הערכת זרע דגים באמצעות תוכנה, התקני קירור

Summary

בפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך של דגים זרע הערכה באמצעות ניתוח המחשב בסיוע זרע, התקני קירור. התוכנה נותנת מהירה, מדויקת, ניתוח כמותי של איכות הזרע דגים בהתבסס על spermatozoa מורפולוגית, יכול להיות כלי שימושי חקלאות מים כדי לשפר את ההצלחה רבייה.

Abstract

להערכת איכות תא רבייה, ישנן טכניקות חדשניות, מהירה, כמותיים שיכול לספק נתונים שימושיים עבור חקלאות ימית. מערכות ממוחשבות לניתוח זרע פותחו כדי למדוד פרמטרים מספר, באחד נמדד בדרך כלל תנועתיות הזרע.

בתחילה, טכנולוגיית מחשב זה תוכנן עבור יונקים, למרות שזה יכול לשמש גם לצורך ניתוח זרע של דג. לדגים יש תכונות ספציפיות אשר יכולים להשפיע על זרע הערכה כגון זמן קצר תנועתיות לאחר ההפעלה ו, במקרים מסוימים, הסתגלות כדי להוריד את הטמפרטורה. לכן, זה הכרחי לשנות רכיבי תוכנה וחומרה לבצע ניתוח תנועתיות יעילה יותר לניתוח זרע של דג. לזרע יונקים, הצלחת חימום משמש כדי לשמור על טמפרטורות אופטימלית של spermatozoa. עם זאת, עבור כמה זני דגים, זה יתרון לשימוש בטמפרטורה נמוכה כדי להאריך את משך הזמן של תנועתיות, מאז הזרע להישאר פעיל למשך פחות מ 2 דקות. לכן, התקני הצינון יש צורך לקרר את דגימות בטמפרטורה קבועה על פני הזמן של ניתוח, כולל על המיקרוסקופ האופטי. פרוטוקול זה מתאר הניתוח של תנועתיות הזרע דגים באמצעות תוכנה לניתוח זרע וקירור חדש התקנים כדי למטב את התוצאות.

Introduction

היעילות של רבייה תלויה באיכות של שתי גמטות (ביצים, זרע)^1,2. . זה הגורם אשר תורם הפריה מוצלחת, ומאפשר התפתחות הצאצאים קיימא^3,4 הערכת איכות תא רבייה נוח הוא הכלי הטוב ביותר עבור הגדרת את פוטנציאל הפוריות של הדגימה.

ערבוב זרע מן הזכרים מרובים הוא מנהג נפוץ בייצור של מינים ימיים מסחריים רבים⁴. עם זאת, ההשתנות זרע בין הזכרים יכול להוביל זרע תחרות, כתוצאה מכך, לא כל הגברים באותה מידה תורמים מאגר הגנים⁵. במובן זה, הערכת הנכונות לפלוט בודדים/spermatozoa תכונות, כגון תנועתיות, הוא היסוד המפלה מידע לגבי פוריות הגבר בודדים פוטנציאליים. התבוננות תנועתיות הזרע יכול להפיק נתונים לא מדויקים ולא סובייקטיבי כפי שהוא דורש זמן וניסיון, מה שמוביל חוסר עקביות של אי-תאימות של תוצאות^6,7. עם זאת, ישנם טכניקות חדשניות, מהיר ולא כמותית רבות שיכול לספק^2,4ניתוח איכות הזרע אמין.

ניתוח המחשב בסיוע זרע פותחה להציע נתונים מדויקים לגבי איכות הזרע⁸. טכנולוגיה זו כוללת הפיתוח של תוכנה הקשורים עם מיקרוסקופ לעומת זאת שלב המאפשר להערכת תנועתיות הזרע. עם זאת, גורם מגביל של תנועתיות פרמטר הוא קצב המסגרות של מצלמת הוידאו. Spermatozoa בודדים מסלולים מבוססים על spermatozoa ראש centroid המיקום במסגרות רצופים של הקלטות וידאו, אשר הוא מתואם עם התנועה השוטוניים דפוסי^{3,9,10, 11}. הפרמטרים העיקריים קינטי נמדד הם מהירות הקו הישר (וי), מהירות לאכסדרות (צ'לו) נתיב ממוצע מהירות (ידינו). וי הוא המרחק בין נקודת המוצא מובילים שגבה את spermatozoa מחולק זמן. צ'לו היא המהירות האמיתית לאורך המסלול נלקחה על ידי spermatozoa. ידינו הוא המהירות לאורך נתיב מוחלקים נגזרת של המסלול. פרמטרים אלה מאפשרים פרטים קינטי נוספים, לרבות ליניאריות (לין), יושר (STR), התנודדות (WOB), מדידות מכות כמו משרעת של התנועה הראשי לרוחב (ALH) ו ביט-צלב תדר (BCF)^4,10.

