АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Сиаловая кислота — это типичный моносахаридов единица в гликоконъюгаты. Он участвует в многочисленных молекулярных и клеточных взаимодействий. Здесь мы представляем метод изменения клеток поверхности сиаловая кислота выражение с использованием метаболических glycoengineering с N- acetylmannosamine производных.

Аннотация

Сиаловая кислота (Sia) является очень важной составляющей гликоконъюгаты, как N-, O- гликанов или гликолипидов. Благодаря своей позиции в Термини-уменьшение олиго - и полисахаридов, а также его уникальных химических характеристик сиаловая кислота участвует в множество различных рецептор лиганд взаимодействий. Изменяя выражение сиаловые кислоты на поверхности клеток, поэтому будет влиять сиаловая кислота зависимые взаимодействия. Это может быть полезно исследовать сиаловая кислота зависимые взаимодействия и имеет потенциал, чтобы влияние некоторых заболеваний в выгодным способом. Через обменные glycoengineering (MGE) можно модулировать выражение сиаловые кислоты на поверхности клеток. Здесь клетки, ткани или даже целые животных относятся с C2-модифицированные производные N- acetylmannosamine (ManNAc). Эти аминокислоты сахара выступать в качестве прекурсоров молекулы сиаловые кислоты и поэтому метаболизируется до соответствующих видов сиаловая кислота и выразил на гликоконъюгаты. Применяя этот метод производит интригующим воздействие на различных биологических процессов. Например он может резко сократить выражение polysialic кислоты (polySia) в обработанных нейрональных клеток и таким образом влияет на нейрональных роста и дифференцировки. Здесь, мы показываем химического синтеза двух наиболее распространенных производных - acylmannosamine C2-изменение N, N- propionylmannosamine (ManNProp), а также N- butanoylmannosamine (ManNBut) и далее показать, как эти ненатуральных Амино сахара могут быть применены в культуре клеток экспериментов. Выражение видов модифицированных сиаловая кислота количественно высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и далее анализируется через масс-спектрометрии. Воздействие на polysialic кислоты выражение освещены через западную помарку использование коммерчески доступных polysialic кислоты антитела.

Введение

Сиаловая кислота является моносахаридов, которые обычно могут быть найдены на-уменьшение Термини гликоконъюгаты, как N-, O- гликанов или гликолипидов. Среди всех моносахаридов сиаловая кислота имеет некоторые уникальные химические характеристики. Она имеет 9 C-атом позвоночника, карбоксильные группы в положении C-1, что депротонированная и тем самым отрицательно заряженных в физиологических условиях и аминокислоты функцию в C-5 положении. Хотя более 50 естественные варианты сиаловые кислоты характеризовались Дата1, преобладающей формой сиаловые кислоты найдены в организме человека является N- ацетилнейраминовой кислоты (Neu5Ac). Другие млекопитающие также выразить большее количество N- glycolylneuraminic кислоты (Neu5Gc)2,3.

Благодаря своей открытой позиции в гликоконъюгаты сиаловая кислота участвует во множестве рецептор лиганд взаимодействий, например, зависимые привязки гемагглютинина вируса гриппа принимающей ячейки4. Сиаловая кислота epitope с важных биологических функций, особенно во время эмбриогенеза и в нервной системе, является polysialic кислоты. Polysialic кислота является полимером до 200 альфа 2,8-связаны сиаловых кислот. Основной белок перевозчик polysialic кислоты является нейронных клеток молекулы адгезии (NCAM). Polysialic кислоты выражение модулирует адгезивные свойства NCAM в том, что выражение polysialic кислоты уменьшает адгезию и повышает пластичность нервной системы5.

Изменения в выражении (поли) сиаловые кислоты будет в конечном итоге влияет на множество различных биологических взаимодействий. Это могут быть использованы для изучения известных сиаловая кислота зависимых процессов на молекулярном уровне, чтобы раскрыть Роман гликоконъюгаты взаимодействия, или исследовать возможные терапевтические подходы. Существуют различные методы, которыми можно модулировать выражение сиаловые кислоты на поверхности клетки, например лечение с конкретным основу сиаловая кислота (sialidases), ингибирование ферментов, участвующих в биосинтезе сиаловая кислота6 ,7,8, или стучать вниз или изменение выражения ключевых ферментов биосинтеза сиаловая кислота9.

Еще один универсальный метод, чтобы модулировать сиаловая кислота выражение является MGE (также известный как метаболические олигосахарида инжиниринг, МО). Здесь клетки, ткани или даже животные лечатся ненатуральных производные ManNAc, которые несут C2-аминокислоты изменения. Будучи прекурсоров молекулы для сиаловая кислота, после клеточного поглощения, эти ManNAc аналогов однонаправленный метаболизируется ненатуральных сиаловые кислоты и может быть выражена на sialylated гликоконъюгаты. Клетки лечат ManNAc производные, перевозящих алифатических C2-модификации, такие как ManNProp или ManNBut, N- propionylneuraminic кислоты (Neu5Prop) или N- butanoylneuraminic кислоты (Neu5But) в их гликоконъюгаты10 , 11. с помощью функциональных групп представлен в C2-положение ManNAc, происходя ненатуральных сиаловые кислоты могут быть связаны, например, через Штаудингера перевязки или азид среднесульфидная циклоприсоединения, флуоресцентными красителями и поэтому визуализируется на поверхности клеток12.

