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要約

この記事で経済的、最適化、および単純なプロトコルは、エバンス ブルー色素法を使用して他の株、種と他の臓器や組織での使用に適応することができます FVBN マウスの臓器に血漿漏出を評価するため説明します。

要約

血管漏出または血漿漏出の原因の数があり深刻な結果や炎症反応の症状があります。本研究は、原因に関する新しい知識や抑制または血漿漏出を治療する新しい方法に最終的につながる可能性があります。研究者が血漿漏出を勉強するため、利用可能な最善の方法をなど、適切なツールを持つことが重要です。この記事では FVBN マウスの臓器に血漿漏出を評価するためエバンス ブルー色素メソッドを使用して、プロトコルを説明します。このプロトコルは意図的にシンプルに偉大な可能な限り程度が高品質データを提供します。主に使用する平均の所の簡単だ、エバンス ブルー色素を選ばれています。私たちは、酵素ネプリライシンが血漿漏出に対して血管を保護するかもしれないこと仮説の証拠とサポートを提供するためにこのプロトコルを使用しています。ただし、このプロトコルが実験的に使用されマウスの他の系統や他の種の多くの異なる器官またはティッシュの使用研究の理解、予防、または治療に重要な他の要因を伴う可能性がありますに適合しやすい血漿漏出。このプロトコルは広範囲に最適化されているし、既存のプロトコルと組み合わせた信頼性から変更、使いやすさ、経済、そしてこのプロトコルで使用する平均の所の優れたを作る機材の一般の可用性臓器から血漿漏出を定量化します。

概要

臓器に血管漏出は、血管外漏出、または血漿の血管内皮細胞で生産の隙間からの漏れは臓器の毛細血管細静脈を投稿します。この血漿漏出、または炎症性応答のいくつかのタイプから生じる、増加の血管透過性重大な結果があります。したがって、この現象、その原因、変調器、および結果は、研究し、理解と同様に、調査官が良い持っているツールやプロトコルが重要ですそれらを勉強します。内皮ギャップ数刺激によって作られるが、通常、ペプチド神経伝達物質タキキニン、内皮細胞上のアクションによって生成されます。Undecapeptide タキキニン神経ペプチド、サブスタンス P1増加血漿漏出の結果、このプロセスの主要な自然発生するメディエーターの一つです。

エバンス ブルー色素のアルブミン結合プロパティを使用して、調査し、血管透過性亢進や血漿漏出を測定する方法が開発されているし、通常その精度、シンプルさ、経済、安全と許可する機能のために知られている、一度に、いくつかの組織から血漿漏出による場合は希望2,3,4,5,6,7,8,9.FVBN マウスの臓器に血漿漏出を評価するためには、このエバンス ブルー プロトコルはこれらのすべてを使用しますが、一般的に役に立つと、又は平均の実験室を含む、将来の研究に適応できるように、いくつかの重要な変更を追加血漿漏出または血管透過性と関連因子の重要な研究を実施します。このプロトコルでは、サブスタンス P が 1 nmol/kg、1.5 倍による血漿の血管外漏出を強化するマウスを紹介します。これはより簡単に観測し、得られる結果の結果、プロトコルの感度を増加します。その他種々 のペプチドを化学物質、毒性傷害のいくつかのフォームなどの透磁率に影響を与えるその他の要因を使用または必要に応じて、その他の研究所で研究します。頚静脈注射は、ターミナルの手術を必要とする全身、エバンス ブルーとサブスタンス P を紹介するこのプロトコルで使用されます。ただし、頚静脈注射5,7,10、必要なターミナル手術手技を考慮した後も易くマスター、他よりもより一貫した結果の生産につながる尾を含む静脈注射、静脈注射4,9。レトロな軌道静脈洞注射によって配信されるブルー ・ エヴァンスのそれは可能ですが、参照文献の見つかっていないこのエバンス ブルーの配信方法を使用します。ただし、尾静脈注射については高度な専門知識と再現性をもって大きくこのテクニックをマスターする練習は成功したエバンス ブルー注射での使用を制限します。対照的に、代替の頚静脈注入法のプロトコルで説明するようソリューションを提供技術的に得られる。マウスの静脈の血流の重要な手順は、エバンス ブルー潅流マウスの犠牲余分なエバンス ブルー色素を削除し、このプロトコルで標準化された直後後に実行されます。灌流の上記の方法は注意深く検討され現在の手順を取得するように変更します。ここで説明したその他の変更はすべて最適化された、簡単で安価です。

