Quantifier la colonisation de Vibrio cholerae et la diarrhée dans le modèle de poisson-zèbre adulte

Résumé

Poisson zèbre est un naturel Vibrio cholerae hôte et peut être utilisé pour récapituler et d’étudier l’ensemble du cycle infectieux de la colonisation à la transmission. Ici, nous démontrons comment évaluer les niveaux de colonisation V. cholerae et quantifier la diarrhée chez le poisson zèbre.

Résumé

Vibrio cholerae est surtout connu comme l’agent infectieux qui provoque le choléra de maladie humaine. À l’extérieur de l’hôte humain, V. cholerae existe principalement dans le milieu aquatique, où elle interagit avec une variété d’espèces aquatiques supérieures. Vertébrés poissons sont connus pour être un environnement hôte et sont un réservoir potentiel V. cholerae dans la nature. V. cholerae et l’espèce de poisson téléostéen Danio rerio, communément appelé poisson-zèbre, originaires du sous-continent indien, ce qui suggère une interaction de longue date dans les milieux aquatiques. Poisson zèbre est un organisme modèle idéal pour l’étude de nombreux aspects de la biologie, y compris les maladies infectieuses. Poisson zèbre peut être facilement et rapidement colonisé par V. cholerae après exposition dans l’eau. Colonisation de l’intestin par V. cholerae entraîne la production de la diarrhée et l’excrétion de répliqué V. cholerae. Ces excrété la bactérie peut alors continuer à coloniser de nouveaux poissons hôtes. Ici, nous démontrons comment évaluer V. cholerae-colonisation de l’intestin dans le poisson-zèbre et comment quantifier V. cholerae-induite par le poisson-zèbre diarrhée. Le modèle de colonisation doit être utile pour les chercheurs qui étudient si les gènes d’intérêt peuvent être importants pour la colonisation de l’hôte et/ou pour la survie dans l’environnement. La quantification du poisson-zèbre diarrhée devrait être utile aux chercheurs qui étudient tout pathogène intestinale et qui sont intéressés à explorer le poisson-zèbre comme système modèle.

Introduction

Vibrio cholerae est une bactérie Gram-négatif aquatique qui provoque le choléra maladie humaine, mais aussi les diarrhées sporadiques^1,2. V. cholerae se trouve dans l’environnement dans de nombreuses régions du globe, souvent associé à d’autres organismes aquatiques. Ces organismes associant incluent plancton, masses de œufs insectes, mollusques et poissons vertébrés espèces^3,4,5,6,7. Plusieurs études ont isolé V. cholerae des voies intestinales des poissons dans les différentes zones géographiques^7,8,9,10. La présence de V. cholerae chez les poissons indique que les poissons peut agir comme un réservoir environnemental. Poissons pourraient également être impliqués dans la transmission de la maladie à l’homme et de la propagation géographique de V. cholerae souches⁶.

Pour mieux comprendre comment V. cholerae interagit avec poissons, Danio rerio, mieux connu sous le nom de poisson-zèbre, a été développé comme un système modèle pour l’étude de V. choleraee¹¹. Poisson zèbre sont originaires d’Asie du Sud, y compris la région de la baie du Bengale, qui est considérée comme le plus ancien réservoir de V. cholerae. Avant le premier début pandémie de choléra en 1817, choléra n’avait pas été porté à l’extérieur de ce qui est maintenant l’Inde et le Bangladesh. Par conséquent, poisson-zèbre et V. cholerae presque certainement sont associées entre elles sur des échelles de temps évolutif, suggérant que poisson zèbre sont une foule de V. cholerae dans le milieu naturel¹².

Le modèle de poisson zèbre pour V. cholerae est simple à exécuter et peut être utilisé pour étudier l’ensemble du pathogène V. cholerae le cycle de vie. Poissons sont exposés à V. cholerae de baignade dans l’eau qui a été vaccinée avec un nombre connu de V. cholerae. En quelques heures, colonisation de l’intestin a lieu, suivi par la production de la diarrhée. Diarrhée est constitué de mucine, protéines, bactéries excrétées et autres contenus intestinaux. Le degré de la diarrhée peut être quantifié à l’aide de quelques simples mesures¹³. V. cholerae qui a été excrétés par les poissons infectés peut ensuite passer à infecter les poissons naïfs, complétant le cycle infectieux. Par conséquent, le modèle de poisson-zèbre récapitule les V. cholerae maladies humaines processus^12,14.

