Transferência de capacidade de formação de glândulas mamárias entre células epiteliais basais mamárias e células luminal mamárias através de vesículas / exossos extracelulares

Resumo

Este protocolo descreve métodos para purificar, quantificar e caracterizar vesículas extracelulares (EVs) / exossomos de células epiteliais mamárias não aderentes / mesenquimatosas e para utilizá-las para transferir a capacidade de formação de glândula mamária para células epiteliais mamárias luminal. EVs / exosomas derivados de células epiteliais mamárias semelhantes a tronco podem transferir esta propriedade celular para células que ingerem EVs / exossos.

Resumo

As células podem se comunicar através de exossos, vesículas extracelulares de 100 nm (VE) que contêm proteínas, lipídios e ácidos nucleicos. As vesículas extracelulares derivadas de células epiteliais mamárias não aderentes / mesenquimatosas (NAMEC) podem ser isoladas do meio NAMEC por ultracentrifugação diferencial. Com base na sua densidade, os VE podem ser purificados através de ultracentrifugação a 110 000 x g. A preparação EV a partir da ultracentrifugação pode ser mais separada usando um gradiente de densidade contínua para evitar a contaminação com proteínas solúveis. Os EVs purificados podem então ser mais avaliados usando a análise de rastreamento de nanopartículas, que mede o tamanho eo número de vesículas na preparação. As vesículas extracelulares com um tamanho variando de 50 a 150 nm são exossos. Os EVs / exosomas derivados de NAMEC podem ser ingeridos por células epiteliais mamárias, que podem ser medidas por citometria de fluxo e microscopia confocal. Algumas propriedades das células-tronco mamárias ( por exemplo, capacidade de formação de glândula mamária) podemSer transferido dos NAMECs de haste para células epiteliais mamárias através dos EVs / exossomos derivados de NAMEC. As células epiteliais primárias preliminares da EpCAM ^hi / CD49f ^lo luminal não podem formar glândulas mamárias após serem transplantadas para almofadas de gordura de ratos, enquanto as células epiteliais mamárias basais EpCAM ^lo / CD49f ^hi formam glândulas mamárias após o transplante. A absorção de EVs / exosomas derivados de NAMEC pelas células epiteliais mamárias EpCAM ^hi / CD49f ^lo luminal permite que elas gerem glândulas mamárias após serem transplantadas para almofadas de gordura. Os EVs / exossomos derivados de células epiteliais mamárias semelhantes a tronco transferem a capacidade formadora de glândula mamária para as células epiteliais mamárias EpCAM ^hi / CD49f ^lo luminal.

Introdução

Os exossos podem mediar a comunicação celular através da transferência de proteínas de membrana e citossolo, lipídios e RNAs entre as células ¹ . A comunicação mediada por exosomo demonstrou estar envolvida em muitos processos fisiológicos e patológicos ( ie, apresentação de antígenos, desenvolvimento de tolerância ² e progressão tumoral ³ ). Os exossomos geralmente têm conteúdos semelhantes aos das células-fonte que as liberam. Assim, os exossos podem transportar propriedades celulares específicas das células originais e transferir essas propriedades para as células que as ingerem ⁴ .

Os exossomos são vesículas de membrana de camada dupla de 50 a 150 nm e apresentam marcadores específicos ( por exemplo, CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix e TSG101). Assim, os exossomos devem ser caracterizados por vários métodos para diferentes aspectos. A microscopia eletrônica de transmissão pode ser usada para visualizar vesículas da membranaTais como os exossomos ^{4 , 5} . A análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) e a análise dinâmica de dispersão de luz (DLS) são usadas para medir o tamanho eo número de exossomos purificados ⁴ . O conteúdo da membrana lipídica dos exossomos pode ser verificado por gradiente de densidade. Os marcadores exossais, como CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix e TSG101 ^{6 , 7} , podem ser medidos por Western Blot.