エバンス ブルー色素法のいくつかの重要な制限事項があります。たとえば、低感度時このメソッドに関連付けられているは、いくつか追加総病理組織学的および組織学的検討エバンス ブルーを注入した動物からのティッシュを防ぐことができます。ただし、これらやその他の制限は、別の方法と、それにもかかわらず、まだエバンス ブルーを使用するモデルの開発につながっています。エバンス ブルーの測定 (視覚範囲ではなく) 蛍光分光法は方法の感度を高める可能性があります。さらに、複数の別個の場所11血管漏出の観察を許可するエバンス ブルー染色組織の蛍光顕微鏡が開発されました。また、全身イメージングし生きている動物のスキャン以前エバンス ブルー12により継続的に、エバンス ブルーの濃度の調査のための注入ではなく実験の時点で 1 つの特定の時間を選択。ただし、このメソッドは適切なイメージング施設の可用性を必要とする、非常に高価になることがあります。エバンス ブルー、モデルの体外型で行われますを含む変更などセルの文化またはニワトリ漿モデル13 (CAM) も記載されています。これらのモデル蛍光と生体14顕微鏡によって監視されると時間をかけて血管透過性変化の定量化を許可するが、生体内での条件の正確なモデリングに関する質問を上げるかもしれないし、もあります。高価です。

他のメソッドは、エバンス ブルーの管理を伴わない決定し、血管漏出または透過性を定量化するために開発されています。これらのメソッドを使用するかもしれません (アルブミン、フルオレセインなど)、適切な蛍光分子または生きている動物に、同位体標識あるいはタグ分子 (または文化または漿 (CAM) をセルにモデル13、非侵襲的に続いてイメージング (PET スキャン、MRI、生体顕微鏡観察、全身スキャン) または侵襲的イメージング (蛍光顕微鏡)3,12,15。これらの技術は、青いメソッド エヴァンス他上の利点の多数を提供可能性がありますがまた彼らのかなりの複雑さ、必要な専門知識、リソース、および金銭的コストが高いなど欠点があります。

ネプリライシン16 (ペプチダーゼ酵素ネップ、cd 10、MME、またはエンケファリナーゼとして知られている) 酵素代謝や内因性物質 p の不活性化の部分で少なくとも血漿漏出を抑制に関与することが示唆されています。したがって、セル表面ペプチダーゼ ネップが発生した組織でありますネップのペプチダーゼの活動によっておそらくのサブスタンス P の効果の減衰

当初、このエバンス ブルーの修正されたプロトコル FVBN 野生型 (WT) とネップ ノックアウト (KO) マウスを用いたサブスタンス P 誘発される血漿漏出テスト。これらの初期の研究からサブスタンス P 増強血漿漏出にネップの関与が疑われ、これらについて説明を行い, さらに血漿漏出に伴うネップの役割を実験.しかし、本稿の焦点ではないネップまたは血漿漏出におけるその役割、血漿漏出が彼ら自身を実験ではなく。ネップの結果がこの修正されたプロトコルの使用によって得られる結果の種類です。血漿漏出を測定するエバンス ブルー メソッドを最適化されており、FVBN マウスの下に詳細の記載に従って変更します。

プロトコル

ケアと動物 (マウス) の使用のためのすべての該当する国際、国家、および/または制度ガイドラインは、本稿に記載されている実験に続いていた。

このメソッドは、FVBN アダルト マウス、本研究の目的のために最適なこと判明した 16-20 週、高齢者を使用します。日 1、手順 1-5、日 2 には手順 6-7 (図 1) が含まれます。

1. 機器の準備

  1. (推奨) とケタミン ・ キシラジンは麻酔薬として使用される場合は、滅菌、使い捨ての注射器や針の十分な供給を確保します。イソフルラン麻酔薬として使用する場合は、酸素タンクとイソフルラン麻酔開始前に実験のための十分な供給があることを確認するための流体のレベルを確認します。また、ノーズ呼吸回路を組み立てるし、誘導ボックスにそれらを添付新しい炭缶を呼吸回路に接続します。第二段階が約 50 psi を読み取っていることを見極め、酸素をオンして誘導ボックスを準備します。
  2. 37 ° C に加熱パッドをオンに
  3. 手術用直腸温度プローブを準備します。