Le plus fréquemment utilisé V. cholerae modèles animaux ont toujours été des souris et des lapins^{14,15,16,17,18}. Ces modèles ont contribué à ajouter à notre connaissance de la pathogénèse de V. cholerae . Cependant, parce que les souris et les lapins ne sont pas naturelles V. cholerae hôtes, il y a des limites à quels aspects du cycle de vie V. cholerae peuvent être étudiés. La colonisation de V. cholerae des souris et des lapins nécessite généralement l’absence du microbiote intestinal ou un prétraitement avec des antibiotiques pour endommager le microbiote intestinal. Les deux modèles nécessitent soit de gavage d’introduire les bactéries du tube digestif ou de manipulation chirurgicale d’injecter directement les bactéries dans les intestins. Poisson zèbre ont un avantage car les poissons adultes avec un microbiote intestinal intact sont facilement colonisés et le processus infectieux se passe naturellement, sans aucune manipulation nécessaire.

Le présent travail montre l’utilisation du poisson-zèbre comme modèle à V. cholerae infection. L’infection, dissection, dénombrement des colonisateurs V. choleraeet la quantification de la diarrhée causée par V. cholerae sera décrit^12,13. Ce modèle est susceptible d’être utile aux scientifiques intéressés dans le processus de la maladie de V. cholerae , tant dans la vie de V. cholerae environnementale.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de Wayne State University. Cette méthode a été décrite en Runft et al. ¹²

1. détermination des niveaux de colonisation de l’intestin

NOTE : Colonisation de l’intestin est la métrique plus utile dans le modèle de poisson-zèbre car il peut être utilisé pour comparer la fitness relative de différentes souches de V. cholerae ou les effets des mutations ou des débouchures de gène.

