Имплантация хронической кремниевых датчиков и записи клеток гиппокампа место в аппарат обогащенного беговая дорожка

Резюме

Мы описываем различные шаги имплантата хронических кремниевых датчиков и записать место клетки мышей, которые работает голова исправлена на Кий обогащенный беговая дорожка аппарат.

Аннотация

Важным условием для понимания функции мозга является определение поведения и соотносит клеточной активности. Кремния зонды являются передовыми электроды для крупномасштабных электрофизиологических записи нейронной активности, но по-прежнему развиты процедуры их хронических имплантации. Активность клеток гиппокампа место, как известно, коррелируют с позиции животного в окружающей среде, но основные механизмы по-прежнему неясны. Исследовать место клетки, здесь мы описываем набор методов, которые варьируются от изготовления устройств для хронических кремния зонд имплантаты для мониторинга активности поле место в аппарат кий обогащенный беговой дорожки. Микро привод и шляпу строятся установки и крепления вместе 3D-печатных пластиковых деталей. Зонд кремния монтируется на микро привода, уборка и покрыты краской. Первая операция выполняется исправить шляпу на череп мыши. Небольшие достопримечательности изготавливаются и придает ремня беговой дорожке. Мышь обучены выполнять голова исправлена на беговой дорожке. Вторая операция выполняется для имплантата кремния зонд в гиппокампе, после которого широкополосного электрофизиологических сигналов записываются. Наконец кремния зонд оправился и очищен для повторного использования. Анализ активности клеток место в беговой дорожке показывает разнообразие механизмов поля, изложением преимущество подхода.

Введение

Кремния датчики представляют ряд преимуществ для электрофизиологических записей, включая тот факт, что они разработаны с острыми профили, минимизации повреждения тканей и что они представляют точную разметку из плотно упакованных записи сайтов^{1, 2,3,4}. Они используются для изучения различных систем в разных видов, в том числе люди^3,5,6, разнообразные подходы^1,7. Тем не менее их повторного использования все еще сравнительно ограничено из-за их стоимости, хрупкость и тот факт, что удобные методы для хронических экспериментов хватает⁸. Последние достижения в технологии 3D печати сделали возможным индивидуальное проектирование устройств, таких как микро диски и головы пластины позволяют облегчить обработку этих деликатных электродов. В качестве первого шага мы опишем, как построить и использовать набор инструментов, которые мы разработали для имплантации хронической кремния зонды¹⁴.

В то время как место клетки обычно изучаются с использованием свободно перемещающихся животных в лабиринты, недавно они были также расследование в виртуальных средах¹⁵ и беговая дорожка apparatii⁹ (рис. 1A). Эти экспериментальные методы предлагают преимущество, что животные могут быть голова сдержанный, использования 2-Фотон Микроскоп¹⁵, патч хомут¹⁶и optrode^9,10,11 методы проще, помимо усиления контроля на поведение животных и окружающей среды сигналы¹². В качестве второго шага мы представим процедуры подготовки мышей и записи активности клеток место в аппарат беговой дорожки.

протокол

животное уход и использование Комитетом Корейский институт науки и технологии были утверждены все методы, описанные.

1. Подготовка микро привод и электрод

1. Сборка микро привода.
   1. Печать части микро привода (слайдер, тело и оболочки) ¹⁴ с высоким разрешением 3D-принтер. Убедитесь, что детали имеют дефекты не.
   2. Исправить ползунок в организм микро привод с помощью винта (размер 000-120 x 1/4).
   3. Спаять гайка (размер 000-120 000-120/64 Hex) на кончик шурупа.
   4. Вращайте винт по часовой стрелке, чтобы переместить ползунок вверх или по часовой стрелке, чтобы переместить его.
   5. Исправить оболочки к телу с помощью винта (размер 000-120 x 1/4).
2. Крепления зонда на микро привод.
   1. Исправить микро привод в горизонтальном положении под Микроскоп бинокулярный.
   2. Использовать плоский Аллигатор клип с резиновой прокладкой, чтобы захватить шлейфа зонда кремния, при этом тщательно отсоединение зонд из корпуса отгрузки с щипцами. Исправить Аллигатор клип манипулятора.
   3. С помощью манипулятора, заложить кремния зонд на ползунок микро привода, параллельно направлению движения.
   4. Применить капли стоматологического цемента (комнатной температуры полимеризации акрила Стоматологическая ремонт материала) исправить зонд для ползунка. Правильное положение зонда, если она изменилась. Клей не рекомендуется, поскольку он лечит очень быстро и делает ее трудно скорректировать положение электрода.
   5. Исправить разъему зонда к C-держатель (коннектор держатель) с стоматологического цемента.
3. Чистка и положить краску на зонд. Монтаж
   1. исправить Microdrive/зонд на зонд очистка устройства. Прибор оснащен 2 малых вращающихся пены губки (не стерильных тампонов). Отрегулируйте зазор манипулятором.
   2. Замочить губки с детергентами.
   3. Медленно перемещайте датчик вверх и вниз между губок, позволяя нежное прикосновение. Контролировать процесс очистки под микроскопом.
   4. Прополоскать зонд с дистиллированной водой. Окуните зонд в алкоголя для стерилизации.
   5. Применить Дил (липофильных флуоресцентных красителей) на задней части черенков зонд, с помощью пены тампоном. Это позволит в более поздней стадии визуализации хвостовик мест в головном мозге.
4. Сборка шляпа
   1. Печать части Хат (руководитель плита, коннектор держатель и Кап) ¹⁴ с помощью 3D-принтера. 3-х частей сочетаются друг с другом для формирования герметичный корпус.
   2. Вставка гайки (размер м2 и 00-90 00-90/4) в слоты головы пластины и исправить с клеем и стоматологического цемента.
   3. Вставить шайбу в слот крышку и закрепите стоматологического цемента.