Выражение этих ненатуральных сиаловые кислоты имеет интригующий воздействие на многие биологические процессы, включая возбудителя инфекции, адгезии и миграции опухолевых клеток, общей клеточной адгезии, а также васкуляризации и дифференциации (для обзора см.: Wratil и др. 13). интересно, что МГЕ с N-ацил изменения mannosamines может также использоваться для вмешиваться с выражением polysialic кислоты. Polysialic кислота вырабатывается два разных polysialyltransferases (ST8SiaII и ST8SiaIV). Было продемонстрировано, что polysialyltransferase ST8SiaII тормозится неестественным сиаловая кислота прекурсоров, таких как ManNProp или ManNBut14,15. Кроме того было продемонстрировано в клетках человека нейробластомы ManNProp или ManNBut приложений также снижает sialylation всего15.

МГЕ с N-ацил изменения mannosamines это легко применять метод, который успешно используется, не только в млекопитающих и культуры клеток бактерий, но и во всей животных разных видов, таких как Caenorhabditis elegans16, Данио рерио17, или мышей18,19,,2021. Подшипник алифатического ряда изменений, в том числе ManNProp и ManNBut, особенно на ManNAc производные пренебрежимо цитотоксических, даже в millimolar концентрациях в ячейку культуры среднего или плазме крови. Кроме того они относительно легко синтезировать.

Здесь, мы предоставляем подробную информацию о том, как использовать МГЕ с N-ацетил изменение mannosamines. Во-первых химический синтез двух из наиболее широко используемых производных ManNAc в этой области, ManNProp и ManNBut, объяснил. Далее мы покажем, как МГЕ могут быть применены в качестве эксперимента в естественных условиях . В качестве примера, нейробластома клеточная линия Келли был выбран продемонстрировать уменьшение выражение polysialic epitope западной помарки после лечения с ManNAc производные. Ненатуральных сиаловых кислот на поверхности клеток были количественно ВЭЖХ и далее анализируются через масс-спектрометрии.

протокол

1. Подготовка буферов и реагенты

  1. Подготовка раствор метоксида натрия 3 мм
    1. 8.1 мг натрия метоксида в 50 мл метанола (3 мм) растворяют в стеклянная бутылка 100 мл с баром перемешать. Хранить при комнатной температуре (RT) на несколько недель.
  2. Подготовка буфера Tris-HCl
    1. Объединить 8.766 г NaCl, 157 мг трис-HCl и 146 мг ЭДТА в стеклянная бутылка 100 мл с баром перемешать и растворяются в воде 80 мл.
    2. Добавление перемешивания раствора, гидроксид натрия (1 М, в воде) или HCl (20%, в воде) при соблюдении pH с pH метр и скорректировать рН 8.0.
    3. Добавьте объем воды, необходимой для достижения окончательный объем 100 мл. Фильтр решения с помощью системы стерильного фильтра 0.22 мкм.
      Примечание: 100 мл трис-HCl буфере будет содержать 150 NaCl, 10 мм трис-HCl и 5 мм ЭДТА (рН 8,0). Раствор может храниться при температуре 4 ° C на несколько недель.
  3. Приготовление раствора Апротинин
    1. Растворите Апротинин 10 мг в 1 мл воды (1.54 мм). Алиготе Апротинин раствора в 10 x 1.5 мл пластиковые трубы (по 100 мкл). Хранить при температуре от-20 ° C в течение нескольких недель.
  4. Приготовление раствора leupeptin
    1. Растворяют leupeptin 10 мг в 2 мл воды (10 мм). Алиготе решение leupeptin 10 x 1.5 мл пластиковые трубы. Хранить при температуре от-20 ° C в течение нескольких недель.
  5. Приготовление раствора phenylmethylsulfonyl фторид (PMSF)
    1. Растворите 34,8 мг PMSF в 2 мл этанола (100 мм). Алиготе PMSF раствора в 10 x 1.5 мл пластиковые трубы. Хранить при температуре от-20 ° C в течение нескольких недель.
  6. Приготовление раствора 1,2-диамино-4,5-methyldioxybenzol дигидрохлорид (ДМБ)
    1. Объединить 15,62 мг DMB, 352 мкл β-меркаптоэтанол и 48 мкл натрия бисульфит решение (39%) и добавить 9,6 мл воды (6,9 мм DMB, 500 мм β-меркаптоэтанол и бисульфит натрия 0,19%). Алиготе DMB решение в 40 x 1.5 мл пластиковые трубы (по 250 мкл). Магазин, защищенном от света при-20 ° C в течение нескольких недель.
  7. Подготовка раствора кислоты (ТФК) 1 M trifluoroacetic
    1. Мкл 770.3 100% TFA 9.23 мл воды в пластиковых труб 15 мл (1 М). Хранить при 4 ° C на несколько недель.
  8. Приготовление раствора TFA 120 мм
    1. Мкл 92.4 TFA (100%) в 9.91 мл воды (120 мм) в пластиковой трубке 15 мл. Хранить при 4 ° C на несколько недель.
  9. Подготовка раствора гидроксида натрия (NaOH) 400 мм
    1. Растворяют 160 мг NaOH в 10 мл воды (400 мм) в пластиковой трубке 15 мл. Хранить при 4 ° C на несколько недель.
  10. Подготовка буфера lysis иммуноблоттинга
    1. Распустить 5.84 г NaCl, 0,1 г трис (гидроксиметил)-aminomethan (Tris), 0,1 г CaCl2, 0,95 g MgCl2и 1 g Тритон-X100 в 100 мл воды и скорректировать рН 7,8. Хранить при 4 ° C. 100 мкл каждого ингибитор протеазы (апротинин, leupeptin и PMSF), перед использованием буфера lysis.
  11. Подготовка натрия Додециловый сульфат геля полиакриламида буфер электрофореза (SDS-PAGE)
    1. Распустить 0,3 г трис и 1,5 г глицина 0,1 g SDS в 100 мл воды и скорректировать рН 7.3. Магазин на RT.
  12. Подготовка буфера иммуноблоттинга
    1. Растворяют 0,3 г трис, глицин 1.1 g в 90 мл воды и добавляют 10 мл этанола. Магазин на RT.
  13. Подготовка преграждая разрешение
    1. Растворите 1 г жира бесплатно молоко власти в 25 мл фосфатный буфер (PBS). Всегда готовить свежие.

