Digestione delle proteine, ultrafiltrazione e cromatografia di esclusione di formato per ottimizzare l'isolamento degli esosomi da siero e Plasma sanguigno umano

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per purificare gli esosomi da siero con ridotta co-purificazione non-exosomal di proteine del sangue e del plasma. Il protocollo ottimizzato include ultrafiltrazione, trattamento con proteasi e cromatografia di esclusione di formato. Una maggiore purificazione di esosomi analisi a valle di vantaggi, tra cui più accurata quantificazione delle vescicole e caratterizzazione proteomica.

Abstract

Esosomi, un tipo di nanovesicle rilasciato da tutti i tipi di cellule, possono essere isolati da qualsiasi fluido corporeo. Il contenuto di esosomi, tra cui proteine ed RNA, è univoco per le cellule da cui essi sono derivati e può essere utilizzati come indicatori della malattia. Diversi protocolli comuni di arricchimento, tra cui ultracentrifugazione, resa di esosomi caricati di contaminanti di proteina solubile. In particolare, abbiamo trovato che le proteine più abbondanti all'interno del sangue spesso co-purificano con esosomi e possono confondere studi di proteomica a valle, vanificando l'identificazione dei candidati biomarcatore abbondanza bassa. Di ulteriore preoccupazione è irriproducibilità di quantificazione della proteina esosomi grazie alla rappresentazione incoerente dei livelli della proteina non-exosomal. Il protocollo dettagliato qui è stato sviluppato per rimuovere le proteine non-exosomal che co-purificano con esosomi, aggiunta di rigore per il processo di purificazione di esosomi. Cinque metodi sono stati confrontati usando accoppiato al plasma di sangue e siero da cinque donatori. Analisi usando nanoparticle tracking analysis e analisi della proteina acido bicinconinico micro ha rivelato che un protocollo combinato che utilizza cromatografia di esclusione di ultrafiltrazione e dimensione ha prodotto l'arricchimento della vescicola ottimale e la rimozione di proteina solubile. Macchiarsi occidentale è stato utilizzato per verificare che le proteine del sangue abbondanti attesi, tra cui l'albumina e apolipoproteine, sono state vuotate.

Introduzione

Gli esosomi sono nanovesicles (che variano nel formato da 30 nm a 150 nm) rilasciato da quasi tutte le cellule nel corpo umano per facilitare la comunicazione cellula--cellula elabora^1,2. È interessante notare che, la composizione degli esosomi cambia a seconda le celle di origine, nonché lo stato di salute dei singoli^3,4,5. Inoltre, esosomi possono essere Estratto da diversi fluidi biologici come: saliva, urina e sangue². A causa di queste caratteristiche, gli esosomi sono considerati una buona fonte di biomarker di malattia. Purtroppo, non esiste alcun metodo standard per l'isolamento di esosomi. Alcuni laboratori considerano centrifugazione multifasico, con un passaggio ad alta velocità finale a 100.000 x g usando le pendenze di densità come il metodo gold standard per l'isolamento di esosomi. Tuttavia, recenti studi hanno dimostrato che ultracentrifugazione induce l'aggregazione di esosomi con proteine solubili e altri esosomi, oltre ad interessare l'integrità di esosomi, entrambi i quali possono ostacolare applicazioni a valle^6,7 . Altri metodi comuni di esosomi isolamento includono, ma non sono limitati a: precipitazione da commerciale polietilenglicole (PEG) base di reagenti, ultrafiltrazione centrifuga e cromatografia di esclusione dimensionale (SEC). I reagenti commerciali utilizzando polimeri di polietilene glicole (spina) arricchiscono esosomi causando loro di precipitare e formare una pallina. Limitazioni di utilizzo di questo polimero sono contaminazione con residui PEG polimero e un'abbondanza di proteine solubili non-exosomal nel prodotto finale. Ultrafiltrazione utilizza centrifugazione per purificare e concentrare le vescicole utilizzando una membrana di cellulosa; esosomi vengono mantenuti sopra il filtro, mentre le più piccole impurità e altre proteine passano attraverso la membrana^7,8. Proprio come altri metodi, ultrafiltrazione centrifuga ha una capacità limitata per purificare gli esosomi a causa della ritenzione di alti livelli di proteine non-exosomal, tra cui aggregati e complessi proteici. Infine, purificazione SEC utilizza resina porosa per separare le molecole di dimensioni. SEC ha mostrato risultati promettenti, superando la maggior parte dei problemi con esperienza con altri metodi catturando la maggior parte delle proteine contaminanti e preservando l'integrità del exosomal, poiché l'isolamento è basato sulla gravità o sistemi a bassa pressione^{7, 9}. Tuttavia, la co-isolamento di proteine più grandi aggregati e lipoproteine¹⁰ durante il SEC colpisce la purezza della preparazione finale esosomi. Mentre alcuni metodi sono stati testati per la purificazione di esosomi da surnatanti della cultura delle cellule e del plasma⁷o solo al plasma^9,11, non c'è alcuna informazione circa le prestazioni dei metodi direttamente a confronto sangue plasma e siero dallo stesso individuo.