2. Хирургия для фиксации шляпу на череп

все инструменты, используемые для хирургии стерилизовать путем автоклавирования. Бусины устройство сухого тепла используется Радитого, чтобы стерилизовать инструменты, которые загрязняются и необходимо стерилизовать во время операции.

1. Задать уровень изофлюрановая до 4% для начала наркоза. Поместите мышь в зале анестезии для 5 минут
2. Установить указатель мыши в стереотаксического аппарата.
3. Снизить уровень изофлюрановая до 1,5-2%. Отрегулируйте уровень во время операции по словам животных, частоту дыхания и тела температуры ²⁰.
4. Применять мазь глаза на глаз.
5. Бритья головы и очистить голову животного с антисептиком (iodopovidone). Поддержание асептических условий в течение всех этапов операции.
6. Придать бупивакаин (1 мг/кг) под кожу головы. Вырезать и удалить часть теменной кожи головы мыши, с помощью тонкой ножниц выставить череп на его краях. Используйте физиологического раствора и гемостатической губкой для очистки и контролировать кровотечение во время операции.
7. Удаление надкостницы, с помощью инструмента скребок.
8. Найти ориентиры на череп ²¹: bregma, лямбда, корональных и сагиттального шва. Настроить головку ' s, угол по сагиттальной оси таким образом, чтобы Bregma и lambda точки находятся на той же высоте.
9. Просверлить два (~0.5 мм диаметр) в черепе для ведения и местах электродов. Отверстия должны быть примерно 1 мм хвостовой и 1 мм бокового лямбда-выражения.
10. Вставить Справочник по городу и электроды (размер 000-120 000-120/16 миниатюрных нержавеющей стали винты проволока соединен разъема).
11. Применить ультрафиолетового (УФ) света связывающих дентин активатор на черепе и затем применять УФ света для 45-60 s.
12. Применить слой стоматологического цемента на краях черепа. Избежать распространения цемента на кожу и волосы мышей.
13. Головы-пластина для стереотаксического манипулятора и разместите его над черепа. Медленно опустите голову пластины до тех пор, пока она слегка трогает череп и применять стоматологического цемента на стыке с черепом. Пусть лечения стоматологического цемента на 15 мин
14. Удаление анестезии. Исправьте соединитель держатель и шапку на голову-пластину. Поместите мышь в своей клетке после давая подкожной инъекции ketaprofen 5 мг/кг
15. Дать подкожной инъекции ketaprofen 5 мг/кг для двух ближайших дней и монитор тщательно для каких-либо признаков боли. Мышь обычно просыпаюсь от анестезии в течение 20-40 мин. Шляпа имплантата является относительно света (3,34 г), такие, что мышей не имеют проблем поднять голову, запустить в лабиринты и подняться по краям их дома Кейдж.

3. Поведенческие обучение

1. после Послеоперационный восстановительный период 7 дней, запустите ограничение воды на 1 мл в день.
2. Сделать ремня беговой дорожки, вырезать кусок бархата (5 см на 1-2 м) и исправить мелкие предметы на его с помощью горячего клея. Прикрепить возводимых объектов на краях пояса, чтобы не мешать движению мыши.
3. Исправить пояса на колесах беговой дорожки, сшивания вместе двух концах.
4. Установить мыши, голова исправлена в беговой дорожки, вставляя и затянув два винта пластины головы в пазы головы фиксация пластиной.
5. Начала подготовку мыши для запуска головы задержанной на беговой дорожке для воды вознаграждение. Доставить воду вознаграждение через порт лизать. Первоначально, поместите мышь на беговой дорожке на периоды 10 мин, 3 раза в день.
6. Как мышь получает используется для фиксации головы и начинает двигаться пояса (обычно после ~ 3 дней), увеличение учебной сессии продолжительностью до 30 мин. После 2-3 недели, некоторые мыши запустить более чем 100 испытания в 30 мин (суда, будучи полное вращение пояса).
7. Выбрать мышей, показаны лучшие поведенческих спектакли для записи экспериментов.