2. синтез ManNProp и смежных N-ацил-изменение Mannosamines

  1. Растворяют mannosamine гидрохлорид 431.2 мг в 10 мл 3 мм раствор метоксида натрия в стеклянной бутылке 50 мл с баром перемешать.
  2. Охлаждать смесь на льду до 0 ° C. Для перемешивания раствора медленно добавьте каплям 210 мкл propionyl хлорид (2,4 ммоль), или 248 мкл butanoyl хлорид (2,4 ммоль) синтезировать ManNProp или ManNBut, соответственно. Инкубируйте перемешивания смесь при 0 ° C в течение 4 ч.
  3. Передача решения в пластиковый Тюбик 50 мл. Совать 4-8 отверстий в крышке пластиковой трубки с тонкой иглой. Быстро заморозить решения с помощью жидкого азота и впоследствии lyophilize (замораживание сухой) за 48 ч или до тех пор, пока он полностью высох.
  4. Смешайте 350 g силикагель 60 с 750 мл этиловый ацетат/метанол/воды (15:2:1) (это подвеска). Заполните столбец стекла (длина 70 см и диаметром 35 мм) с подвеской силикагель 60 и промойте подготовленный колонку с еще 100 мл этиловый ацетат/метанол/воды (15:2:1) перед использованием.
  5. Распустить сушеных продуктов из шага 2.3 (5 г сушеных продуктов) в 10 мл этиловый ацетат/метанол/воды (15:2:1) и загрузки их с помощью пипетки на кремния гель колонке. Соберите 4 мл фракции после 500 мл (для ManNProp). Примечание: ManNBut будет элюировать из столбца примерно после 700 мл.
  6. Перевести eluted фракций в 15 мл пластиковых труб. ПОК 3-6 отверстий в крышке пластиковой трубки с тонкой иглой. Быстрое замораживание решения с помощью жидкого азота и впоследствии lyophilize его до тех пор, пока она полностью высохнет.
    Примечание: Лиофилизированные продукты могут храниться в течение нескольких месяцев на RT.
  7. Проверьте чистоту продукции, масс-спектрометрия (см. раздел 9).
    Примечание: в качестве альтернативы, чистоты могут также быть проверены 1H ядерного магнитного резонанса (ЯМР).

3. клеточная культура

  1. Культура клетки нейробластома Келли в Розуэлле парк Мемориальный институт (RPMI) среде, содержащей 10% плода бычьим сывороточным 100 U пенициллин, стрептомицин 100 мг, 2 мм L-глютамин, содержащих 5 ManNAc, 5 мм ManNProp или 5 мм ManNBut, при 37 ° C и 5% CO2.
    Примечание: Клетки культивировали в среде без ManNAc или его аналоги используются в качестве элемента управления.
  2. Перед нанесением mannosamines отсоедините клетки нейробластома Келли, инкубации их на 10 мин с трипсина/ЭДТА (0,25%, 0,02%, в PBS) и рассчитывать, используя счетчик Нойбауэр палата или ячейки. Семя клетки на определенные номера, на основе размера пластины/блюдо.
    1. Чтобы измерить сиаловая кислота моносахаридов, семян 1 х 105 клеток в 500 мкл среднего в плиту 48-ну тканевые культуры. Для анализа polysialic кислот семян 1 х 106 клеток в среде 3 мл на 6 см диаметр клетки культуры блюдо. Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO2. Замените носитель каждые 24 ч.
      Примечание: Эффект МГЕ увеличивает общее время лечения. Для высокой метаболической эффективности лечения клетки для 5-7 дней.
  3. После лечения сцеживаться среды. Мыть тарелки/блюда с PBS. Отсоедините клетки путем инкубации их на 10 мин с трипсина/ЭДТА (0,25%, 0,02%, в PBS). Нейтрализовать трипсина, добавив такой же объем ячейки питательной среды на отдельные ячейки. Отдельные клетки перехода в 15 мл пластиковых труб. Центрифугуйте образцы на 3 мин на 500 x g и удалить супернатант.
    1. Добавьте 5 мл PBS и центрифуги клетки (см. шаг 3.3). Стиральные процедуру Повторите еще два раза.
      Примечание: Пелле мыть ячейки без супернатант могут храниться при температуре-20 ° C в течение нескольких дней. Если выражение polysialic кислоты должна быть выяснены продолжают раздела 10.

