À l’aide de Laser Doppler d’imagerie et de surveillance pour analyser la Microcirculation de la moelle épinière chez le Rat

Résumé

Ici nous présentons une combinaison de laser Doppler l’imagerie de perfusion (LDPI) et laser Doppler perfusion surveillance (LDPM) pour mesurer la colonne vertébrale du cordon débits sanguins locaux et la saturation en oxygène (SO₂), ainsi qu’une procédure normalisée pour l’introduction de la moelle épinière traumatisme chez le rat.

Résumé

Débitmétrie Doppler laser (LDF) est une méthode non invasive pour mesure de débit (BF) de sang, ce qui le rend préférable pour la mesure des altérations microcirculatoires de la moelle épinière. Dans cet article, notre objectif était d’utiliser l’imagerie Laser Doppler et surveillance pour analyser le changement de BF après une lésion de la moelle épinière. L’imageur Doppler laser tant la sonde/moniteur ont été utilisées pour obtenir chaque lecture. Les données du LDPI fournies une distribution locale de BF, qui donnait une vue d’ensemble de perfusion autour du site de la lésion et rend accessible aux fins d’analyse comparative des BF entre les différents sites. En mesurant intensément la zone Poussée sur une période de temps, une sonde combinée a été utilisée pour mesurer simultanément la saturation BF et l’oxygène de la moelle épinière, montrant la perfusion globale de la moelle épinière et l’apport d’oxygène. LDF lui-même a quelques limitations, telles que les flux relative, sensibilité au mouvement et zéro biologique du signal. Cependant, la technologie a été appliquée dans l’étude clinique et expérimentale en raison de sa configuration simple et rapide mesure de BF.

Introduction

Les tissus de la moelle épinière sont fortement vascularisé et extrêmement sensible à l’hypoxie induite par la moelle épinière (SCI). Nos études précédentes ont montré que la circulation sanguine de la moelle épinière a été sensiblement diminuée après une commotion cérébrale lésion^1,2, qui pourrait être liée au déficit de la fonction motrice. Des études récentes ont montré que l’intégrité des vaisseaux sanguins suite SCI est bien corrélée avec l’amélioration des fonctions motrices sensorielles³. Il a été signalé que meilleure vascularisation pourrait sauver la substance blanche, indirectement menant à l’amélioration de la fonction⁴. Par conséquent, le maintien de la perfusion après lésion de la moelle épinière semble être d’une importance primordiale pour la préservation de la viabilité et la fonctionnalité.

Les effets des différents traitements sur la perfusion après la SCI ont étudié de nombreux chercheurs en utilisant une variété de techniques dans des modèles expérimentaux de SCI^5,6,7. Laser Doppler, comme une technique bien établie, a été sans aucun doute une méthode utile pour quantifier la perfusion dans plusieurs études animales et humaines^8,9,10,11. La technique est basée sur la mesure de l' effet Doppler¹² induite par le déplacement des globules rouges à la lumière éclairante. Depuis la commercialisation de la technique dans les années 1980, beaucoup de progrès a été déposée dans la technologie laser, fibre optique et traitement du signal pour la perfusion de mesure par laser Doppler instruments¹³, lequel LDF à confectionner une technologie fiable.

Dans la présente étude, les deux méthodes de laser Doppler mesure ont été appliquées pour évaluer le débit sanguin (BF) dans les moelles épinières de rats incapacitants. En raison du caractère non invasif de la technologie et sa configuration simple, notre protocole fournit une méthode sensible, rapide et fiable pour les mesures de la BF de la moelle épinière. Plus important encore, cette méthode permet une étude longitudinale de BF SCI post choc sans sacrifice animal à chaque instant.

En raison de la capacité d’évaluer la BF du tissu et des changements rapides de perfusion durant la stimulation, il est possible d’appliquer ce protocole pour évaluer cérébrale de^14,BF¹⁵ ainsi que de mesurer d’autres tissus tels que foie^{16, 17},^18,de peau¹⁹et de l’intestin²⁰. Dans un modèle de rat de transitoire occlusion de l’artère cérébrale moyenne, les lectures de Doppler laser ont été utilisés afin d’assurer une réduction appropriée du taux à des niveaux qui sont attendus dans la pénombre ischémique¹⁴BF. Chez les rats ayant subi l’induction (CLI) de l’ischémie critique limb, laser à balayage Doppler a été appliqué pour observer le membre postérieur BF avant et après l’intervention de la CLI et différentes époques après traitement²¹. En outre, la biodisponibilité et la clairance métabolique de certains médicaments dépendaient BF hépatique, qui a été détecté par le LDF¹⁶. Par conséquent, LDF pourrait être largement utilisé dans un modèle expérimental, pharmacodynamiques et pharmacocinétiques evaluation.