2. マウス作製

この手順には、麻酔、脱毛、(大人 FVBN マウス-年齢 16-20 週) の配置が含まれます。

  1. マウスの重量を量る、重量を記録します。
  2. マウスを麻酔します。
    1. ケタミン ・ キシラジンの IP を管理 (80-100 mg/kg と 7.5-16 mg/kg、それぞれ)。ただし、低用量ケタミン ・ キシラジンで始まるお勧め (30 mg/kg の 6 mg/kg、それぞれ)。
    2. 約 0.1 で麻酔を維持する-0.25 倍初期用量ケタミン ・ キシラジン手術中の。ケタミン ・ キシラジンより再現性と生存性が認められたこの特定の研究の選択の麻酔エージェントをだった。他の研究で選択の麻酔エージェントは異なることが見つけられるかもしれません。 イソフルランを使用する場合、誘導の部屋にマウスを置くし、マウスは完全な意識を失うまでに 5% にイソフルランをオンに。設定手順の残り 1.5 2.5% イソフルラン鼻ノーズを使用します。
  3. 適切な麻酔深度をチェックするつま先ピンチしてマウスすべての 2 〜 3 分を監視します。
  4. マウスの腹側頸部領域を剃る。
  5. 予熱のパッドの上に仰臥位にマウスを配置します。足とテープで手術の表面には、マウスの足を保護します。
  6. 手術中に完全に乾くことを防ぐために目の上に人工涙軟膏を配置します。

3. 手術の詳細

  1. 頚静脈上右腹側の首で 1 cm の切開を行います。
  2. 痛みの管理と血管拡張を促進するために切開領域にリドカイン (1-2%) の 1 つまたは 2 つの滴を適用します。有効にするリドカイン 2 分を待ちます。
  3. 公開、鈍的切離を介して右内頚静脈を隔離します。4-0 縫合糸で静脈を縛るし、優しく、止血の容器の吻側端を撤回します。静脈径の中ほど高級はさみ、約 3 mm 以下または、ネクタイに尾を使用して、穴を開けます。
  4. 太陽光発電 1 ポリビニル カテーテル端から 1.5 cm をマークし、容器散大を使用して穴を頸静脈に挿入スレッドの容器、約 1.5 cm の尾側に向かってカテーテル。
  5. 4-0 絹と尾部 (カット) ・下容器の内で安全にカテーテルを結ぶ。手順 3.3 では、吻側の頚静脈を縛るに使用された縫合糸の宙ぶらりんでカテーテルの外側を容器の吻側部を結ぶ。
  6. 鋲皮は緩く体熱の損失と組織の乾燥を防ぐために 4-0 絹とカテーテルの周り再び一緒に。
  7. ヘパリン生理食塩水 (10 U/mL) の入った注射にカテーテルを接続し、カテーテルをフラッシュします。

4. 注射

  1. 続いてラインをフラッシュするヘパリン生理食塩水の量が少ない、頸静脈カテーテルにエバンス ブルー溶液 (0.9%、通常の unheparinized 生理食塩水、または約 50 mg/kg で 30 mg/mL の溶液 50 μ L) を注入します。
  2. 2 分後、サブスタンス P (0.9%、通常の unheparinized 生理食塩水、または 1 nmol/kg で 0.3 μ M 溶液 100 μ L)、続いてラインをフラッシュするヘパリン生理食塩水の少量を注入します。サブスタンス P 増強内皮層による血漿タンパク質の血管外漏出このプロトコルではそれは日常的に血管外漏出の値を簡単に測るプラズマを作るプラズマ血管外漏出値の約 1.5 倍の増強を誘導します。
  3. サブスタンス P を注入後、18 分を待ちます。この間、エバンス ブルー色素は平衡、循環します。
  4. サブスタンス P (エバンス ブルー注射後 20 分) の注入後頚部転位とマウスを犠牲にして 18 分実験を終了します。マウスが直接占拠にすることができます、そうだ脱臼、最初は麻酔薬の過剰摂取を与えることがなくマウスとしてはおそらくまだよく麻酔手術から。しかし、それが必要な場合、麻酔薬ケタミン ・ キシラジン、イソフルラン、またはペントバルビ タールの過剰摂取が与えられる、頚部転位が続きます。