4. клетки Lysis для ВЭЖХ анализа

  1. Подготовка буфера lysis ВЭЖХ
    1. Комбинат 5 мл трис-HCl буфере, 5 мкл раствора Апротинин, 20 мкл leupeptin решение и 50 мкл PMSF решения.
      Примечание: 5 мл ВЭЖХ литического буфера будет содержать 150 мм NaCl, 10 мм трис-HCl, 5 мм ЭДТА, 1,54 мкм Апротинин, 40 мкм Leupeptin и 1 мм PMSF (рН 8,0). Этот буфер всегда должен быть подготовлен свежие до лизис клеток.
  2. Вновь приостановить собранных ячейки гранулы (шаг 3.3) каждый в 500 мкл ледяной ВЭЖХ-буфера lysis и ультра sonicate пробы с ультра-звуковой процессор иглы три раза за период 30 s на средне высокой амплитуды. Прохладный образцы на льду, по крайней мере 1 мин между циклами.

5. разделение мембраны дроби

  1. Центрифугуйте образцы лизированных ячейки для 2 ч на 20000 x g и 4 ° C. Отдельные супернатант (около 480 мкл), представляющих цитозольной белков, в 1,5 мл пластиковых труб. Определите концентрацию белка этих фракций, используя, например, Брэдфорд или bicinchoninic кислоты (BCA) анализа.
    Примечание: Концентрация белка (около 1 мг/мл) цитозольной фракции позднее могут быть связаны с измеренного количества видов уважаемых сиаловая кислота. Пелле представляет мембраны фракция, которая используется в шаге 6.1.

6. кислотный гидролиз

Примечание: Олиго - и полисахаридов в клеточных мембранах гидролизуется до моносахаридов. Кроме того, возможные O-гидролизованный изменения в моносахариды, как хорошо. Это необходимо для количественного анализа ВЭЖХ, потому что подавляющее большинство сиаловых кислот в долях мембраны естественно включены в гликоконъюгаты и возможно может нести O-ацетил или O- lactolyl модификации.

  1. Добавить 150 мкл 1 М TFA-решение для разлученных мембраны фракций (гранулы из раздела 5). Проинкубируйте образцы для 4 ч при 80 ° C при встряхивании в 200-600 об/мин.
  2. Центрифугуйте образцы на около 30 минут на 20000 x g и 21 ° C, с помощью фильтра 0,5 мл трубки с 3 кДа исключения мембраны, до тех пор, пока верхний этап объем составляет менее 20 мкл.
    Примечание: Этот шаг важен распоряжаться выше молекулярный мусора.
  3. Передача нижней фазе, содержащие небольшие молекулы, включая виды сиаловая кислота, в 2 мл пластиковых труб. Совать 2-4 отверстия в шапки пластиковых трубок с помощью тонкой иглы. Быстрое замораживание образцов, с использованием жидкого азота и затем lyophilize их на ночь.
    Примечание: Высушенные образцы могут храниться в течение нескольких дней на RT. заменить крышки без отверстий для более длительного хранения.

7. флуоресцентные метки

  1. Вновь приостановить высушенных образцов в растворе TFA 120 мм 10 мкл и добавьте 50 мкл DMB решения. Передача образцов в темный 1.5 мл пробирок для их защиты от ультрафиолетового излучения.
  2. Для стандартов, растворяют в 1 мкл Neu5Ac (60 нг/мл, в воде) или 1 мкл Neu5Gc (60 нг/мл, в воде) в растворе TFA 120 мм 10 мкл в темный 1.5 мл пробирок. Добавьте 50 мкл DMB решение.
  3. Проинкубируйте образцы клеточной мембраны и стандарты для 1,5 h 56 ° c, защищенном от света. После инкубации мкл 4 400 мм раствор NaOH для каждого образца, чтобы остановить обозначая реакции.

8. ВЭЖХ анализ

Примечание: Приклеенные этикетку образцы анализируются на ВЭЖХ системы оснащены столбцом C18 RP (110 Å, размер частиц 3 мкм, 4.6 x 150 мм), детектор флуоресценции и коллектор фракций. Растворителей, используемых являются метанол, ацетонитриле и воды. Убедитесь в том, Дега все растворители до измерения, если ВЭЖХ системы не хватает внутреннего дегазатор.