Protocole

Les protocoles animales impliquant des animaux de laboratoire suivi les lignes directrices établies par le National Institutes of Health (NIH) et ont été approuvés par le Comité utilisation de Capital Medical University et animalier.

Les procédures d’introduction de SCI et mesure BF de la moelle épinière à l’aide de laser Doppler matériel décrite ci-dessous ont été utilisés dans une étude publiée¹.

1. préparation de l’intervention chirurgicale

1. Préparer le pentobarbital sodium solution à 3 % (p/v) dans une solution saline et d’administrer à la dose de 35 mg/kg.
   ATTENTION : le pentobarbital sodium est une substance contrôlée. Dossiers détaillés devraient être conservés et solutions conservées dans un endroit sûr et verrouillé.
2. Stérilisation de l’équipement et préparer le domaine de la chirurgie.
   1. Nettoyer le matériel de chirurgie avec les étapes suivantes : 75 % éthanol, nettoyage, puis à l’autoclave à 121 ° C pendant 30 min, puis sécher au four à 60 ° C pendant la nuit. Stériliser le domaine de la chirurgie avec 75 % d’alcool.

2. préparation du Rat pour la chirurgie

1. Anesthésier le rat avec une injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique (35 mg/kg). L’ensemble de la procédure devrait prendre 30 à 40 min, y compris la chirurgie, des mesures de BF et sutures.
2. Raser la région dorsale du rat du bas du dos jusqu’au cou. Les cheveux doivent être coupée aussi court que possible. Placez le rat sur un 40 ° C chauffage pad pour maintenir une température corporelle constante.

3. laminectomie et la commotion cérébrale à la moelle épinière

Remarque : Pour effectuer une laminectomie uniquement pour le groupe fictif, suivez les étapes 3.1 à 3.6.

1. Positionner la face dorsale animale vers le haut. Stérilisez la partie rasée avec de l’iode, suivie de 75 % d’alcool à l’aide de boules de coton stérile. Faire une incision de la peau (4 cm) avec le scalpel sur le site de laminectomie couvrant les vertèbres thoraciques T7 à T11.
2. Couper les muscles attenants sur les deux côtés du T8 à T10 pour exposer les apophyses épineuses, les limbes et les articulations facettaires.
3. Utiliser le scalpel pour faire des incisions que déconnecter la jonction entre T10 et T11. Plus exposer la jonction par soigneusement en disséquant la couche musculaire pour exposer l’OS.
4. Utilisez les ciseaux pour effacer plus musculaire de la lamina et autour du pédicule avec petite Cisaille de ferblantier. Ceci ouvrira un petit espace entre les vertèbres à T10 et T11 (Figure 1 a). Lentement et délicatement insérer une pince hémostatique dans cette lacune et briser le pédicule (Figure 1 b). Assurez-vous que la courbure de la pince est toujours positionnée latéralement, éloigner le cordon. Répétez de l’autre côté.
5. Exposer la moelle épinière (Figure 1) et soulevez lentement et se détachent du limbe. Être sûr de ne pas laisser des fragments d’OS libre ou en escalier.
6. Répétez le processus pour enlever plus loin les limbes T9 et T8.
7. Déplacer l’animal à la table du matériel de frappe et la paire de pinces Adson attaché à la table permet de stabiliser la colonne vertébrale de l’animal par serrage sur l’apophyse épineuse de T7 et T11, puis ajustez la pince pour redresser la colonne vertébrale (Figure 1).
8. Mettre l’animal sous l’élément de frappe, viser la tige de la grève au centre de la moelle épinière exposée et abaissez la tige à 3-5 mm de la surface de la moelle épinière.
9. Définir les paramètres d’impact tels que la force d’impact (160 KD) et temps de pause (1 s)
   1. Induire la SCI en cliquant sur le bouton « Commencer l’expérience » sur l’interface du logiciel, puis cliquez sur « Oui » sur l’interface suivante pour démarrer l’effet automatiquement. Après l’impact, le logiciel affiche les données réelles de l’impact en regard des paramètres de réglage, vérifier les données pour s’assurer que c’était près du point de réglage (Figure 1E).
      NOTE : Un signe typique pour la réussite de l’expérience a été une courte période de mouvement de swing et de la branche queue involontaires après l’impact. Des stimuli à la queue pour vérifier la réflexion de la branche pourraient aussi être faits. Cependant, locomotrice évaluation tels que l’échelle locomotrice^22,Basso, Beattie et Bresnahan (BBB)²³ est nécessaire pour déterminer l’efficacité des lésions induites.