As células basais mamárias têm a capacidade de gerar glândulas mamárias quando implantadas em almofadas de gordura, enquanto as células luminal não podem ^{8 , 9 , 10} . Assim, as células basais mamárias também são referidas como unidades de repovoamento mamário. Ao usar o modelo de células basais e luminales mamárias, a capacidade de EVs / exossomos para transferir características celulares entre diferentes populações celulares pode ser examinada. Este trabalhoDemonstra o método de transferir a capacidade de formação de glândulas de células epiteliais basais mamárias para células epiteliais luminales luminal utilizando EVs / exosomas derivados de células epiteliais basais mamárias. As células epiteliais mamárias luminal adquiriram propriedades das células basais após a ingestão de EVs / exossos secretados a partir de células basais e podem então formar glândulas mamárias ⁴ .

Protocolo

Todas as pesquisas envolvendo animais obedeceram aos protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados com Animais.

1. Isolação e Validação Extracelular da Vesícula / exossoma

1. Células basais epiteliais mamárias culturais, NAMECs ⁴ , com meio fresco e sem soro feito de 500 mL de MCDB 170, pH 7,4 + 500 mL de DMEM / F12 com bicarbonato de sódio (0,2438%); EGF (5 ng / mL); Hidrocoríssona (0,5 μg / mL); Insulina (5 μg / mL); Extracto de pituitária bovina (BPE; 35 μg / mL); E GW627368X (1 μg / mL) em pratos de 15 cm.
2. Depois de contar as células com um hemocitómetro, semente 1,2 x 10 ⁶ células em 12 mL de meio por prato de 15 cm no dia 0 por 4 dias ⁴ .
3. Após 4 dias em cultura, centrifugar o meio de cultura a 300 xg durante 5 min usando uma centrífuga de mesa. Transfira o sobrenadante para um tubo cônico ( Figura 1 ).
4. Centrifugar o sobrenadanteA 2.000 xg por 20 min em uma centrífuga de mesa. Transfira o sobrenadante para um tubo de ultracentrífuga e deixe as células mortas e os detritos celulares ( Figura 1 ).
5. Centrifugar o sobrenadante a 10 000 xg durante 30 min a 4 ° C. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de ultracentrífuga ( Figura 1 ).
6. Centrifugar o sobrenadante a 110 000 xg durante 60 min a 4 ° C. Remova o sobrenadante e ressuspenda o sedimento EV / exossoma em PBS ( Figura 1 ).
7. Centrifugar o sobrenadante a 110 000 xg durante 60 min a 4 ° C. Remova o sobrenadante. Ressuspender o sedimento EV / exossomo em PBS ( Figura 1 ). Ressuspender o grânulo isolado de 240-480 mL de meio condicionado NAMEC em 100 μL.
8. Medir a concentração de proteína da suspensão EV com o teste de proteína BCA. Certifique-se de que a concentração seja de cerca de 20-40 μg / 100 μL. Armazenar a -20 ° C paraAnálise posterior.
9. Medir a concentração eo tamanho dos EVs / exosomas por análise de rastreamento de nanopartículas (NTA), conforme descrito anteriormente por Gardiner et al. ¹¹ . Diluir os EVs / exossomos (20 μg / 100 μL) com PBS a 10.000 vezes para análise NTA.
   NOTA: O resultado da análise NTA reflete o número e o tamanho das vesículas analisadas.
10. Imagem dos VE / exossos com microscopia eletrônica de transmissão (TEM), como descrito anteriormente por Lin et al ⁴ .

