Un modello In Vivo murino nervo sciatico di invasione perineurale

Riepilogo

Descriviamo un modello murino in vivo di invasione perineurale iniettando le cellule tumorali pancreatiche syngeneic nel nervo sciatico. Il modello consente per la quantificazione del grado di invasione del nervo e appoggia la indagine dei meccanismi cellulari e molecolari dell'invasione perineurale.

Abstract

Le cellule tumorali invadono nervi attraverso un processo chiamato invasione perineurale (PNI), in cui il cancro cellule proliferano e migrano nel microambiente del nervo. Questo tipo di invasione è esposto da una varietà di tipi di cancro e molto spesso è trovato nel cancro del pancreas. Le dimensioni microscopiche di fibre nervose all'interno del pancreas del mouse rende difficile in modelli murini di orthotopic lo studio del PNI. Qui, descriviamo un modello heterotopic in vivo di PNI, dove iniettiamo la linea cellulare di cancro del pancreas syngeneic Panc02-H7 nel nervo sciatico murino. In questo modello, nervi sciatici dei topi anestetizzati sono esposti e iniettati con le cellule tumorali. Le cellule tumorali invadono nei nervi prossimalmente verso il midollo spinale dal punto di iniezione. Il nervo sciatico invaso vengono poi estratti e trattato con OCT per sezionamento congelati. H & E e colorazione di immunofluorescenza di queste sezioni permettono di quantificazione di entrambi il grado di invasione e cambiamenti nell'espressione della proteina. Questo modello può essere applicato ad una varietà di studi su PNI data la sua versatilità. Utilizzando topi con diverse modificazioni genetiche e/o diversi tipi di cellule tumorali permette di indagine dei meccanismi cellulari e molecolari di PNI e per diversi tipi di cancro. Inoltre, gli effetti di agenti terapeutici sulla invasione del nervo possono essere studiati mediante l'applicazione di trattamento a questi topi.

Introduzione

I nervi formano un microambiente tumorale specifico che stimola il cancro crescita e migrazione^1,2,3. Invasione perineurale (PNI) è il processo attraverso cui il cancro cellule invadono in e intorno ai nervi. Può essere considerato come un unico itinerario della metastasi dall'invasione tumorale estende lontano dai siti di origine lungo i nervi. PNI è trovato in molti tipi di cancro tra cui testa del pancreas, della prostata & collo, salivario, cervicale e cancri colorettali con un'incidenza che varia da 22% a 100%^1,2. PNI è associato con dolore e correla con la prognosi difficile e peggio sopravvivenza tariffe^1,2.

Sviluppo di modelli di invasione perineurale è essenziale per delucidare i meccanismi cellulari e molecolari di questo processo e per candidati agenti terapeutici per ridurre PNI di test. Metodi in vitro di studiare le interazioni tra tumori e nervi comprendono la co-coltura delle cellule tumorali con nervo espianti⁴, con radice dorsale i gangli^5,6,7o con celle specifiche dal nervo microambiente come Schwann cells⁷. In vivo gli approcci, tuttavia, sono più fisiologicamente rilevanti, includono l'uso di modelli murini di cancro in cui il cancro è stato indotto o trapiantato e hanno il vantaggio di contabilità per il microambiente intero nervo. In orthotopic modelli di cancro del pancreas o della prostata, PNI è stato segnalato^8,9,10 e l'incidenza delle PNI può essere registrata, ma a causa delle piccole dimensioni dei nervi in quegli organi, è difficile da vedere l'intero nervo e quindi per quantificare l'entità del PNI. Il modello che qui descritto è un modello in vivo di PNI in cui il cancro le cellule vengono iniettate nel nervo sciatico dei topi tramite un semplice intervento chirurgico¹¹. Il trapianto heterotopic invade all'interno del nervo verso il midollo spinale. La lunghezza dell'invasione del nervo dal sito di iniezione al midollo spinale può essere misurata, così come il volume del cancro all'interno del nervo. D'importanza, il nervo invaso possa essere raccolti anche per una varietà di analisi compreso analisi microscopiche e molecolare. Una varietà di cellule tumorali possa essere testata, e i topi di host che sono stati geneticamente modificati o trattati con composti specifici possono essere usati pure. Questo potente test permette di essere modificate per indagine sui meccanismi di PNI per le cellule tumorali e il microambiente di host.

Protocollo

Tutte le procedure con soggetti di animali sono state approvate dal comitato di uso al Memorial Sloan Kettering Cancer Center e istituzionali Animal Care.