Qui, ci concentriamo sulla purificazione del sangue esosomi confrontando una serie di flussi di lavoro per determinare se tecniche di arricchimento della vescicola sono traducibili tra plasma e siero. Nanoparticle tracking analysis e western blot sono stati usati per quantificare le differenze nella composizione di concentrazione, purezza e proteina di esosomi nei prodotti finali. Il metodo finale, dettagliato nel presente protocollo, aumenta i numeri della vescicola e riduce i livelli di proteina non-exosomal. D'importanza, è dimostrata una drastica riduzione delle proteine co-precipitazione comuni tra cui albumina e apolipoproteine. All'abbondanza di queste due proteine nel sangue e la frequenza alla quale essi co-purificare con esosomi cause incoerenze tra i campioni "purificati", inclinare le analisi a valle. Questo protocollo prevede l'utilizzo di una resina SEC disponibile in commercio; la resina è composto dei branelli porosi in cui proteine inferiore a 700 kDa possono inserire le perline. Una volta all'interno, le proteine vengono mantenute da un ligando octylamine. L'eluato è composto di esosomi e molecole più grandi di 700 kDa¹². Inoltre, al fine di ridurre gli aggregati proteici e apolipoproteine che eludere intrappolamento della perla, includiamo una fase di digestione della proteasi del flusso di lavoro. Attualmente, non esiste nessuna tecnica da sola in grado di massimizzare la resa di esosomi riducendo proteine non-exosomal co-purificante. Questo studio indica che un protocollo di purificazione che combina un pretrattamento di digestione della proteasi con più metodi di recupero e purificazione può essere utilizzato per aumentare la resa di esosomi e purezza da siero del sangue e del plasma.

Protocollo

Quest'opera è stata determinata non deve essere la ricerca del soggetto umano all'esame iniziale dagli di Colorado State University Institutional Review Board (IRB), come tutti i campioni umani sono stati ottenuti come campioni de-identificati dal biorepository Bioreclamation IVT e sono stati raccolti sotto protocolli IRB approvato.

1. preparazione del campione grezzo (Plasma o siero) di cubettatura più grandi vescicole e detriti cellulari

Nota: Considerazione di sicurezza: plasma, siero e altri fluidi biologici sono materiali a rischio biologico e deve essere maneggiati con cura speciale, mentre indossa base dispositivi di protezione individuale, compresi i guanti e camice da laboratorio. È altamente raccomandato che i campioni biologici sono trattati in una cappa di biosicurezza; Se non disponibile, è consigliato l'uso di protezioni per gli occhi.

1. Equilibrare un siero o un campione di plasma inserendo il tubo in condizioni di non-agitazione in un frigorifero a 4 ° C durante la notte (da o -20 o stoccaggio di-80 ° C).
2. Aliquotare e 250 µ l del campione in una provetta da microcentrifuga utilizzando una pipetta di 1.000 µ l.
3. Centrifugare il campione a 18.000 x g per 30 min a 4 ° C.
4. Utilizzando una pipetta 200 µ l, 200 µ l del surnatante eliminato di rimuovere e aggiungerlo ad un nuovo tubo del microcentrifuge. Evitare qualsiasi materiale pellettato durante il trasferimento il supernatante. Scartare il materiale pellettato.
5. Quantificare il contenuto proteico del campione dall'analisi di bicinconinico acido (BCA), utilizzando il protocollo del produttore. Per eseguire il test, è necessario diluire il campione 01:50 in 1x tampone fosfato salino (PBS). Test di ciascun campione in duplicato.
   Nota: Se non diversamente specificato, utilizzare 1X PBS in tutto il protocollo. In media, 200 µ l di chiarificato siero o plasma (dopo 18.000 x g) resa di 15 mg di proteine totali. Altri tipi di campione, con contenuto proteico inferiore o superiore, possono richiedere ulteriori diluizioni di BCA.
6. Aliquotare 10 mg di campione in una provetta da microcentrifuga nuovo. Utilizzare la concentrazione ottenuta al passaggio 1.5 per calcolare il corrispondente volume di campione. Aliquota del campione usando una pipetta 200 µ l.
   Nota: Si raccomanda di conservare il campione rimanente a-80 ° C. Aliquota del campione in diversi tubi a 10 mg per tubo per evitare il gelo-disgelo più cicli in futuro utilizzare.