4. Имплантация кремния зонда

1. Положите мышь под наркозом.
2. Установите мышь в стереотаксического аппарата путем фиксации головы пластины. Чистота поверхности черепа с saline.
3. Найти стереотаксического маркеры: bregma, лямбда, корональных и сагиттального шва. Измерить расстояние до точки вставки и Марк it.
4. Сверла кости тщательно до тех пор, пока она становится тонкой и прозрачной. Смочите и чистый с физиологического раствора в процессе бурения.
5. Осторожно снимите разбавленной кости и дура материи, с помощью силы точностиPS. Держать поверхности мозга мокрые с saline все время.
6. Исправить сборка зонд Microdrive/кремния для стереотаксического манипулятора. Принесите кремния зонд чуть выше краниотомии. Винт держателя соединитель зонд кремния для головы пластина.
7. Подключите усилитель и земли/Справочник электродов записи. Мышь с алюминиевой фольги для защиты от шума электро магнитного щита. Начало записи системы для мониторинга электрической активности мозга.
8. Медленно щуп кремния в мозг, используя микроманипулятор. Непрерывно проверить электрические сигналы, путешествовал манипулятора расстояние и хвостовик зонда (убедитесь, что они проникают в мозг). Деятельность является видимым в коре пока белого вещества под относительно молчит. Деятельность группы появляется когда черенки прикасаться пирамидальной слой гиппокампа. С этого момента, отозвать зонда 200 мкм кремния (используйте следующий день микро привод, довести хвостовик обратно в пирамидальной слой).
9. Покрытие поверхности головного мозга со смесью воска костей и минерального масла.
10. Исправить микро привод для головы плита с использованием стоматологического цемента. Пусть лечения стоматологического цемента на 15 мин. Затем отсоедините микро привод от стереотаксического манипулятора и наденьте шляпу обратно на.
11. Положите мыши обратно в его клетке и дать подкожной инъекции ketaprofen 5 мг/кг. Проверьте наличие любых признаков боли. Эта операция является гораздо менее инвазивна, чем первый и мышей обычно активны в течение 45 мин после того, как они пробуждения от анестезии. Однако, пусть мыши восстановить весь день, как кремний зонд необходимо стабилизировать в головном мозге.

5. Запись

1. установки мыши головы исправлена на беговой дорожке. Снять шляпу гл
2. Подключить усилитель записи и начните запись.
3. В первый день, используйте микро привод для перемещения зонда кремния в пирамидальной слой гиппокампа. Каждый поворот по часовой стрелке винт перемещает хвостовик 200 мкм глубже. Отрегулируйте положение хвостовик медленно (~ 20-50 мкм, в то время) до появления пульсации колебания ¹³ и единица активности.
4. В ближайшие дни, настроить положение голени и ждать ~ 1 час перед записью гиппокампа активность, в то время как мышь работает на поясе. Для поддержания качества сигнала хорошую запись на несколько дней, удалить жесткие объекты и низкий потолок от мыши ' s клетке, чтобы свести к минимуму вероятность шляпу натыкается на твердых поверхностях.

6. Восстановление зонд

1. Положите мышь под наркозом.
2. Установите мышь в стереотаксического аппарата путем фиксации головы пластины. Снять шляпу гл
3. Принесите стереотаксического манипулятор чуть выше микро привод. Исправьте микро привод манипулятора. Отвинтите держатель разъема от головы пластины. Удалите винт, соединяющий оболочки и тела микро-привода.
4. Под наблюдением бинокулярный микроскоп, медленно потяните вверх микро привод/кремния зонд сборка с стереотаксического манипулятора, оставив часть кожуха.
5. Почистить кремния с устройство очистки.

Результаты

Мышь был сначала обучить работать на два метра длиной пояса лишенный сигналы (рис. 1 c). После имплантации электродов, новый ремень той же длины, но представляя 3 пары подсказки был установлен на беговой дорожке, чтобы генерировать аллоцентрическом прост?...

Обсуждение

Хронический записи активности нейронов имеет решающее значение для понимания нервные процессы такие как гиппокампа место поля. Наш подход для выполнения хронических кремния зонд implantantation отличается от других методов^7,18,19,

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicon Probe	Neuronexus	Buzsabi32	Recording electrode
Recording system	Intantech	RHD2132/RHD2000
3D printer	Asiga	Pico Plus 27	High resolution printer for micro-drive
3D printer	Stratasys	Mojo	Lower resolution printer for hat components
Stereotaxic apparatus	Kopf	Model 963
Binocular microscope	Leica	M60
Treadmill apparatus			We build them