מערכת ניתוח זרע ששימש במקור עבור יונקים, אחת הדרישות של המערכת לפעול טמפרטורת הגוף של התורם (כ 37 מעלות צלזיוס). תוכנה זו יכולה לשמש גם זני דגים; למרות, יש צורך לבצע כמה עיבודים כדי להפחית את השגיאה של תוצאות ניתוח זרע. במינים מסוימים דג ', כגון סלמונאיים: צלופח^8,12, ההפריה מתרחשת בטמפרטורה נמוכה (בסביבות 4 ° C)^2,4. לפיכך, התקני קירור צריכה להיות מפותחת כדי להימנע תנאי עבודה לא נוח. בנוסף, דג spermatozoa immotile בנוזל הזרע, לדרוש מכת אוסמוטי להפעלת תנועתיות. מים מתוקים מינים, המדיום activator צריך להיות osmolality היפוטוניק, בעוד מינים ימיים המדיום צריך להיות hypertonic. עם זאת, עבור מינים מסוימים, כמו סלמונאיים:, ריכוז יון יכול גם להיות חשוב^3,4,9. לאחר ההפעלה, דגים זרע מאופיין על ידי ירידה מהירה של תנועתיות (פחות מ- 2 דקות)^13,14 ו בדחיסות גבוהה, להיות חיוני כדי לקבוע את קצב המסגרות אופטימלית להשיג נתונים אמינים¹⁵.

מטרות המחקר הן לעצב וליישם מערכות קירור עבור דגימות זרע של דג. בנוסף, פרוטוקול זה מגדיר כיצד לקבוע את המחירים מסגרת אופטימלית עבור הקמת פרוטוקולים סטנדרטיים בהתאם למין. השימוש בפרוטוקול זה פותח דלתות חדשות בהקשר של הערכת הזרע דגים, משתמש הצלופח אירופה כמודל.

Protocol

נהלים בנושאים בעלי חיים מעורבים היו אישור (2015/VSC אפונה 00064) הכיוון הכללי של תוצרת חקלאית, משק-החי-València דה Politècnica Universitat.

1. איסוף זרע צלופחים בוגרים האירופית בשבי

הערה: שימוש צלופח האירופית זכרים בהשתתפות טנקים עם מי ים ומערכת recirculation בטמפרטורה קבועה (20 ° C). פנקו עם הורמונים באמצעות הזרקה בקרום הבטן שבועי (גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG); לכל g IU 1.5 ממשקל הגוף דגים). ואקלום דגים בהדרגה החל מ 3 ימים במים מתוקים ואחריו החלפה עם מי ים (1/3 של המים הכולל במיכל) כל יומיים עד שהגיע עם מליחות של 37.0 גר'/mL.

1. עזים ומתנגד הצלופח 24 שעות לאחר הזרקת הורמון להשיג דגימות עם איכות זרע טובה יותר.
   1. להכין מראש ההרדמה: להוסיף 300 מ"ג בנזוקאין 100 מ של 70% אתנול. מערבבים היטב ולאחסן ב 4 º C.
   2. לדלל בנזוקאין בדלי גמיש עם 5 L של מערכת מים בכדי לקבל ריכוז סופי של 60 מ ג/ליטר, מערבבים היטב.
   3. להעביר את הדגים הדלי עם מערכת מים, בנזוקאין. המתן מספר דקות עד דגים תירגע.
2. לנקות את אזור איברי המין עם מים ויבשה עם נייר סופג כדי למנוע זיהום של זרע דגימות צואה, שתן או מי-ים.
3. החל לחץ עדין באזור הבטן, לאסוף דגימות זרע לתוך צינורות פלסטיק 15 מ"ל באמצעות את משאבת ואקום. נפח הזרע עד 6-7 מ ל, בהתאם הזכר.
4. שמור דגימות זרע ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה עד תנועתיות ניתוח מבוצע.