5. 器官の分離

  1. マウスの胸の空洞を開いてカットし、重力-灌流 (約 51 cm または 20 インチの高さ) から心臓や血管 50 mM クエン酸ナトリウム、pH 3.5 の 50 mL の。pH 3.5 はおそらくアルブミンにエバンス ブルー バインドを保持します。
  2. 1-5 関係機関 (組織) を (例えば膀胱、腎臓、胃、肝臓、膵臓、近位または遠位結腸、回腸、十二指腸、側面皮膚、耳、尾、心、および/または肺) 解剖メスを消費税し、任意の残留の内容を削除する場合現在。
  3. 部屋の温度 (RT) リン酸緩衝生理食塩水 (PBS; ナ2HPO4、KH2PO4、8.0 g 0.24 g, 塩化ナトリウムの 1.44 g と 1 L、pH 7.4 の KCl の 0.20 g) で臓器をすすいでください。
  4. しみの組織と臓器、各器官は、半分にカット、それぞれの半分の重量を量る (g の重みを濡れている)。
  5. 1 つを乾燥乾燥オーブン 150 ° C、箔、48 h で組織の半分。
  6. 半分、および microfuge を順にフォルムアミドの一貫性のあるボリューム (最大 200 μ L) でチューブ 48 h (と最大 72 h) 他のティッシュを置きエバンス ブルーを抽出します。

6. 組織外径の測定

  1. および microfuge の管場所からポリスチレン 96 ウェル プレートの 1 つのウェルにエバンス ブルー注入フォルムアミド (48-72 時間 RT 培養) の後の 50 μ L を削除します。ホルムアミドと共に組織部分を転送しないように注意します。
  2. 空白の 96 ウェル プレートの 2 つの空井戸のそれぞれに新しい、純粋なフォルムアミドの場所 50 μ L。
  3. 測定し、各ウェルの吸光プレート リーダーに 96 ウェル プレートの外径620を記録します。620 nm 吸光度は、エバンス ブルーの最大。

7. 血漿漏出の計算

  1. 乾のティッシュ ペーパーの重さ半分の 48 時間のオーブンでされています。
  2. 特定臓器それぞれ個々 のマウス、半分この組織の湿重量で始まる (で得られたステップ 5.4) からの興味の半分この同じ組織の乾燥重量で割った値 (7.1 で得られたステップ) のぬれた重量/乾燥重量比を計算します。
  3. 組織の乾燥重量 (g) の前に、半分は濡れてフォルムアミド (ステップ 5.4 で得られた) に置かれていた組織の湿重量で割ってホルムアミドの半分を計算: (7.2 の手順で計算される) 興味の特定の臓器の乾燥重量比。
  4. 外径620の補正値を計算します。外径620から始まる (6.3 の手順で得られた各組織からエバンス ブルー注入フォルムアミドを含んでいる) 96 ウェル プレートの各実験の井戸から値減算空白も OD620値 (外径620の平均値純粋なフォルムアミド、6.2 の手順で準備を含んでいる 2 つの井戸は、6.3 の手順で取得した値は620 OD) 各実験値から。
  5. フォルムアミド (7.3 で計算されるステップ) で半分修正外径620 (7.4 で計算されるステップ) を組織の乾燥重量で除してプラズマ血管外漏出値を計算します。血漿漏出の単位は外径620/g 乾燥重量になります。
  6. データを分析し、平均 ± SEM. 統計的に比較 Scheffé の複数比較テスト (lycofs01.lycoming.edu)、適切な一方向の分散分析や t 検定によってグループを表現します。

結果

図 1では手順の概略が表示されます、最も信頼性の高い、一貫性のあるサブスタンス P 誘起プラズマの血管外漏出値 FVBN マウスの臓器から発生するが検出されてきた。この手順は通常、仕事の待機時間の少なくとも 48 時間で区切られた 2 日をかかります。一貫してすべての実験を比較するこれはさらに多く普及することが可能です。たとえば、?...