1. Inoculation du poisson-zèbre par immersion
   Remarque : Cela signifie d’exposition ressemble à l’évolution naturelle de l’infection.
   1. Préparation de V. cholerae
      1. Inoculer 5 mL de bouillon de lysogénie (LB) avec un isolé V. cholerae colonie d’une LB sur plaque et incuber à 37 ° C sous agitation (180 tr/min) 6 – 8 h (culture de nuit).
      2. Inoculer 25 mL de milieu frais stérilisés à l’autoclave de LB dans une fiole conique de 250 mL avec 50 µL de la culture pendant la nuit qui précède. Il incuber pendant 16 à 18 h à 37 ° C sous agitation (150 tr/min).
      3. Lire la densité optique à 600 nm (OD₆₀₀) d’une dilution de 1/10 de la culture au jour le jour pour estimer le nombre de bactéries par mL (le OD₆₀₀ = 1 est de ~ 10⁹ UFC/mL.)
      4. Récolter les cellules par centrifugation à 6 000 g pendant 10 min. Retirez les médias avec une pipette ou décanter dans une solution désinfectante. Remettre en suspension les cellules dans du PBS stérile de la concentration désirée, généralement entre 1 x 10⁷ à 1 x 10¹⁰ par ml de PBS.
         NOTE : Ici, nous nous référons à autoclavé par osmose inverse l’eau contenant des sels de mer de 60 mg/L d’eau stérile de l’infection.
   2. Ensemencement et incubation
      1. Placez quatre ou cinq poissons zèbres dans un bécher de 400 mL contenant 200 mL d’eau stérile de l’infection.
      2. Ajouter 1 mL de V. cholerae (de l’étape 1.1.1.4.) pour obtenir la concentration désirée infection (généralement de 5 x 10⁴ à 5 x 10⁷ UFC/mL) dans 200 mL d’eau de l’infection.
      3. Couvrir le bécher avec un couvercle perforé pour empêcher les poissons de sauter par-dessus ; la partie supérieure d’une boîte de pointe 200 µL fonctionne bien pour cela.
      4. Étiquetez chaque bécher et rangez-les dans un incubateur à façade en verre fixée à 28 ° C pour la durée de l’expérience.
   3. Procédure pour l’exposition temporaire
      NOTE : Une exposition transitoire à V. cholerae (généralement 6 h), suivie par la suppression des bactéries inoculer est utile pour étudier la transmission et la quantification plus précise des bactéries excrétées.
      1. Après 6 h d’exposition, versez l’eau du bécher dans une résille pour recueillir le poisson. Jeter l’eau infectée dans un récipient d’eau de Javel pour tuer les V. cholerae.
      2. Placer le poisson retiré dans un bécher de 200 mL d’eau stérile de l’infection. Laissez le poisson à la nage dans cette eau claire pendant 5 min éliminer les bactéries en surface du poisson.
      3. Répétez la procédure nette (étape 1.2.2) et placer le poisson dans un nouveau bécher de 200 mL d’eau stérile de l’infection. Garder le poisson dans ce bécher pour la durée de l’expérience.
2. Euthanasie
   1. Lorsque l’expérience a atteint son point de terminaison souhaité, prendre un échantillon de l’infection de l’eau (15 mL suffit en général) pour permettre la numération bactérienne excrétée et la mesure de la diarrhée (tels que le dosage de la mucine, teneur en protéines ou OD), si vous le souhaitez (section 2).
   2. Videz le reste de l’eau à travers une résille (pour recueillir le poisson) dans l’eau de Javel pour tuer les V. cholerae dans l’eau.
   3. Placer le poisson dans un bécher contenant de l’eau de l’infection et 336 µg/mL de méthanesulfonate de 3-aminobenzoate d’éthyle (tricaïne) et incuber le poisson dans cette solution de tricaïne pendant 20 min à température ambiante.
      Remarque : Les filets de pêche ont été stérilisés avec une solution javellisée de 10 %.
3. Dissection
   1. Préparation de poisson
      1. Évider un poisson hors de la solution de tricaïne avec une cuillère en plastique jetable et placez-le sur la surface de la dissection.