2. Exosome Purification Using a Density Gradient

1. Ressuspender o grânulo de 110 000 g do passo 1.7 em iodixanol a 40% (p / v) em PBS (2 mL). Superponha a mistura em sequência com alíquotas de iodixanol a 30%, 20%, 10% e 5% (p / v) em PBS (2 mL cada) para formar um gradiente de densidade em um tubo de ultracentrífuga.
2. Centrifugar a mistura a 200.000 xg por 8 h a 4 ° C.
3. Coletar cada fração de gradiente (10 fracçõesOns; 1 mL / fração) com uma pipeta do topo do tubo.
4. Analisar a presença de marcadores de exossomo ( por exemplo, CD81, CD9, CD63 e Tsg101) em cada fração por SDS-PAGE ¹² e Western blot. Carregar 50 μL de suspensões de cada fração em um gel a 10% contendo 0,1% (p / v) de SDS e separar as proteínas em frações com eletroforese em gel.
5. Transferir as proteínas de um gel para uma membrana de PVDF e incubar a membrana com anticorpos contra os marcadores de exossomo ( por exemplo, CD81, CD9, CD63 e Tsg101) e proteína GAPDH durante a noite ( Tabela de Materiais ) a 4 ° C.
   NOTA: O resultado identifica a fração contendo exossomos.

3. Etiquetagem extracelular da vesícula / exosomo

1. Suspender os EVs / exossomos, obtidos no passo 1.7, em 10 μM de éster de diacetato de succinimidilo de carboxifluoresceína (CFSE) a 20 μg de proteína exossomal / 100 μL. Prepare uma amostra paralela coMantendo apenas CFSE e PBS, processados ​​da mesma maneira, como um controle negativo para os ensaios de absorção EV / exossomo posteriores. Deixe as misturas a 37 ° C durante 30 min.
2. Suspenda os VE / exossos em 50x volume de PBS e centrifugue a suspensão a 110 000 xg durante 60 min a 4 ° C. Remova o sobrenadante e ressuspenda o sedimento EV / exossoma em PBS. Repita o passo 3.2 uma vez.
3. Suspender os EVs / exossomos em PBS a uma concentração de 20 μg de proteína exossomal / 100 μL e depois filtrar o EVs / exossos através de membranas de 0,22 μm antes de adicionar o EVs / exossomos às células.

4. Ensaio de absorção de vesícula extracelular / exosoma

1. Para fazer um meio de cultura, misture 500 mL de MCDB 170, pH 7,4 + 500 mL de DMEM / F12 com bicarbonato de sódio (0,2438%); EGF (5 ng / mL); Hidrocoríssona (0,5 μg / mL); Insulina (5 μg / mL); E BPE (35 μg / mL) ⁴ . Placa as células HMLE epiteliais mamárias humanas em pratos de 6 poços (1 x 10 ^{6 <}/ Sup> células / poço) um dia antes do tratamento EV / exossomo. Adicionar EVs / exosomo marcados com fluorescência CFSE de 2 μg / mL, obtidos no passo 3.3, ao meio de cultura das células HMLE por 2-6 h. Trate as células HMLE do grupo de controle negativo com a preparação paralela, descrita no passo 3.1.
2. Após a incubação de 2 a 6 horas, lave as células duas vezes com 4 mL de PBS à temperatura ambiente.
3. Descarte as células com 0,25% de tripsina durante 10 min e re-suspende as células em PBS contendo 0,2% de FBS. Medir a absorção EV / exosoma da intensidade de fluorescência nas células usando um analisador de células de fluorescência ⁴ . Imagem as células tratadas com EVs / exossomos ou o controle negativo usando microscopia confocal.
   NOTA: A fluorescência verde nas células é causada pela absorção EV / exossoma. Veja a legenda da Figura 6 para as configurações do microscópio.