  1. Установите температуру столбца до 40 ° C и настроить детектор флуоресценции с 373 Нм для возбуждения и 448 Нм для выбросов, соответственно. Придать 10 мкл пример тома и отдельные датчики для 50 мин на 0,5 мл/мин скорость потока с метанолом/Ацетонитрил/воды (6:8:86) как элюента. Для анализа масс-спектрометрии Соберите пики интерес.
    Примечание: Neu5Gc ожидается элюата после 6-8 мин, Neu5Ac после 9-12 мин, Neu5Prop после 17-23 мин и Neu5But после 38-44 мин. Фракционированных образцов может храниться несколько ч при 4 ° C, защищать от света.
  2. После измерения каждого образца, промойте колонку для 7,5 мин в 1,0 мл/мин скорость потока (≈ 1.5 столбец тома) с метанолом/Ацетонитрил/воды (6:25:69) и заново сбалансировать системы для 7,5 мин в 1,0 мл/мин скорость потока с метанолом/Ацетонитрил/воды (6:8:86).
  3. Для количественного анализа Вычислите площадь под кривой сиаловая кислота пики интерес, используя программное обеспечение соответствующих ВЭЖХ системы22.
    Примечание: Полученные данные могут быть связаны с Neu5Ac или Neu5Gc стандарт и концентрации измеряемых белка в цитозольной фракции (см. раздел 5.1).

9. масс-спектрометрии анализ сиаловая кислота моносахаридов

Примечание: ВЭЖХ удержания пиков интерес может быть далее проанализированы жидкостной хроматографии (LC) электроспрей ионизационная масс-спектрометрия (ESI-МС), чтобы проверить неестественным сиаловая кислота видов.

  1. Для анализа масс-спектрометрии придать 20 мкл собранных образцов LC/масса селективного детектора (MSD) системы с метанолом 79,9%, 20% изопропиловый спирт и 0.1% муравьиной кислоты как элюента, 0,5 мл/мин скорость потока, капиллярные напряжение 4 кв и капиллярной температуры 350 ° C 22 , 23.
  2. В программное обеспечение оценки соответствующей системы LC/MSD выберите пиковые интерес всего Ион хроматограммы. Просмотр массовые спектр решена пик. Показать положительный массы/заряд соотношение между 300 и 700.
    Примечание: ДМБ маркировки сиаловые кислоты приводит к увеличению в молекулярной массе 116.2 г/моль. ДМБ меченых сиаловая кислота видов имеют следующие молекулярных масс: ДМБ-Neu5Ac = 424.2 г/моль, DMB-Neu5Gc = 441.8 г/моль, DMB-Neu5Prop = 436.2 г/моль, DMB-Neu5But = 453.2 g/mol. общего аддукты являются Ацетонитрил, натрия или изопропиловый спирт.

10. Западный анализ помаркой Polysialic кислоты в клетках нейробластома Келли

  1. Подготовка lysates клетки
    1. Добавьте 1 мл буфера lysis иммуноблоттинга клетки гранулы из шагу 3.3 и вихрь. Инкубируйте 30 мин на льду. Вихрь каждые 5 мин. Центрифугуйте образцы на 1,5 ч на 20000 x g и 4 ° C. Соберите супернатанта, содержащие белки от лизированных клетках.
    2. Определите концентрацию белка белковых фракций, например, Брэдфорд или BCA assay. Развести образцы к концентрации протеина 1,5 мкг/мкл литического буфера.
    3. Подготовка образцов для SDS-страницы путем добавления 10 мкл буфер Лэмли образца 90 мкл белковые фракции (1,5 мкг/мкл) и варить образца для 5 минут24.
  2. Immunoblotting
    1. Используйте 8% SDS-Полимерность гелей с 20-30 мкл карманы и 0,75 или 1 мм толщиной. Побегите гель на 25 мА 2 h на RT.
    2. Осторожно снимите крышку стекла от геля. Вырезать и удалить верхнюю часть геля, содержащего загрузки карманы. Поместите гель на нитроцеллюлозную мембрану (0,2 мкм), ранее смоченной в западной помарке буфера. Передачи белков на нитроцеллюлозную согласно рекомендации системы (например, 250 мА на 1 час при температуре 4 ° C).
    3. Удаление нитроцеллюлозную мембрану из переноса системы. Пятно пятно с Понсо красный визуализировать белки. Передача нитроцеллюлозную мембрану в пластиковых камеру и добавляют 10 мл, преграждая разрешение. Инкубировать 1 час на RT или на ночь при 4 ° C.
    4. Декант блокирования решения и добавьте моноклонального анти polySia 735 антитела (1 мкг/мл) в PBS. Проинкубируйте мембрану за 1 час на RT или на ночь при 4 ° C. После инкубации Промойте мембрану по крайней мере три раза за 5 мин с PBS.
    5. Добавьте поликлональных вторичное антитело против мыши IgG (1 мкг/мл) в сочетании с пероксидазой хрена (ПХ) или флуоресцентные метки в PBS. Проинкубируйте мембрану за 1 час на RT. После инкубации Промойте мембрану по крайней мере три раза за 5 мин с PBS.
    6. Передача мембраны на тарелку соответствующие тепловизор. Обнаружить сигнал согласно инструкциям производителя.