1. preparazione delle cellule tumorali

1. Raccolta cellule Panc02-H7 Sub-confluenti con tripsina 0,25% per 5 min a 37 ° C. Raccogliere le cellule in una provetta da centrifuga da 15 mL.
   Nota: Le cellule sono coltivate in pallone a T-225, che contiene circa 12 x 10⁶ cellule per beuta a confluency di 80% e la tripsina 4ml / boccetta è usato.
2. Centrifugare le cellule a x 900 g a 4° C per 5 min, lavare le cellule da Risospendere la cella a pellet in 1 mL di PBS (pipettando su e giù due volte) e trasferire la sospensione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL sul ghiaccio.
3. Centrifugare le cellule nuovamente alle x 900 g a 4° C per 5 min e scartare il sopranatante senza disturbare il pellet. Mantenere le cellule pellettate su ghiaccio fino a iniezione.

2. preparazione dei topi e chirurgia

Nota: topi C57BL/6J 8-settimana-vecchi, maschi e femmine vengono utilizzati in questo studio. Le condizioni di chirurgia IACUC alle regole della nostra istituzione. Gli strumenti sono sterilizzati, la superficie di lavoro chirurgico viene disinfettata, l'animale viene disinfettata e il chirurgo indossa guanti sterili.

1. Il giorno prima della chirurgia, anestetizzare il mouse usando 2% isoflurane e quindi rimuovere il pelo lungo la lunghezza del femore sul lato dorsale con un rasoio sottile o un agente di rimozione dei capelli chimici.
2. Il giorno dell'intervento chirurgico, anestetizzare i topi utilizzando 2% isofluorano in un'aula di induzione. Confermare l'amputate da uno stimolo di pizzico di punta e una mancanza di risposta.
3. Applicare unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza sotto anestesia.
4. Posizionare il mouse anestetizzato sul lato ventrale e fissare delicatamente ogni arto con nastro ipoallergenico per creare leggera tensione dell'arto deve essere iniettato. L'anestesia è effettuata utilizzando isoflurano consegnato tramite un vaporizzatore di precisione e il cono di naso.
5. Pulire il sito di iniezione con Betadine, poi di nuovo con alcool al 70%. Ripetere questo processo due volte. Assicurarsi che nessun capelli sciolti rimangono il campo chirurgico.
6. Praticare un'incisione di 1 cm con piccole forbici circa 2 mm di sotto e parallelo al femore. Ritirare la pelle con il forcipe lateralmente per esporre i muscoli sotto.
7. Il nervo sciatico viene eseguito profondo ai muscoli grande gluteo e bicipite femorale. Separare questi due muscoli lungo un piano fascia con piccole forbici ed esporre il nervo sciatico sotto. Liberare il nervo dai muscoli circostanti mediante dissezione smussa.
8. Disegnare 3 μL di cancro cellule (circa 50.000) dal pellet in una siringa da 10 μL.
   Nota: In alternativa, disegnare 3 μL di PBS come controllo.
9. Posto una piccola spatola di metallo sotto il nervo nel punto di iniezione per il supporto. Nell'ambito di visualizzazione con un microscopio da dissezione, inserire l'ago il nervo contro la base in metallo, mantenendo l'ago come parallelo al nervo possibile al momento dell'inserimento. Fare attenzione a non forare attraverso la parte posteriore del nervo. Ridurre al minimo la manipolazione del nervo per quanto possibile nel corso di questo processo.
10. Iniettare lentamente il nervo oltre 5 s. Una formazione di una lampadina nella zona di iniezione indica una bella iniezione. Quindi lasciare l'ago nel posto per 3 s prima di rimuovere l'ago delicatamente. Mantenere l'ago in posizione per 3 s minimizza il riflusso delle cellule fuori il nervo.
    Nota: L'iniezione può essere eseguita verso il distale del nervo o del midollo spinale. È importante rimanere coerenti all'interno di un set di esperimenti. Se le cellule fuoriuscire all'esterno, l'animale non deve essere incluso nell'analisi dell'esperimento. Con esperienza, questi eventi sono molto rari.
11. Restituire il nervo nella sua posizione originale. Coprire il nervo con i muscoli sovrastanti. Trattare i topi con analgesia adeguata e quindi chiudere la pelle con i suturare di Nylon 5-0.
12. Posizionare il mouse da solo in una gabbia pulita per osservazione durante il recupero, fino a che completamente si risveglia dall'anestesia.
    Nota: Ci vogliono 5-15 min per l'animale a ritrovare la piena consapevolezza. L'animale non viene lasciato incustodito fino a quando ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale. L'animale non viene restituito alla compagnia di altri animali fino a quando completamente recuperato. Da allora in poi, valutare il recupero almeno una volta ogni 24 h per 72 h.