4. laser Doppler analyse

1. Voir la Table des matières pour les détails du scanner laser Doppler utilisé dans cette étude. Pour analyser l’exposés de la moelle épinière, placer la face dorsale du rat vers le haut sur un fond noir, non réfléchissante.
2. Mis en place les paramètres de numérisation : Ouvrez le logiciel de numérisation, cliquez sur « Mesure » pour accéder à l’interface d’utilisateur graphique mesure et cliquez sur le bouton « Configuration du Scanner » pour ouvrir l’interface de configuration de numérisation. Pour analyser les petites zones comme dans cette expérience, sélectionnez « Haute résolution » sous le « Scan dimensions et Options d’affichage » pour un mode de balayage fin avec une résolution supérieure (256 × 256 points couvrant 4 × 10 cm²) (Figure 2 a). Cliquez sur l’option « Image Scan » pour vérifier les périmètres de balayage (Figure 2 b).
3. Cliquez sur l’option « Vidéo et Distance » pour vérifier l’image vidéo en direct. Placez le scanner 10-13 cm au-dessus de la fenêtre chirurgicale et déplacer l’arrière-plan avec l’animal au centre de la moelle épinière exposée sur la fenêtre de numérisation (Figure 2).
4. Utilisez la fonction « auto lointain » à bien régler la hauteur de balayage, Notez que la hauteur de la numérisation doit être cohérente dans l’ensemble de toutes les mesures dans l’expérience de la Figure 2.
5. Utilisez une couverture antireflets avec une fenêtre pour exposer uniquement la zone chirurgicale pour réduire au minimum le fond et marquer la direction de l’animal.
6. Cliquez sur le « Scan de répéter », le nombre d’analyses (nous utilisons 8 scans de répéter dans ce cas) puis cliquez sur « OK » pour ouvrir l’interface de numérisation répéter. Cliquez sur le bouton Démarrer pour lancer la numérisation et l’ensemble du processus prendra environ 3-4 min (Figure 2D).

5. laser Doppler surveillance

1. Nous avons utilisé un moniteur scanner avec VP3 émoussé sonde de livraison fin aiguille moniteur BF et SO₂ au fil du temps. Fixer la sonde Doppler Laser perpendiculairement à un instrument stéréotaxique à mettre en place les équipements de surveillance.
2. Conditionnés le rat sur la face dorsale de l’appareil stéréotaxique, sous-tendent l’animal avec un petit morceau de mousse de styrol lorsque cela est nécessaire au niveau de la moelle épinière exposée.
3. Descendre la sonde jusqu'à la moelle épinière au moniteur BF.
   Remarque : L’étape 5.3 est cruciale pour la reproductibilité de la mesure, car les lectures de données sont sensibles à la pression appliquée à la pince, redoublez de prudence est donc nécessaire pour ne plus - ou moins - position la sonde.
   1. Examiner l’incision et supprimer n’importe quel liquide excessive ou sang à l’aide d’un tampon de coton stérile.
   2. Axes X et Y de l’appareil permet de localiser la sonde à 2 mm rostrale jusqu’au centre de la moelle épinière exposée ou lésion point et éviter de la veine centrale.
   3. Utilisez l’axe Z pour abaisser doucement la sonde au niveau juste toucher la surface de la moelle épinière. La sonde doit toucher la surface de la moelle épinière, mais pas tellement lâche pour permettre toute lumière vive s’échapper du côté de l’interlocuteur.
4. Enregistrement des données
   1. Ouvrez le logiciel d’acquisition de données, cliquez sur le bouton « nouvelle expérience » pour ouvrir l’interface de configuration. Sous l’option « General », vérifiez la configuration système et cliquez sur « Suivant » (Figure 3 a), dans la configuration de l’affichage, sélectionnez la chaîne BF et SO₂ et cliquez sur « Suivant » (Figure 3 b).
   2. Informations sur les fichiers d’entrée, puis cliquez sur « Suivant » (Figure 3) pour accéder à l’interface d’enregistrement de données, cliquez sur le bouton triangle vert pour commencer l’enregistrement des données de la sonde (Figure 3D).
   3. Une fois que le signal est stables, enregistrements des données pendant 8 min consécutives. Ensuite, soulevez la sonde et retirer l’animal appareil stéréotaxique de suture de l’incision et mettre l’animal en soins postopératoires.