ディスカッション

前述したように、血漿漏出に関する研究が最終的の原因に関する新しい知識や抑制または血漿漏出を治療する新しい方法に します。(上記)、血漿の血管外漏出プロトコルの使用の成功は、現在原稿で実証されているエバンス ブルー色素を用いたします。示されているデータもバックアップにネップが血管を保護するかもしれないこと仮説血漿漏出に対してこれは、第二の目的現在、主要目的...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者貴重な支援とこの原稿を編集アンディ Poczobutt、博士 Jori Leszczynski を感謝したいです。 国立心臓、肺および血の協会 (NHLBI RO1 HL078929、PPG HL014985 と RO3 HL095439) 退役軍人省問題 (メリット レビュー) から受け取った補助金によってサポートされています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
isofluraneVet One200-070inhaled anesthetic
ketamineVet One200-055injectable anesthetic
xylazineLloyd Laboratories139-236injectable anesthetic
syringes (10,3 & 1 cc)Becton Dickinson309604, 309657, 309659
needles (20G1,23G1 & 26G1/2)Becton Dickinson305178, 305193, 305111
isoflurane induction chamberVetEquip9414431 Liter
nosecone breathing circuits VetEquipRC2Rodent Circuit Controller 2
oxygen tankAirgasUN 1072100% medical
heating padCWE Inc.TC-1000temperature controller
rectal temperature probeCWE Inc.10-09012mouse
balance (for rodents)OhausCS 2000
surgical tools-scissorsFine Science tools15000-00Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels)  
surgical tools-forcepsFine Science tools11151-10Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels)
surgical tools-hemostatsFine Science tools13009-12Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue)
surgical tools -suture driversFine Science tools12502-12Olsen-Hegar suture drivers (suturing)
surgical tools-forcepsFine Science tools11627-12Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat)
surgical tools-scissorsFine Science tools14110-15Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat)
surgical tools-forcepsFine Science tools18025-10suture tying forceps (used for Millar cath)
surgical tools-scissorsFine Science tools14078-10Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse)
surgical tools-forcepsFine Science tools11254-20Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection)
surgical tools-scissorsFine Science tools14082-09Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse)
surgical tools-forcepsFine Science tools11051-1010 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse)
surgical tools-forcepsFine Science tools11251-35Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels)
surgical tools-retractorsFine Science tools17012-11Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical)
surgical tools-forcepsFine Science tools11294-00Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice)
surgical tools-forcepsFine Science tools11297-00Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection)
surgical tools-scissorsFine Science tools14058-11tough cut iris scissors (mouse dissection, bones)
surgical tools-forcepsFine Science tools11009-13serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat)
surgical tools-hemostatsFine Science tools13003-10Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue)
surgical tools-forcepsFine Science tools11006-12Adson serrated forceps (tissue grasping)
clippersOsterA5
tapeFisherbrand159015G
artificial tear ointmentAkorn Inc13985-600-03
lidocaineHospira0409-4277-012% injectable
polyvinyl cathetersTygonPV-1
Evans blueSigma AldrichE2129
Substance PBachem H-1890
heparinSagent Pharmaceuticals25201-400-101000 U/ml
saline solutionHospira0409-7138-090.9% sodium chloride
phenobarbital Vortech0298-9373-68
sodium citrateFisher ScientificBP327-1
PBSSigma AldrichP4417-50TAB 
Kimwipes for blottingFisher Scientific06-666A
formamideSigma Aldrich47670
microbalanceDenver InstrumentAPX-60
microfuge tubesFisher Scientific07-200-534
polystyrene 96 well plateBecton Dickenson351172
absorbance plate readerBioTekSynergy 2
polyacrylamide gelsBio-Rad3450014 
protein molecular weight standardBio-Rad1610374
Protran supported nitrocelluloseAmersham (GE)10600015
gel boxBio-Rad1658005
TrisFisher ScientificBP152-1
Tween20Sigma AldrichP-1379
sodium chlorideFisher ScientificS271-1
primary NEP polyclonal antibody R & D SystemsAF1182
doxycycline chowTeklad (HARLAN)TD.130750 
FVB/NJ wild type miceJackson001800
secondary antibody (goat anti-rabbit)ZyMed81-6120
ECL solution-Western Lightening PlusPerkinElmerNEL104001EA
filmPierce34091

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