2. la digestione delle proteine del sangue Non-exosomal

Nota: La fase di digestione è progettata per ridurre le proteine non-exosomal che possono co-purificare con esosomi. Se la conservazione delle proteine di superficie esosomi è necessaria per le analisi a valle, dovrebbe essere preso in considerazione che questo passaggio ha il potenziale di interferire con questa analisi. La rilevazione di exosomal CD63, una proteina di superficie-esposta studi, non era stata influenzata significativamente negativamente da questo processo.

1. Preparare la proteinasi K soluzione ad una concentrazione di 500 µ g/mL in PBS. Aggiungere la quantità corrispondente di proteinasi K in una provetta conica. Aggiungere quindi il buffer e vortexare per 30 s, 3 x a temperatura ambiente.
2. Aggiungere 50 µ l di soluzione di proteinasi K nell'esempio 10 mg aliquota e mescolare dolcemente pipettando su e giù usando una pipetta a 200 µ l.
3. Incubare il campione a 37 ° C a bagnomaria per 30 min. posto il tubo in una cremagliera del tubo galleggiante ed evitare la completa immersione del tubo nel bagno d'acqua per evitare potenziali perdite.
4. Trasferire il campione e la cremagliera del tubo galleggiante a bagnomaria a 60 ° C per 10 min, per inattivare la proteinasi K.

3. rimozione di piccole proteine e peptidi mediante ultrafiltrazione centrifuga

1. Sciacquare contenente 100 filtro cut-off (MWCO) di peso molecolare di kDa prima di PBS di utilizzare un dispositivo di ultrafiltrazione. Questo scopo, aggiungere 500 µ l di PBS per il filtro, utilizzando una pipetta di 1.000 µ l. Girare il dispositivo a 3.700 x g per 5 min, scartare qualsiasi retentato rimanente, come pure l'eluato.
   Nota: La capacità del volume di campione del dispositivo ultrafiltrazione deve essere 0,5 mL - 4 mL per assicurarsi che il volume del campione ridotto finale di 50 µ l è realizzabile.
2. Prelevare il campione dal punto 2.4 e aumentare il volume a 500 µ l con l'aggiunta di PBS. Dispensare il campione nel dispositivo pre-risciacquata ultrafiltrazione.
   Nota: In media, il volume del campione dal passaggio 2.4 è 185 µ l (120-150 µ l di campione e 50 µ l di soluzione di proteinasi K).
3. Posizionare il dispositivo di ultrafiltrazione in una centrifuga da banco ad angolo fisso a 3.700 x g a 4 ° C fino a quando il campione è ridurre ad un volume di 50 µ l.
   Attenzione: Quando si utilizzano dispositivi di ultrafiltrazione con arresto volume, si deve prestare attenzione per evitare il completo essiccamento della membrana del filtro durante le fasi di centrifugazione.
4. Aggiungere 500 µ l di PBS direttamente nel filtro a membrana e pipetta su e giù per 5 volte. Centrifugare come descritto al punto 3.3. Eseguire questo passaggio di lavaggio un totale di 3 volte.
5. Trasferire il retentato finale 50 µ l in un nuovo tubo del microcentrifuge.
6. Sciacquare il filtro a membrana con 200 µ l di PBS, pipettaggio su e giù per 10 volte e trasferire il lavaggio nella provetta da passo 3.5.
7. Inserire il portafiltro nella posizione inversa in un nuovo tubo. Eseguire un ripristino di inversione di rotazione per 5 min a 2.000 x g per recuperare il campione rimanente dalla membrana. Piscina il campione con il campione dal punto 3.5.