      2. Position du poisson avec sa face ventrale vers le haut et la broche à travers la mâchoire inférieure, avec l’extrémité arrondie de l’axe incliné loin du centre du corps. Placez un autre NIP juste postérieur à l’anus, aussi incliné loin du corps.
   2. Exposition du tractus intestinal
      1. Tamponner la surface ventrale du poisson avec un chiffon non pelucheux imbibé d’éthanol à 70 %.
      2. Stériliser un scalpel et ciseaux de Vannas en les plongeant dans l’éthanol à 70 % et les flammes.
      3. Faire une petite incision sur la longueur dans le ventre juste sous la peau en pénétrant les échelles et en utilisant le scalpel. Veillez à ne pas couper trop profondément, car le tractus intestinal est situé juste sous la peau.
      4. En utilisant les ciseaux, prolonger l’incision avec précaution le long du corps, coupe n’est pas supérieure à niveau de la peau et éviter l’anus.
      5. Faire deux incisions latérales avec les ciseaux vers la tête du poisson afin de permettre une ouverture de l’incision.
      6. Épinglez la peau de chaque côté des incisions latérales à la surface de dissection, pêche à la ligne les broches, loin du corps.
         Remarque : Les conseils des broches ont été précédemment stérilisées par les flammes avec de l’alcool.
   3. Enlèvement du tractus intestinal
      Remarque : Le tractus intestinal doit être visible sous la forme pâle d’un tube très mince sur le dessus des autres organes.
      1. Flamme-stériliser le forceps et puis utilisez-les pour enlever l’intestin entier (généralement 12 à 15 mm de longueur). Déposer l’intestin dans un tube d’homogénéisation contenant des perles de verre (voir étapes 1.4.1–1.4.2) et 1 mL de 1 x PBS ou LB, sur la glace.
4. Homogénéisation
   1. Préparer les tubes d’homogénéisation à l’avance en versant ~1.5 g de perles de verre de 1 mm dans 2 mL tubes bouchon à vis (remplissez-les approximativement à mi-distance) et ensuite de les stériliser à l’autoclave.
   2. Ajouter 1 mL de stérile LB ou 1 x PBS.
   3. Une fois que les intestins du poisson-zèbre ont été ajouté (étape 1.3.3.1) aux tubes, vis les bouchons sur très serré et puis fixer les tubes dans l’homogénéiseur vortex.
   4. Homogénéiser les échantillons pendant 1 min sur position maximum, puis cool eux sur la glace pour 1 à 2 min. répètent ce cycle d’homogénéisation une fois de plus pour une homogénéisation complète.
      Remarque : Plusieurs méthodes alternatives pour l’homogénéisation fonctionnera également.
5. Quantifier les niveaux de la colonisation de l’intestin
   1. Préparer les tubes (tubes à essai petit verre ou tubes de microcentrifuge de 1,5 mL) pour la dilution en série de l’homogénat en ajoutant 900 µL de LB ou 1 x PBS dans chaque tube. Pour chaque poisson, préparer les tubes de 5 – 6 et faire 10 fois des dilutions de l’homogénat intestinale en ajoutant 100 µL de l’homogénat dans le premier tube, Vortex il mix, et puis en ajoutant 100 µL du tube du premier au second tube.
   2. Répétez cette procédure jusqu'à ce que toutes les dilutions ont été préparées.
   3. Plaque de 100 à 200 µL de chaque dilution sur plaques de gélose LB contenant 100 µg/mL de streptomycine (si vous utilisez des souches résistantes à la streptomycine) et 40 µg/mL de X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside). Incuber les plaques à 30 ° C pendant 16 à 18 h.
   4. Après l’incubation durant la nuit, compter V. cholerae colonies sur les plaques, soit à l’aide d’un compteur de colonies automatisée ou manuelle de comptage des colonies ; Il est utile de marquer les colonies comptées avec une pointe de marqueur.
   5. Déterminer l’UFC / intestin de poissons en multipliant la teneur en germes par le facteur de dilution de la suspension, en prenant en compte le volume qui a été plaqué.