5. Isolamento das células epiteliais mamárias do mouse primário

1. Prepare pratos revestidos com gelatina adicionando 12 mL de solução de gelatina a 0,1% a pratos de 10 cm. Coloque as placas em uma incubadora a 37 ° C durante 30 min. Remova a solução de gelatina e deixe as tampas dos pratos em uma capa de fluxo laminar por 4 h até o revestimento de gelatina secar.
2. Disseca as glândulas mamárias dos números 2, 3, 4 e 5 ( Figura 2 ) de camundongos C57BL / 6 virgens fêmeas de 12 semanas que usam tesoura e corte as glândulas em pequenos pedaços (2 mm ² ) usando uma navalha.
3. Dissocie ainda mais a suspensão de glândulas mamárias (de 10 ratinhos) durante 60 minutos a 37 ° C, agitação de 120 rpm com 50 mL de DMEM / F12 contendo 0,2% de colagenase tipo IV, 0,2% de tripsina, 5% de FBS, 5 μg / mL de gentamicina , E 1x pen-strep.
4. Granular os organoícidos epiteliais da mistura por centrifugação a 350 xg durante 10 min.
5. Suspender os organoides epiteliais em 4 mL de DMEM / F12 com DNase I de 0,1 mg / mL durante 5 min à temperatura ambiente. Adicione 6 mL de DMEM / F12 a uma finalVolume de 10 mL.
6. Centrifugue a suspensão a 400 xg durante 10 minutos à temperatura ambiente e descarte o sobrenadante.
7. Ressuspender o sedimento em 10 mL de DMEM / F12. Centrifugue a suspensão, mas aperte o freio quando a velocidade atinge 400 xg. Descarte o sobrenadante.
   NOTA: Ao bater o freio, os organoídios epiteliais são rapidamente sedimentados, enquanto os fibroblastos, como células únicas, ainda permanecem no sobrenadante.
8. Repita o passo 5.6 e 5.7 5-7 vezes. Adicione uma gota da suspensão a um hemocitómetro e verifique a depuração dos fibroblastos da mistura orgânica sob microscopia após cada rodada de centrifugação ( Figura 3 ).
9. Placa os organoides no prato revestido com gelatina, obtido no passo 5.1, durante 48 h com DMEM / F12 contendo 1x ITS, 5% de FBS, 50 μg / mL de gentamicina, 10 ng / mL de EGF e 1x pen-strep.
10. Após 48 h, remova as células flutuantes na cultura substituindo o meio com meio de cultura fresco sem FBS (DMEM / F12 contendo 1x ITS, 50 μg / mL de gentamicina, 10 ng / mL de EGF e 1x pen-strep).
11. Confirme que uma monocamada de células epiteliais mamárias migra e cresce a partir dos organoides epiteliais anexados em 3 dias.

6. Separação das células epiteliais mamárias basais / luminal primárias

1. Após a cultura de 3 dias, separe as células mamárias primárias de murganho com uma mistura enzimática natural com atividade enzimática proteolítica e colagenolítica durante 20 min. Neutralize a atividade enzimática com 5% de FBS em PBS.
2. Centrifugue a suspensão a 450 xg durante 10 minutos à temperatura ambiente e descarte o sobrenadante. Ressuspender o sedimento celular em 5 mg / mL de dispase durante 20 min. Neutralize a atividade enzimática com 5% de FBS em PBS.
3. Centrifugue a suspensão a 450 xg durante 10 minutos à temperatura ambiente e descarte o sobrenadante.
4. Re-suspendeu as células em 100 μL de PBS com 0,2% de FBS a uma concentração de 10 ⁷ células / mL com o diluídoAnticorpos anti-CD49f e anti-EpCAM no gelo durante 1 h no escuro.
5. Lavar as células com PBS e depois incubar as células com anticorpo secundário conjugado com fluoróforo em gelo durante 30 min no escuro.
6. Lavar e voltar a suspender as células em PBS com FBS a 0,2%.
7. Classifique as células epiteliais mamárias EpCAM ^hi / CD49f ^lo luminal em um classificador celular ⁴ .

7. Extracelular Vesícula / tratamento com exossomos

1. Semente as células epiteliais mamárias classificadas EpCAM ^hi / CD49f ^lo luminal a partir do passo 6.7 em pratos de 6 poços revestidos com gelatina (2 x 10 ⁵ células / poço) e depois tratá-las com PBS ou EVs / exosomas derivados de NAMEC de 2 μg / mL Obtido no passo 1.7.
2. Para garantir a eficácia biológica dos EVs / exossos no tratamento de cultura a longo prazo, substitua o meio de cultura de células com meio fresco contendo PBS ou 2 μg / mL de EVs / exosomas derivados de NAMEC a cada dois dias. Não divide o mouse primaCélulas luminal durante os 10 dias de tratamento.