4. purificazione delle vescicole di cromatografia di esclusione di formato (SEC)

1. Aggiungere 850 µ l di liquami SEC, con perline avendo una MWCO di kDa 700, in una colonna di flusso di vuoto, con un massimo di gravità usando una pipetta di 1.000 µ l. Posizionare le colonne in un formato rack appropriato dotato di un gocciolatoio.
2. Stappare la parte inferiore della colonna e lasciare che lo scarico liquido per 5 min. Una volta scolati, aggiungere 10 mL di PBS per lavare la resina. Consentire 20 min per il lavaggio drenare dalla colonna.
3. Posizionare il concentrato, proteinasi K trattato campione da passo 3.5 in una provetta conica da 15 mL e aumentare il volume del campione a 5 mL di PBS di aggiungere con una pipetta sierologica. Mescolare delicatamente il tubo da dondolo per 1 min e poi lentamente applicare il campione alla colonna preparata al punto 4.2 con una pipetta sierologica.
   Nota: Una volta rimosso il tappo della colonna, il campione fluirà attraverso la resina per gravità; L'esempio 5 mL fluirà completamente attraverso la colonna in 10 min.
4. Raccogliere il flusso attraverso in una nuova provetta conica da 15 mL.
5. Utilizzando una pipetta sierologica, applicare il materiale raccolto per la resina nuovamente per rimuovere qualsiasi materiale restante sotto 700 kDa.
6. Raccogliere il flusso attraverso in una nuova provetta conica da 15 mL. Lavare la resina due volte aggiungendo 1 mL di PBS. Raccogliere il flusso attraverso il tubo dal punto 4.5; il volume finale totale sarà di circa 7 mL.
   Nota: Dopo passo 4.6, il campione sarà diluito circa 35 volte dal volume del campione originale; la seguente procedura verrà ridurre il volume e concentrare il campione di esosomi purificata.

5. concentrazione di esosomi purificati e quantificazione di proteine totali

1. Sciacquare un dispositivo di ultrafiltrazione con un filtro MWCO 3 kDa prima di PBS di utilizzare, come descritto al punto 3.1.
2. Aggiungere l'esempio dal passaggio 4.6 al dispositivo di ultrafiltrazione e centrifuga in un rotore basculante a 3.700 x g a 4 ° C. Tampone passa attraverso il filtro e possa essere scartate. Concentrato di esosomi verranno mantenuti sopra il filtro. Centrifugare il campione fino a quando il volume sopra il filtro (retentato) è ridotto a 200 µ l.
3. Trasferire il retentato ad un nuovo tubo del microcentrifuge.
4. Sciacquare il filtro a membrana con 200 µ l PBS pipettando sopra la membrana 10 volte e trasferire il lavaggio del tubo dal punto 5.3. Questo permetterà per la raccolta di un campione di esosomi residua.
5. Portare il volume di campione fino a 500 µ l con l'aggiunta di PBS. Mescolare lentamente pipettando su e giù per 10 volte.
   Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. I campioni devono essere conservati a 4 ° C durante la notte o a-20 /-80 ° C per la conservazione a lungo termine.
6. Quantificare il contenuto proteico del campione dall'analisi di BCA, utilizzando il protocollo del produttore. Diluire il campione 01:10 e 01:50 in PBS. Eseguire ogni campione in duplicato.
   Nota: A partire da 10 mg di proteine totali del siero o del plasma, la proteina totale resa in esosomi purificati dal passaggio 5.6 è, in media, 150 µ g. ulteriori diluizioni possono essere necessari se vengono utilizzati campioni diversi da siero o plasma; la resa può variare con tipo di campione.