Результаты

ВЭЖХ хроматограммы люминесцентные, Neu5Ac и Neu5Gc стандарты изображены на рисунке 2. С помощью метода здесь описано, DMB-меченых Neu5Gc обычно elutes между 7-9 мин элюции время и DMB-Neu5Ac между 10-12 мин. Несколько меньше пиков в Хроматограмма обычно появляются между 2-6 мин...

Обсуждение

Если химически синтезированные производные ManNAc, ManNProp и ManNBut анализируются через масс-спектрометрии, только правильное массового пик для обоих образцов должны быть определены. Таким образом можно предположить продукты иметь чистоту свыше 99%. Небольшое количество Neu5Gc, который обычно не ...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы благодарим Нгуен D. L. для корректуры рукописи и плодотворных обсуждений. Кроме того мы благодарим за помощь в подготовке съемок J. Dernedde и H. G. Нгуен. Большинство сцен видео были расстреляны в лабораториях р. Таубер. Мы также благодарим Институт Макса Планка для коллоидов и интерфейсов и за предоставленную нам бесплатный доступ к их объекте масс-спектрометрии. RH была поддержана DFG (ProMoAge).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
CellsSigma-Aldrich92110411
RPMI mediumSigma-AldrichR8758
75 ml tissue culture flasksGreiner690175
48-well platesCorning3548
FCSPAAA15-102
Pen/StrepGibco15140-122
TrypsineGibco15400-054
EDTARothX986.1
TrisServa37190.03
SDSRoth2326.2
SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machineVWRSDS Gel/Blot
AcrylamideRoth3019.1
Protein ladderFisher Scientific267620
NitrocelluloseGE Healthcare10600002
Ponceau redRoth5938.2
Milk powderRothT145.3
ECLMilliporeWBLUF 0500
0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membraneMerck-MilliporeUFC500324
15 mL centrifuge tubesSigma-Aldrich (Corning)CLS430791-500EA
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250-10ML
2-PropanolSigma-Aldrich34965-1LHPLC gradient grade
4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochlorideSigma-AldrichD4784-50MG
48 well, flat bottom tissue culture plateSigma-Aldrich (Corning)CLS3548-100EA
50 mL centrifuge tubesSigma-Aldrich (Corning)CLS430829-500EA
AcetonitrileSigma-Aldrich34967-1LHPLC gradient grade
Aprotinin from bovine lungSigma-AldrichA1153-10MGlyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid
Butyryl chlorideSigma-Aldrich109614-250G
C18 RP columnPhenomenex00F-4435-E0110 Å, 3 µm particle size, 4.6 x 150 mm
D-Mannosamine hydrochlorideSigma-AldrichM4670-1G
Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt SolutionPAN BiotechP04-36500
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma-AldrichE9884-100G
Formic acidSigma-Aldrich56302-50ML-GL
Hydrochloric acid solutionSigma-AldrichH1758-100ML36.5-38.0%, in water
LeupeptinSigma-AldrichL2884-10MG
MethanolCarl-RothT169.2HPLC gradient grade
N-Acetyl-D-mannosamineSigma-AldrichA8176-250MG
N-Acetylneuraminic acidSigma-AldrichA0812-25MG
N-Glycolylneuraminic acidSigma-AldrichG9793-10MG
Phenylmethanesulfonyl fluorideSigma-AldrichP7626-250MG
Propionyl chlorideSigma-AldrichP51559-500G
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection)Eppendorf30120191
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorlessEppendorf30120086
Sodium bisulfite solutionSigma-Aldrich13438-1L-R-D40%, in water
Sodium chlorideSigma-Aldrich746398-500G-D
Sodium hydroxideSigma-Aldrich795429-500G-D
Sodium hydroxide solutionSigma-Aldrich319511-500ML1.0 M, in water
Sodium methoxideSigma-Aldrich164992-5G
Trifluoroacetic acidSigma-AldrichT6508-100ML-D
Tris hydrochlorideSigma-AldrichT5941-100G
Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBSPAN BiotechP10-019100
WaterCarl-RothT905.1HPLC gradient grade
Silica Gel 60Carl-Roth9779.1
HPLCShimadzu