8. Injeção de pilhas gordas de células epiteliais mamárias

1. Anestesiar os camundongos C57BL / 6 fêmeas com 3 semanas de idade com isofluorano 2-3% inalante.
2. Coloque o mouse anestesiado nas costas. Remova a pele no meio do abdômen com uma barbear / creme de cabelo e limpe o local da cirurgia com três ciclos alternados de 70% de álcool e povidona-iodo.
3. Faça uma incisão vertical de 1,5 cm através da pele ao longo da região ventricular torácica-inguinal com tesoura e, em seguida, exponha alternadamente as 4ª almofadas ^de gordura mamária direita e esquerda.
4. Limpe cada almofada de gordura removendo o parênquima da glândula com tesoura. Localize o nódulo linfático na almofada de gordura e, em seguida, remova todo o parênquima da glândula abaixo do nódulo linfático.
   NOTA: Dois terços da almofada de gordura devem permanecer no lugar.
5. Descarte as células obtidas a partir do passo 7.2 com uma mistura enzimática natural (veja a Tabela de Materiais ) com proteolítico aE atividade enzimática colagenolítica durante 10 min. Neutralize a atividade enzimática com 5% de FBS em PBS.
6. Centrifugue a suspensão a 450 xg durante 10 minutos à temperatura ambiente e descarte o sobrenadante. Contar as células com um hemocitómetro e suspender as células em PBS a uma concentração tal que 15 μL contém a dose celular desejada (10 ⁴ -10 ² células / almofada).
7. Injetar 15 μL de suspensão de células epiteliais mamárias em uma almofada de gordura usando uma seringa de vidro de 100 μL anexada a uma agulha 27G.
8. Repita as etapas 8.4-8.7 para a almofada de gordura do outro lado.
9. Feche a pele com clipes de ferida.

9. Mammary Gland Whole Mount

1. Eutanizar o mouse com luxação cervical CO ₂ mais às 8 semanas após a injeção celular (Passo 8.7).
2. Faça uma incisão vertical através da camada de pele da região torácica até a região inguinal usando uma tesoura e depois exponha o ^4º m da direita e da esquerdaAlmofadas de gordura amaria. Remova as ^4ª glândulas mamárias ( Figura 2 ).
3. Espalhe as pastilhas de gordura em lâminas de microscópio de vidro e fixe as almofadas de gordura com o fixador de Kahle (4% de formaldeído, 30% de EtOH e 2% de ácido acético glacial) à temperatura ambiente durante a noite.
   Atenção: o fixador de Kahle é irritante. Execute este passo em um capô químico.
4. Lavar as almofadas de gordura em 250 mL de EtOH a 70% durante 15 min e depois em 250 mL de dH2O durante 5 min. Manchar as almofadas de gordura com alumínio de carmim (1 g de carmin e 2,5 g de sulfato de alumínio e potássio em 500 mL de dH2O) à temperatura ambiente durante a noite.
5. Lavar as almofadas de gordura com 250 mL de EtOH a 70% durante 15 minutos, 250 mL de EtOH a 95% durante 15 minutos e 250 mL de EtOH a 100% durante 15 min.
6. Limpe as almofadas de gordura em xileno por dias e pare a incubação de xileno quando as pastilhas de gordura se tornam transparentes.
   Atenção: o xileno é irritante. Execute este passo em um capô químico.
7. Monte os slides wiMedidor de montagem e tirar imagens (2.400 dpi) das almofadas de gordura usando um scanner de slide digital.