6. quantificazione e dimensionamento degli esosomi di Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)

1. Aggiungere 5 µ g di esosomi purificati (come quantificato in 5.6) a 1 mL di PBS e agitare con vortex per 15 s su medio-bassa velocità.
   1. Il campione viene posto in una siringa monouso da 1 mL. Se disponibile, è possibile impostare la siringa in una pompa a siringa automatica impostata di iniettare il campione diluito esosomi a una velocità di 30 µ l/min.
   2. Eseguire misurazioni NTA utilizzando impostazioni di acquisizione video: schermo guadagno del livello 3-4 e fotocamera di 12-13.
   3. Definire lo script per l'analisi eseguire tre replicati tecnici per un minimo di 30 s usando un flusso costante per ogni replica. Per l'analisi, impostare la soglia di cattura alle 5.
      Nota: Dettagli per quanto riguarda l'uso della siringa automatica e le impostazioni per l'acquisizione video sono disponibili nel riferimento¹³. Impostazioni di acquisizione e analisi per NTA devono essere coerente in diversi campioni per assicurare la comparabilità.

7. determinazione della riduzione della proteina solubile

1. Aggiungere µ g di 1-10 di esosomi purificati a tampone campione SDS ed eseguire l'elettroforesi su gel di poliacrilamide (pagina) utilizzando un Gel di Bis-Tris di 4-12% in 1 x MES SDS in esecuzione buffer per 35 min a 200 V. Transfer risolti proteine ad una membrana di nitrocellulosa 0,2 µm applicando una tensione o f 50 V per 1-1.5 h. eseguire l'analisi western blot per valutare la presenza di albumina, apolipoproteine A e B e il marcatore di esosomi CD 63 seguendo metodologie standard.
   Nota: Protocolli di completo per i metodi 7.1 si trovano riferimento¹⁴; in particolare, SP007: esecuzione del gel di poliacrilammide e SP011: protocollo occidentale della macchia.
2. Separare i 10 µ g di esosomi purificati utilizzando la pagina come descritto al punto 7.1 e macchia le bande proteiche utilizzando colorante coomassie, seguenti raccomandazioni standard, per visualizzare la variazione di proteina e riduzione tra i campioni.
   Nota: Ulteriori dettagli riguardanti il protocollo per le macchie occidentali specifici di CD63 sono descritti da Diaz et al. ¹⁵

Risultati

I dati presentati di seguito sono stati ottenuti utilizzando campioni appaiati di siero e plasma da cinque donatori sani. Per determinare gli effetti di ogni fase di lavorazione, sono state effettuate cinque varianti del protocollo presentato, e rimozione di proteine di recupero e non-esosomi esosomi sono stati confrontati. I metodi sperimentati inclusi: 1) SEC 700 kDa + ultrafiltrazione 3 kDa; 2) ultrafiltrazione 100 kDa; 3) proteinasi K + ultrafiltrazione 100 kDa; 4) SEC kDa 700 + ultra...

Discussione

Un metodo ottimizzato per aumentare la purezza e la resa degli esosomi da sangue aumenterà la capacità di miniera con precisione le vescicole extracellulari come fonte di biomarcatori per parecchie malattie. I metodi standard attualmente utilizzate per isolare gli esosomi, in particolare, ultracentrifugazione e metodi di precipitazione, hanno diversi svantaggi tra cui aggregazione esosomi e cubettatura di proteine solubili^{7,17, 18<...}

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nanosight	Malvern	NS300
Benchtop microcentrifuge	Thermo	Legend Mico21
Benchtop centrifuge	Beckman Coulter	Allegra 6R
Waterbath	Benchmark	B2000-4
Microplate reader	BIOTEK	Epoch
Pierce BCA Protein Assay Kit	THERMO	23227
Micro BCA Protein Assay Kit	THERMO	23235
Phosphate buffered saline	Corning	21-040-CV
96 well plate	Corning	15705-066
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane	EMD-Millipore	UFC510096
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units	EMD-Millipore	UFC800324
Capto Core 700	GE Healthcare	17548103
Poly-Prep Chromatography Columns	BIORAD	7311550
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels	THERMO	NP0323BOX
Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 µm	BIORAD	1620112
Proteinase K, Tritirachium album	EMD-Millipore	539480
SimplyBlue SafeStain	THERMO	LC6065
SIGMAFAST BCIP/NBT	Millipore-SIGMA	B5655
4-Chloro-1-naphthol	Millipore-SIGMA	C6788
Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody	SYSTEM BIOSCIENCES	EXOAB-CD63A-1	Primary and secondary antibodies
ALB Antibody (F-10)	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.	sc-271605	Primary antibody
apoB Antibody (C1.4)	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.	sc-13538	Primary antibody
apoA-I Antibody (B-10)	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.	sc-376818	Primary antibody