2. להכניס למקרר ו לדלל את דגימות זרע

1. הכינו מראש את הפתרון כיום.
   הערה: דגימות זרע צריך להיות מדולל בפתרון ה-extender ספציפיים עבור כל המינים.
   1. היכונו המדיום-מפעיל דגימות זרע צלופח (P1 בינוני). הוסף 0.42 גר' נתרן ביקרבונט, 1.828 גר' נתרן כלורי, g 0.127 של מגנזיום כלוריד, 0.56 g של אשלגן כלורי, 0.037 גרם סידן כלורי עד 250 מ"ל של מים מזוקקים. מערבבים היטב כדי להמיס. חנות ב 4 º C.
2. הגדר את מגניבים הבלוק ב 4 ° C כדי לשמר דגימות בטמפרטורה קבועה. המתן עד מייצבת הטמפרטורה.
3. לדלל את דגימות זרע באמצעות כיום פתרון ייחודיים לכל מין.
   הערה: יחס דילול מינים ספציפיים, חייב להיות מוגדר כדי לתקנן את הפרוטוקול. ראשית, מעריכים ריכוז הזרע מבוסס על ריכוז שהושג בניתוח קדם תנועתיות באמצעות תוכנה, כמוסבר בשלבים 3 ו- 4. ניתוח זה, זה גם אפשרי לבחור את דגימות זרע הטוב ביותר בהתאם לאחוז תנועתיות. אחרי זה, החוקר יכול להתחיל לאסוף נתונים עבור הניסוי באמצעות את הדוגמאות הטובות ביותר עם הריכוז הנכון.
   1. לדלל צלופח דגימות זרע במדיום P1 עם יחס של 1:50. כדי להכין µL 500 של זרע צלופח מדולל, להוסיף 50 µL של דגימת זרע טרי ו- 450 µL של P1. מערבבים היטב.

3. להעריך את הפרמטרים תנועתיות הזרע

1. הגדרת המודול תנועתיות של התוכנה
   1. הבמה קריר ב 4 ° C והמתן עד זה מייצבת.
   2. פתח את התוכנה ובחר מודול תנועתיות. צור שם משתמש וסיסמה במידת הצורך.
   3. בחר מאפיינים ובחר את הפרמטרים הרצויים לפני תחילת הניתוח זרע.
      1. לחץ על מינים | דגים.
      2. בחר את מסגרות לכל השני ואת מספר תמונות, בהתאם לתנאי הטכני הטוב ביותר עבור כל המינים. הגדר שתי האפשרויות-120 תמונות לשניה.
      3. לבחור הניגוד השלילי. . זה הכרחי עבור שחזור מדויק של ה-מסלולים spermatozoa¹⁶.
      4. בחר את המקביל קאמרית סופר ואת קנה המידה של מצלמת הוידאו. כיילו את מצלמת הווידאו עבור העדשה ההגדלה המשמשים את הניסוי. הגדר SpermTrack10 כמו חדר הספירה ואת סולם X 10.
         הערה: באופן כללי, לעומק של 10 מיקרומטר בתא הספירה ו עדשה ההגדלה של 10 X הם התנאים המומלצת מכיוון שהם מספקים יותר התמקדות של כל spermatozoa וללכוד את המספר הגבוה ביותר של תאים. עם זאת, מומלץ לבצע מחקר קודם של התנאים האופטימלי לניתוח תנועתיות של כל מין.
      5. להתאים את אזור החלקיקים ואת קישוריות עבור כל המינים. הגדר אזור המינימלי חלקיקים ב 2 מיקרומטר² וקישוריות ל- 7 מיקרומטר.
         הערה: דגים, הערך המינימלי של חלקיקים באזור נעה בין 2-5 מיקרומטר וקישוריות תלוי את מהירות spermatozoa את קצב המסגרות.
      6. שמור את הסידור.
   4. בחר ללכוד.
2. לנתח את הזרע צלופח האירופית עם תוכנה
   1. הכינו את הפתרון activator (מי ים מלאכותי) על-ידי הוספת 0.946 גר' מלח מסחרי 25 מ ל מים מזוקקים עם 2% BSA.
   2. לקחת 500 מ"ל של פתרון activator (מי ים מלאכותי) ומניחים על המקפצה קריר יותר.
      הערה: באופן כללי, דגים זרע מופעל על-ידי אירוע שוק אוסמוטי, למרות עבור מינים מסוימים ריכוז יון יכול גם להיות חשוב. מים מתוקים מינים, המדיום activator צריך להיות osmolality היפוטוניק, בעוד מינים ימיים המדיום צריך להיות hypertonic.
   3. להכניס לחדר הספירה מתחת לבמה קירור ולחכות עד מייצבת הטמפרטורה עד 4 ° C.
   4. מערבבים את activator ואת הזרע מדולל להפעיל spermatozoa ולהתחיל את תנועתיות ההקלטה בין 5-10 s לאחר ההפעלה.
      1. לקחת 4 µL activator פתרון ומקום בתא ספירה.
      2. Homogenize בעדינות את הזרע מדולל ע י ניעור של microcentrifuge 3 פעמים כדי למנוע נזק בתאים spermatozoa.
      3. לקחת 0.5 µL של זרע מדולל, מערבבים עם activator, שים את המכסה בתא הספירה במהירות.
         הערה: שלב זה לא אמור לקחת יותר מ 5 s כדי להתחיל את הניתוח בהקדם האפשרי.
      4. להתמקד על תאים spermatozoa ולמצוא את האזור החזותי הטוב ביותר, אשר מוגדר על ידי מספר נמוך של spermatozoa (150-200 תאים) כדי להימנע יירוט בין תאים (איור משלים 1A). בחר ללכוד וידאו כדי להשיג את המסילה spermatozoa, אשר מופרדים לפי מהירות.
      5. בחר ללכוד כדי לקבל 3 עד 7 שדות, המהווים מרווח הזמן האופטימלי כדי להשיג את השתנות התחתון בתוצאות, והמשך כמו קודם. סרטי הרשומה עד 120 s אחר-הפעלה על מנת למנוע עיבוי על השער של תא ספירה.
      6. בחר יציאה כדי לקבל מראה כללי של כל השדות.