6. les sutures et les soins après l’opération

1. Suture de l’incision : insérer une aiguille dans le muscle des deux côtés de l’incision. Tirer le fil à travers, rassemblant les tissus, couvrant ainsi la moelle épinière exposée sur le site de limbes supprimés. En utilisant le porte-aiguille, écouler l’ensemble, forme trois noeuds de square et couper le fil comme à proximité des noeuds que possible.
2. Suture de la peau avec 3-4 square noeuds à l’instar de suture de l’incision, puis couper le filet environ 1 cm les noeuds.
3. Posez le rat sur son flanc dans sa cage, évitant tout contact entre le site de la chirurgie et le fond de la cage. Des cages doivent être placés sur les coussins chauffants.
4. Surveiller l’animal jusqu'à ce qu’il se réveille de l’anesthésie pour n’assurer aucun saignement après la chirurgie et que les sutures restent fermés.
5. Par voie sous-cutanée, injecter Benzyl pénicilline Sodium en rat pendant 3 jours après la chirurgie, 120 mg/kg / jour. Par voie intrapéritonéale injecter buprénorphine (0,05 mg/kg) immédiatement après la chirurgie et chaque post-chirurgie 6 heures pendant 1 nuit.
6. Pour s’assurer que les animaux ont accès à suffisamment de nourriture et d’eau, fit des bouteilles d’eau avec becs étendus et mettre la nourriture à proximité de l’animal dans la cage.
   NOTE : Nous avons procédé à échelle de notation BBB pour évaluer la fonction locomotrice du membre postérieur de la lésion après 24h animale d’exclure les animaux avec un score de BBB au-dessus de 0, donc veiller à ce que l’animal a été paralysé par la blessure induite.
7. Après la chirurgie, fournir le vide manuelle de vessie en appliquant doucement la pression sur l’abdomen deux fois par jour, si nécessaire.

Résultats

LDPI servait à mesurer la BF dans la moelle épinière, qui a été quantifiée le long de l’axe rostral caudal de la moelle épinière en extrayant les profils linéaires (Figure 4). Figure 5 a et 5 b Figure représentent respectivement l’imagerie de flux de la moelle épinière du groupe SCI et groupe fictif. Figure 5 et Figure 5 repr...

Discussion

Quelques détails devraient être remarqué lors de l’exécution de ce protocole. Tout d’abord, le processus de l’anesthésie et la chirurgie doit être réalisée aussi rapidement et élégamment que possible afin de minimiser le stress introduit à l’animal. Pour réduire les perturbations aux résultats, garder l’animal dans un état relativement stable et paisible. Deuxièmement, plus d’attention devrait être accordée aux saignement lors de la mesure à l’aide de laser Doppler matériel, étant donné...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laser Doppler Line Scanner	Moor Instruments	moorLDLS2
Laser Doppler Monitor	Moor Instruments	moorVMS-LDF
Probe for Monitor	Moor Instruments	VP3	Blunt needle end delivery probe
Impactor	Precision Systems and Instrumentation	IH-0400
Phenobarbital sodium	Sigma-Aldrich	P3761
Buprenorphine	Sigma-Aldrich	B-908
Syringe	Becton Dickinson Medica (s) Pte.Ltd	300841
Surgical suture needles with thread	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd		18T0329 (batch number) /4-0
Scalpel	Operation instrument factory of Shanghai Medical Instrument Co., Ltd.	J11030 4#
Scalpel blade	Operation instrument factory of Shanghai Medical Instrument Co., Ltd.	J12130 20#
Ophthalmic forceps	Operation instrument factory of Shanghai Medical Instrument Co., Ltd.	JD1040
Hemostatic forceps	Operation instrument factory of Shanghai Medical Instrument Co., Ltd.	J31050
Benzyl penicillin sodium	North China Pharmaceutical Co., Ltd		F6072116 (batch number)
75% alcohol	Dezhou Anjie Gaoke disinfection products Co., Ltd		150421R (batch number)
Iodine	Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd		20170102 (batch number)
Rat	Laboratory Animal Center, The Academy of Millitery Medical Sciences		Sprague-Dawly (rat strain)