Resultados

Uma vez que foi demonstrado que o bloqueio da sinalização de PGE ₂ / EP ₄ desencadeia a liberação de EV / exossomo a partir de células-tronco basais semelhantes a mamas ⁴ , este trabalho apresenta um método para isolar os EVs / exosomas induzidos pela cultura de células basais epiteliais mamárias (NAMEC). Uma vez que os NAMECs são cultivados em meio isento de soro, não existem EVs / exossomos pré-existentes derivados do soro

Discussão

Os exossomas geralmente carregam características das células que os liberaram e a quantidade de exosomas liberados pode ser induzida por estímulos ⁴ . O meio de cultura das células pode ser coletado e submetido a ultracentrifugação diferencial para a coleta de EV / exossomo ( Figura 1 ). Atualmente, não existe um acordo geral sobre um método ideal para isolar EVs / exossomos. O método ideal usado aqui foi determinado pelo aplicativo a jusante

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCDB 170	USBiological	M2162
DMEM/F12	Thermo	1250062
Optima L-100K ultracentrifuge	Beckman	393253
SW28 Ti Rotor	Beckman	342204
SW41 Rotor	Beckman	331306
NANOSIGHT LM10	Malvern	NANOSIGHT LM10	for nanoparticle tracking analysis (NTA)
Optiprep	Sigma-Aldrich	D1556	60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile).
CD81 antibody	GeneTex	GTX101766	1:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight
CD9 antibody	GeneTex	GTX100912	1:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight
CD63 antibody	Abcam	Ab59479	1:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight
TSG101 antibody	GeneTex	GTX118736	1:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight
GAPDH	GeneTex	GTX100118	1:6000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight
CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl diacetate ester)	Thermo	V12883
FACSCalibur	BD Biosciences		fluorescence cell analyzer
collagenase Type IV	Thermo	17104019
trypsin	Thermo	27250018
ITS	Sigma-Aldrich	I3146	a mixture of recombinant human insulin, human transferrin, and sodium selenite
accutase	ebioscience	00-4555-56	a natural enzyme mixture with proteolytic and collagenolytic enzyme activity
dispase	STEMCELL	7913	5 mg/ml = 5 U/ml
anti-CD49f antibody	Biolegend	313611	1:50
anti-EpCAM antibody	Biolegend	118213	1:200
FACSAria	BD Biosciences		cell sorter
carmine alum	Sigma-Aldrich	C1022
human mammary epithelial cells (HMLE cells, NAMECs)			gifts from Dr. Robert Weinberg
permount	Thermo Fisher Scientific	SP15-500
sodium bicarbonate	Zymeset	BSB101
EGF	Peprotech	AF-100-015
Hydrocoritisone	Sigma-Aldrich	SI-H0888
Insulin	Sigma-Aldrich	SI-I9278
BPE (bovine pituitary extract)	Hammod Cell Tech	1078-NZ
GW627368X	Cayman	10009162
15-cm culture dish	Falcon	353025
table-top centrifuge	Eppendrof	Centrifuge 3415R
ultracentrifuge tube	Beckman	344058
PBS (Phosphate-buffered saline)	Corning	46-013-CM
BCA Protein Assay	Thermo Fisher Scientific	23228
Transmission Electron Microscopy	Hitachi	HT7700
gelatin	STEMCELL	7903
10-cm culture dish	Falcon	353003
6-well culture dish	Corning	3516
female C57BL/6 mice	NLAC (National Laboratory Animal Center
FBS (Fetal Bovine Serum)	BioWest	S01520
gentamycin	Thermo Fisher Scientific	15710072
Pen/Strep	Corning	30-002-Cl
DNase I	5PRIMER	2500120
isofluorane	Halocarbon	NPC12164-002-25
formaldehyde	MACRON	H121-08
EtOH (Ethanol)	J.T. Baker	800605
glacial acetic acid	Panreac	131008.1611
aluminum potassium sulfate	Sigma-Aldrich	12625
Xylene	Leica	3803665
0.22 μm membranes	Merck Millipore	Millex-GP
AUTOCLIP Wound Clips, 9 mm	BD Biosciences	427631
AUTOCLIP Wound Clip Applier	BD Biosciences	427630
CellMask™ Deep Red	Thermo Fisher Scientific	C10046	plasma membrane stain