3. nervo sciatico estrazione

1. Il giorno del postop #7, eutanasia i topi con CO₂. Posizionare il mouse sul lato ventrale e stabilizzare gli arti distali con perni.
2. Togliere la pelle dal lato dorsale dell'arto iniettato e torso.
3. Mediante dissezione smussa, esporre il nervo sciatico profondo ai muscoli.
4. I corsi del nervo tra l'ileo e l'osso sacro. Per avere accesso al nervo alla regione del midollo spinale, separare le due ossa. Inserire prima le forbici chiuse nella ristretta area in cui si trova il nervo sciatico e quindi aprire le forbici tenendo il mouse. Essere delicato e mantenere l'integrità del nervo sciatico durante la dissezione.
5. Accuratamente sezionare il nervo sciatico distalmente alla fine del femore e prossimalmente al midollo spinale.
6. Nota: Invaso i nervi sono estremamente fragili e inclini a rottura sotto tensione o di forte manipolazione.
7. Vendemmia del nervo dal primo taglio sua estremità distale. Sollevare con cautela il nervo mentre liberandola dal tessuto adiacente. Tagliare il nervo all'estremità prossimale, più vicino possibile alla sua uscita dalla colonna vertebrale.
8. Registrare quindi lordo lunghezza dell'invasione utilizzando un calibro a corsoio. Questa valutazione macroscopica è solo indicativa.

4. elaborazione e quantificazione del nervo

1. Incorporare il nervo sezionato in OCT composto. Fare attenzione a posizionare i nervi longitudinalmente e come piatto sul fondo dello stampo come possibile.
2. Indicare sulla cassetta lato prossimale e distale del nervo contrassegnando la lettera P e D.
3. Posto nervi incorporati sulla cima di ghiaccio secco, se essi non vengono sezionate immediatamente. Campione può essere conservato a-80 ° C per diverse settimane.
4. Esempi di sezione utilizzando un microtomo criostato a 5 μm di spessore e posto sezioni sulle lastre di vetro. Se possibile, montare 2 sezioni del nervo per ogni diapositiva. Indicare lato prossimale del nervo.
5. Macchia di diapositive utilizzando H & E¹²di colorazione.
6. Scansione digitale sezioni macchiate del nervo con un-scanner per diapositive che fornisce dati digitali ad alta risoluzione.
7. Utilizzando il software di imaging, quantificare la lunghezza dell'invasione facendo clic sul pulsante di distanza di misura, desiderato zona di invasione, o altri parametri. Per una buona stima della lunghezza dell'invasione, utilizzare più sezioni (da 2 a 4) del nervo stesso.

Risultati

Questo metodo viene descritto l'impianto chirurgico di cellule di cancro al pancreas nel nervo sciatico murino per creare un modello in vivo di invasione del nervo quantificabili. La figura 1 illustra la posizione anatomica del nervo sciatico e il sito di iniezione. La figura 2 Mostra i due nervi sciatici di un topo nudo. Un nervo di PBS iniettato (a sinistra) può essere paragonato ad un nervo iniettato con cellule tum...

Discussione

In questo protocollo viene descritto un modello murino in vivo dell'invasione perineurale che permette per la quantificazione del nervo sciatico invasione dalle cellule di cancro del pancreas. Questo modello permette lo studio dei meccanismi molecolari dell'invasione del nervo. Esperimenti riusciti utilizzando questa tecnica richiedono un approccio attento a tre passaggi critici nel processo: 1) l'iniezione delle cellule tumorali (passi 2.7, 2.8), 2) l'estrazione dei nervi invasi (punto 3.4) e 3) elaborazione de...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse			Number and age variable depending on experimental needs
Cell culture media (PBS, Trypsin, and DMEM+10% FBS)	Any		Steps 1.1, 1.2, 1.3.
Conical centrifuge tube, 50 mL	Falcon	352098	Step 1.1
Microcentrifuge tube 1.5 mL	Axygen	MCT-150-C-S	Step 1.2
Electric razor	WAHL	9962	Step 2.1. Can be substituted with commercial hair removal agent
Isoflurane, 250 mL	Baxter	1001936060	Step 2.2
Hypoallergenic surgical tape	3M Blenderm	70200419342	Step 2.3
Betadine Swapsticks	PDI	SKU 41350	Step 2.4
Webcol Alcohol Preps	Covidien	5110	Step 2.4
Sterile surgical tools (scissors and forceps)			Steps 2.4, 2.5, 3.3, 3.4, 3.5
10 μL Hamilton syringe	Hamilton	80308	Steps 2.7, 2.8
Steel Micro spatula	Fisher Scientific	S50823	Step 2.7
Dissecting microscope			Step 2.7
Bupivacine, 1 g	Enzo Life Sciences	BML-NA139-0001	Step 2.9. Reconstitute to 0.5%
5-0 Nylon suture	Ethicon	698H	Step 2.9
Tissue-Tek O.C.T. Compound	VWR	25608-930	Step 4.1
Tissue-Tek Cryomold Molds	VWR	25608-916	Step 4.1