2. mesure de la diarrhée de poisson

Remarque : Quatre différents indicateurs ont servi à évaluer les diarrhées de poisson : les niveaux de mucine dans l’eau, les niveaux de protéines excrétées ensemble dans l’eau, l' OD₆₀₀ de l’eau et le V. cholerae UFC dans l' eau¹³. Diarrhée, normalement devient visuellement évidente environ 6 h après l’exposition du poisson-zèbre à V. cholerae comme décrit ci-dessus.

1. Déterminer les niveaux de mucine
   Remarque : La sécrétion de mucine est induite lors de la colonisation de V. cholerae et constitue une bonne mesure des niveaux d’excrétion, surtout au début de l’infection,¹³. L’essai de mucine est une variation sur la microplaque à l’acide périodique Schiff dosage¹⁹.
   1. Préparer les matériaux suivants : 50 % (p/v) d’acide périodique solution mère et 0,1 % solution de travail à l’acide périodique (10 µL du stock 50 % acide périodique on ajout 5 mL d’acide acétique 7 % — utiliser immédiatement après la prise), normes de mucine, plaques de Microplaque 96 puits, Schiff réactif.
      1. Élaborer des normes de la mucine en suspendant les quantités suivantes de mucine (d’un type de porcin estomac III) dans un tampon d’acétate de sodium (100 mM acétate de sodium, 5mM EDTA, pH à 5,5 à l’acide acétique glacial) : 400 µg/mL, 300 µg/mL, 200 µg/mL, 150 µg/mL , 100 µg/mL, 75 µg/mL, 50 µg/mL, 25 µg/mL et 10 µg/mL.
         Préparer la plaque en ajoutant 100 µL de l’infection par l’eau dans chaque puits qui sera utilisé dans l’essai comme suit : blanc 1 x PBS ; normes de mucine tel que décrit ci-dessus, ou un échantillon d’eau de l’infection des poissons. Faire de chaque échantillon en triple exemplaire.
   2. Ajouter 50 µL de solution d’acide périodique 0,1 % fraîche à chacun avec une pipette multicanaux et mélangez-le en pipettant également monter et descendre plusieurs fois.
   3. Enveloppez la plaque bien dans une pellicule plastique et il incuber à 37 ° C pendant 1 à 1,5 h.
   4. Laisser refroidir la plaque à température ambiante pendant 5 à 10 min. Ajouter 100 µL de solution de fuchsine (du réactif de Schiff) à chaque puits et pipette de haut en bas pour mélanger.
   5. Enrouler la plaque dans une pellicule plastique et il incuber à température ambiante sur une plate-forme bascule jusqu'à ce que la couleur a mis au point ; la couleur est généralement développée au sein de 20 min. lire l’absorbance à 560 nm en utilisant un lecteur de plaque.
   6. Tracer une courbe standard de mucine (OD₅₆₀vs µg/mL mucin standard). Déterminer les niveaux de la mucine des inconnus en identifiant où l' OD₅₆₀ de chaque inconnu se situe sur la courbe d’étalonnage et de la concentration de mucine correspondant pour cette valeur de lecture.
2. Déterminer les niveaux de la protéine
   NOTE : En dehors de la mucine, niveaux globaux de protéine dans l’eau sont un autre proxy pour les niveaux de la diarrhée (selles nuageux, liquide) produites par les poissons. Cette procédure utilise une analyse standard de Bradford pour estimer les taux de protéines. Taux de protéines sont estimés d’après la courbe d’étalonnage de l’albumine sérique bovine (BSA).
   1. Mélanger 100 µL d’une des normes de la BSA (voir note ci-dessous) ou 100 µL d’infection (eau du bécher contenant les poissons infectés) avec 900 µL de Bradford réactif d’analyse (le réactif d’analyse de protéines Pierce fonctionne bien pour cela) dans une cuvette jetable. Incuber les échantillons à la température ambiante pendant 2 min.
      Remarque : Les normes de BSA suivantes ont été utilisées : 1 800 µg/mL, 1 000 µg/mL, 750 µg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL, 125 µg/mL, 50 µg/mL et 25 µg/mL. Les normes de la BSA ont été dilués dans l’eau distillée autoclavé.
   2. Lire l' OD₆₆₀ de chaque norme ou l’échantillon à l’aide d’un spectrophotomètre.
   3. Tracer la courbe standard de BSA (OD₆₆₀vs µg/mL). Déterminer les taux de protéines des inconnus en identifiant où l' OD₆₆₀ de chaque inconnu tombe sur la courbe d’étalonnage BSA et lire la concentration de mucine correspondant pour cette valeur.
3. Mesure OD₆₀₀
   Remarque : La présence de diarrhée (selles nuageux, liquide) est visiblement évidente après que plusieurs h et une détermination de₆₀₀ OD simple peuvent être utilisées pour quantifier cela.
   1. Il faut inverser le tube contenant l’eau infection plusieurs fois pour répartir le contenu. Ajouter 1 mL d’échantillon dans une cuvette jetable. Utiliser 1 mL d’eau stérile infection comme contrôle négatif.
   2. Effectuer une mesure « en blanc » à l’aide du spectrophotomètre à 600 nm en utilisant l’échantillon témoin négatif. Lire chaque échantillon d’eau à 600 nm et enregistrer les résultats.
4. Détermination d’excrété V. cholerae UFC/mL après l’infection
   Remarque : Une composante majeure de la diarrhée, produite par le poisson-zèbre est excrétée V. cholerae. La détermination de la CFU/mL peut être utilisée à des fins comme l’estimation de la réplication bactérienne dans le tractus intestinal de poisson et en guise d’une dose infectieuse dans les expériences de transmission. Cette mesure est préférable lorsqu’une infection transitoire a eu lieu. Si une infection 24h est utilisée, alors ce test mesurera l’inoculum combiné plus les excrétés V. cholerae.
   1. Prendre un échantillon d’eau au point temps désiré et le diluer en série comme décrit plus haut.
   2. Les dilutions en série sur des milieux sélectifs (LB agar contenant la streptomycine ou un autre antibiotique approprié ou DSAP) sur plaque et les incuber à 30 ° C pendant 24 h.
   3. Compter les colonies. Calculer la CFU / mL d’eau, comme indiqué au point 1.5.