Ссылки

  1. Angata, T., Varki, A. Chemical diversity in the sialic acids and related alpha-keto acids: An evolutionary perspective. Chem Rev. 102, 439-469 (2002).
  2. Schauer, R., Schoop, H. J., Faillard, H. On biosynthesis of glycolyl group of N-glycolylneuraminic acid. oxidation of N-acetyl group to glycolyl group. Hoppe-Seylers Zeitschrift Fur Physiologische Chemie. 349, (1968).
  3. Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273, 15866-15871 (1998).
  4. Kelm, S., et al. Use of sialic acid analogues to define functional groups involved in binding to the influenza virus hemagglutinin. Eur J Biochem. 205, 147-153 (1992).
  5. Colley, K. J., Kitajima, K., Sato, C. Polysialic acid: Biosynthesis, novel functions and applications. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49, 498-532 (2014).
  6. Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8, 661-668 (2012).
  7. Wratil, P. R., et al. A Novel Approach to Decrease Sialic Acid Expression in Cells by a C-3-modified N-Acetylmannosamine. J Biol Chem. 289, 32056-32063 (2014).
  8. Nieto-Garcia, O., et al. Inhibition of the key enzyme of sialic acid biosynthesis by C6-Se modified N-acetylmannosamine analogs. Chem Sci. 7, 3928-3933 (2016).
  9. Keppler, O. T., et al. UDP-GlcNAc 2-epimerase: A regulator of cell surface sialylation. Science. 284, 1372-1376 (1999).
  10. Kayser, H., et al. Biosynthesis of a nonphysiological sialic acid in different rat organs, using N-propanoyl-D-hexosamines as precursors. J Biol Chem. 267, 16934-16938 (1992).
  11. Keppler, O. T., et al. Biosynthetic modulation of sialic acid-dependent virus-receptor interactions of two primate polyoma viruses. J Biol Chem. 270, 1308-1314 (1995).
  12. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. Imaging the glycome. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12-17 (2009).
  13. Wratil, P. R., Horstkorte, R., Reutter, W. Metabolic Glycoengineering with N-Acyl Side Chain Modified Mannosamines. Angewandte Chemie International Edition. 55, 9482-9512 (2016).
  14. Horstkorte, R., et al. Selective inhibition of polysialyltransferase ST8Siall by unnatural sialic acids. Exp Cell Res. 298, 268-274 (2004).
  15. Gnanapragassam, V. S., et al. Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 9, 10 (2014).
  16. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted 3+2 azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of blomolecules in living systems. J Am Chem Soc. 126, 15046-15047 (2004).
  17. Dehnert, K. W., et al. Imaging the Sialome during Zebrafish Development with Copper-Free Click Chemistry. ChemBioChem. 13, 353-357 (2012).
  18. Prescher, J. A., Dube, D. H., Bertozzi, C. R. Chemical remodelling of cell surfaces in living animals. Nature. 430, 873-877 (2004).
  19. Neves, A. A., et al. Imaging sialylated tumor cell glycans in vivo. Faseb Journal. 25, 2528-2537 (2011).
  20. Vogt, J., et al. Homeostatic regulation of NCAM polysialylation is critical for correct synaptic targeting. Cell Mol Life Sci. 69, 1179-1191 (2012).
  21. Qiu, L., et al. A novel cancer immunotherapy based on the combination of a synthetic carbohydrate-pulsed dendritic cell vaccine and glycoengineered cancer cells. Oncotarget. 6, 5195-5203 (2015).
  22. Erikson, E., et al. Mouse Siglec-1 Mediates trans-Infection of Surface-bound Murine Leukemia Virus in a Sialic Acid N-Acyl Side Chain-dependent Manner. J Biol Chem. 290, 27345-27359 (2015).
  23. Klein, A., Diaz, S., Ferreira, I., Lamblin, G., Roussel, P., Manzi, A. E. New sialic acids from biological sources identified by a comprehensive and sensitive approach: liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry (LC-ESI-MS) of SIA quinoxalinones. Glycobiology. 7, 421-432 (1997).
  24. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteriophage-T4. Nature. 227, (1970).
  25. Orozco-Solano, M. I., Priego-Capote, F., Luque de Castro, M. D. Ultrasound-assisted hydrolysis and chemical derivatization combined to lab-on-valve solid-phase extraction for the determination of sialic acids in human biofluids by µ-liquid chromatography-laser induced fluorescence. Analytica Chimica Acta. 766, 69-76 (2013).
  26. Hara, S., Takemori, Y., Yamaguchi, M., Nakamura, M., Ohkura, Y. Fluorometric high-performance liquid chromatography of N-acetyl- and N-glycolylneuraminic acids and its application to their microdetermination in human and animal sera, glycoproteins, and glycolipids. Anal Biochem. 164, 138-145 (1987).
  27. İzzetoğlu, S., Şahar, U., Şener, E., Deveci, R. Determination of sialic acids in immune system cells (coelomocytes) of sea urchin, Paracentrotus lividus, using capillary LC-ESI-MS/MS. Fish Shellfish Immunol. 36, 181-186 (2014).
  28. Wolf, S., et al. Chemical Synthesis and Enzymatic Testing of CMP-Sialic Acid Derivatives. ChemBioChem. 13, 2605-2615 (2012).
  29. Sonnenburg, J. L., Altheide, T. K., Varki, A. A uniquely human consequence of domain-specific functional adaptation in a sialic acid-binding receptor. Glycobiology. 14, 339-346 (2004).