4. לקבל נתונים תנועתיות

1. בחר שדות | חלקית | שמור ובחרו שם קובץ. לחץ על שמור.
   הערה: הגיליון מספק ערכים אכזרי של נתונים חלקיים, תרשימים ותמונות של רצועות spermatozoa.
2. בחר נתונים כלליים | שם הקובץ | להציל את.
   הערה: הנתונים מספקים קינטי ערכים בודדים spermatozoa של כל השדות.

תוצאות

ניתוח של אפקט הזמן על תנועתיות הזרע

במקרה של הצלופח האירופית, האחוז של spermatozoa סטטי עלה מ 15 s ל 120 s לאחר ההפעלה (מ- 24.4% ל- 40.7%), ואת האחוז של ניידת spermatozoa מתקדמת ירד (מ 36.9% 20.9%) (איור 1A ו 1B). מבוסס על מהירות, spermatozoa תא...

Discussion

התוכנה ניתוח זרע בשימוש פרוטוקול זה שימש על ידי חוקרים ברחבי העולם עבור מינים שונים, כולל דגים. עם זאת, דגים יש מספר תכונות ספציפיות יכול להשפיע על ההערכה זרע. דגים spermatozoa הראו מהירות גבוהה ברגע של ההפעלה אשר מסרב במהירות, מוביל זמן קצר של תנועתיות לאחר ההפעלה. חוץ מזה, הטמפרטורה של רבייה היא...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Chorionic Gonadotropin	Argent Chemical Laboratories	hCG	Hormone
Benzocaine	Merck	E1501 Sigma	Anesthesia
sodium bicarbonate	Merck	S5761 Sigma	P1 medium
sodium chloride	Merck	1.06406 EMD Millipore	P1 medium
magnesium chloride	Merck	1374248 USP	P1 medium
potassium chloride	Merck	P3911-500G	P1 medium
calcium chloride	Merck	C7902-500G	P1 medium
commercial salt	Aqua Medic	Meersalz	Activator solution
BSA	Merck	05470 Sigma	Activator solution
Falcon tubes 15 ml	Merck	T1943-1000EA
Falcon tubes support	Merck	R5651-5EA
Eppendorfs	Merck	T9661-1000EA
Micropipet 20 µl	Gilson	PIPETMAN® Classic
Micropipet 10 µl	Merck	Z683787-1EA
Tips for micropipets 20 µl	Merck	Z740030-1000EA
Tips for micropipets 10 µl	Merck	Z740028-2000EA
Spermtrack	PROiSER	Counting chamber
TruMorph	PROiSER	TruMorph
Microscope UB 200i Serie	PROiSER	Microscope
Cooler plate	PROiSER		Prototype
Cooler block	PROiSER		Prototype
ISAS v1	PROiSER	ISAS	Software