FO551R	Must be robust, bite size 25 x 15 mm
Bone Chisel	Lawton	67-0335	The size of the chisel head should not exceed 20 mm
Mallet (Hammer)	Millarco	5624108	Weigth 300 g, length 30 cm, head hit area size 2 x 2 cm
Micro-Scissor	FST	14002-14
Dissector	Aesculap Neurosurgery	OL165R
Göttingen minipigs	Ellegaard Göttingen Minipigs A/S, Denmark
Euthanimal			pentobarbital
Ketamine	Pfizer
Midazolam	Hameln Pharmaceuticals