Résultats

V. cholerae la colonisation du tractus intestinal zebrafish

Pour fournir un exemple des niveaux typiques de la colonisation que nous observons, nous avons inoculé 5 x 10⁶ UFC de la EL Tor V. cholerae souche pandémique N16961 dans 200 mL d’eau dans un becher contenant plusieurs poisson-zèbre. Après 6 h de l’infection, les poissons étaient lavés à l’eau fraîche et transférés dans un béche...

Discussion

Le poisson-zèbre est un relativement nouveau modèle pour l’étude de V. cholerae mais est très prometteur pour la future découverte des aspects inconnus de V. cholerae biologie et pathogenèse^11,12,13 . Le modèle de poisson-zèbre adulte a l’avantage d’être une fois naturelles V. cholerae hôte qui contient le microbiote intestinal intact, mature et un modèle environnemental. Inconvénient...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrument
Shaker incubator	New Brunswick Scientific, Edison, NJ	Excella E25
Incubator	NUAIRE, Plymouth, MN	Auto Flow
Spectrophotometer	Thermo, Waltham, MA	Geaesys 6
Vortex homogenizer	Minibeadbeater24	112011
Weighing Machine	Ohaus, Columbia, MD	Adventurer Pro
Heat Stirer	Corning, Corning, NY	PC-420D
Burner
automated colony counter	REVSCI	120417B
Materials
400 ml glass beakers	Pyrex
perforated lids	Microtip holder with holes from tip box
disposable plastic spoons	Office Depot, Boca Raton, FL	D15-25-7008
Fish Tank System	Aquaneering, San Diego, CA
RO Water Purifier	Aqua FX	TK001
Fish net	Marina
fish food	Tetra fin
Brine Shrimp	Red jungle brand	O.S.I. pro 80
Styrofoam board
Pins
Scalpels	Fine Scientific tools, Foster City, CA	10000-10
Forceps	Fine Scientific tools, Foster City, CA	11223-20
Vannas scissors	Fine Scientific tools, Foster City, CA	15000-11
2 ml screw cap tubes	Fisher Scientific, Hampton, NH	02-681-375
1 mm glass beads	Bio Spec	11079110
Glass beads for spreading	Sigma, St. Louis, MO	18406-500G
Petri plate	Fisher Brand, Hampton, NH	FB0875713
1.5 ml centrifuge tube	Midsci, Valley Park, MO	AVSS1700
50 ml centrifuge tube	Corning Falcon, Corning, NY	352098
Test tubes	Pyrex	9820
Glass Pipette	Fisher Brand, Hampton, NH	13675K
Micro pipettes	Sartorius Biohit, Göttingen, Germany	m1000/m200/m20
Tips	Genesee Scientific, San Diego, CA	24-150RS/24-412
Chemicals
Instant Ocean salts
phosphate buffered saline	VWR Life Science, Radnor, PA	K813-500ml
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma, St. Louis, MO	A5040
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside	Sigma, St. Louis, MO	10651745001
Schiff’s reagent	Sigma, St. Louis, MO	84655-250 mL
periodic acid	Fisher Scientific, Hampton, NH	10450-60-9
Mucin from porcine stomach	Sigma, St. Louis, MO	M2378-100G
Bovine serum albumin	Fisher Scientific, Hampton, NH	9046-46-8
Pierce 660nm Protein Assay Reagent	Thermo, Waltham, MA	22660
LB medium
Trypton	BD Biosciences, San Jose, CA	211705
Teast Extract	BD Biosciences, San Jose, CA	212750
NACL	Fisher Scientific, Hampton, NH	BP358-212
Agar	BD Biosciences, San Jose, CA	214010
TCBS Agar	BD Biosciences, San Jose, CA	265020
DCLS Agar	Sigma, St. Louis, MO	70135-500gm
Software
Microsoft office
Prism 5