  30. Oetke, C., et al. Evidence for efficient uptake and incorporation of sialic acid by eukaryotic cells. Eur J Biochem. 268, 4553-4561 (2001).
  31. Buttner, B., et al. Biochemical engineering of cell surface sialic acids stimulates axonal growth. J Neuro. 22, 8869-8875 (2002).
  32. Kontou, M., Weidemann, W., Bork, K., Horstkorte, R. . Biological Chemistry. 390, 575 (2009).
  33. Tanaka, F., et al. Expression of polysialic acid and STX, a human polysialyltransferase, is correlated with tumor progression in non small cell lung cancer. Cancer Res. 60, 3072-3080 (2000).
  34. Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
  35. Collins, B. E., Fralich, T. J., Itonori, S., Ichikawa, Y., Schnaar, R. L. Conversion of cellular sialic acid expression from N-acetyl- to N-glycolylneuraminic acid using a synthetic precursor, N-glycolylmannosamine pentaacetate: inhibition of myelin-associated glycoprotein binding to neural cells. Glycobiology. 10, 11-20 (2000).
  36. Schwartz, E. L., Hadfield, A. F., Brown, A. E., Sartorelli, A. C. Modification of sialic acid metabolism of murine erythroleukemia cells by analogs of N-acetylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta. 762, 489-497 (1983).
  37. Jones, M. B., et al. Characterization of the cellular uptake and metabolic conversion of acetylated N-acetylmannosamine (ManNAc) analogues to sialic acids. Biotechnol Bioeng. 85, 394-405 (2004).
  38. Bayer, N. B., et al. Artificial and Natural Sialic Acid Precursors Influence the Angiogenic Capacity of Human Umbilical Vein Endothelial Cells. Molecules. 18, 2571-2586 (2013).
  39. Schmidt, C., Stehling, P., Schnitzer, J., Reutter, W., Horstkorte, R. Biochemical engineering of neural cell surfaces by the synthetic N-propanoyl-substituted neuraminic acid precursor. J Biol Chem. 273, 19146-19152 (1998).
  40. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. In Vivo Imaging of Caenorhabditis elegans Glycans. ACS Chem Biol. 4, 1068-1072 (2009).
  41. Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish. Science. 320, 664-667 (2008).
  42. Chang, P. V., et al. Copper-free click chemistry in living animals. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 1821-1826 (2010).
  43. Gagiannis, D., Gossrau, R., Reutter, W., Zimmermann-Kordmann, M., Horstkorte, R. Engineering the sialic acid in organs of mice using N-propanoylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1770, 297-306 (2007).
  44. Rong, J., et al. Glycan Imaging in Intact Rat Hearts and Glycoproteomic Analysis Reveal the Upregulation of Sialylation during Cardiac Hypertrophy. J Am Chem Soc. 136, 17468-17476 (2014).
  45. Galuska, S. P., et al. Quantification of Nucleotide-Activated Sialic Acids by a Combination of Reduction and Fluorescent Labeling. Anal Chem. 82, 4591-4598 (2010).
  46. Harms, E., Reutter, W. Half-Life Of N-Acetylneuraminic Acid In Plasma-Membranes Of Rat-Liver And Morris Hepatoma 7777. Cancer Res. 34, 3165-3172 (1974).
  47. Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Curr Opin Chem Biol. 16, 214-220 (2012).
  48. Preidl, J. J., et al. Fluorescent Mimetics of CMP-Neu5Ac Are Highly Potent, Cell-Permeable Polarization Probes of Eukaryotic and Bacterial Sialyltransferases and Inhibit Cellular Sialylation. Angewandte Chemie-International Edition. 53, 5700 (2014).
  49. Macauley, M. S., et al. Systemic Blockade of Sialylation in Mice with a Global Inhibitor of Sialyltransferases. J Biol Chem. 289, 35149-35158 (2014).
  50. Jorge, P., Abdul-Wajid, A. Sialyl-Tn-KLH, glycoconjugate analysis and stability by high-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD). Glycobiology. 5, 759-764 (1995).
  51. Lin, S. L., Inoue, Y., Inoue, S. Evaluation of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed electrochemical and fluorometric detection for extensive application to the analysisof homologous series of oligo- and polysialic acids in bioactive molecules. Glycobiology. 9, 807-814 (1999).
  52. Pan, Y. B., Chefalo, P., Nagy, N., Harding, C., Guo, Z. W. Synthesis and immunological properties of N-modified GM3 antigens as therapeutic cancer vaccines. J Med Chem. 48, 875-883 (2005).
  53. Chefalo, P., Pan, Y. B., Nagy, N., Guo, Z. W., Harding, C. V. Efficient metabolic engineering, of GM3 on tumor cells by N-phenylacetyl-D-mannosamine. Biochemistry. 45, 3733-3739 (2006).
  54. Lee, S., et al. Chemical Tumor-Targeting of Nanoparticles Based on Metabolic Glycoengineering and Click Chemistry. ACS Nano. 8, 2048-2063 (2014).
  55. Koulaxouzidis, G., Reutter, W., Hildebrandt, H., Stark, G. B., Witzel, C. In vivo stimulation of early peripheral axon regeneration by N-propionylmannosamine in the presence of polysialyltransferase ST8SIA2. J Neural Transm. , 1-9 (2015).
  56. Gnanapragassam, V. S., et al. Correction: Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 11, e0154289 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

129polysialicglycoengineering

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены