Extracción de cafeína, la actividad enzimática y la expresión del gen de la sintasa de cafeína de suspensiones celulares de plantas

Resumen

Este protocolo describe una metodología eficiente para la extracción y cuantificación de cafeína en suspensiones celulares de C. arabica L. y un proceso experimental para la evaluación de la actividad enzimática de la cafeína sintasa con el nivel de expresión de el gen que codifica esta enzima.

Resumen

Cafeína (1,3,7-trimetilxantina) es un alcaloide de purinas presente en bebidas populares como el café y té. Este metabolito secundario es considerado como una defensa química ya que tiene actividad antimicrobiana y es considerado un insecticida natural. La cafeína también puede producir efectos negativos alelopáticos que impiden el crecimiento de las plantas circundantes. Además, personas de todo el mundo consuman cafeína por sus efectos analgésicos y estimulantes. Debido al interés en las aplicaciones tecnológicas de la cafeína, ha crecido la investigación sobre la vía biosintética de este compuesto. Estos estudios se han centrado principalmente en la comprensión de los mecanismos bioquímicos y moleculares que regulan la biosíntesis de la cafeína. Cultivo de tejidos in vitro se ha convertido en un sistema útil para el estudio de este camino biosintético. Este artículo describe un protocolo paso a paso para la cuantificación de cafeína y de medición de los niveles de transcripción del gen (ECC1) codificación cafeína sintasa (CS) en suspensiones celulares de C. arabica L., así como su actividad.

Introducción

La cafeína es un metabolito secundario que es biosynthesized por plantas del género Coffea¹. Este alcaloide pertenece a la familia de metilxantinas y es considerada como una defensa química de la planta porque puede actuar contra los efectos adversos de agentes patógenos y herbívoros^2,3. Además, este metabolito es responsable de las propiedades estimulantes de la bebida de café, que es consumido en todo el mundo^4,5. Debido a sus propiedades, diversos grupos de investigación están interesados en el estudio de la vía biosintética y catabolismo de cafeína^6,7. Actualmente, cultivos de vegetales en vitro de la célula y tejidos sirven como una alternativa para evaluar la acumulación de cafeína en diferentes estrategias bióticos y abióticos^8,9.

Biosíntesis de la cafeína implica la liberación hidrolítica de 7-metilxantina de la nucleósido ribosa correspondiente seguido de orden N-metilaciones en las posiciones 3 y 1. Una específico S- adenosil metionina (SAM)-dependiente N-metiltransferasa (NMT) cataliza la metilación en la posición 7, considerando que la teobromina sintasa (TS) y CS están implicados en las metilaciones 3 y 1, respectivamente, produciendo teobromina y cafeína. El estudio de genes que codifican distintos territorios no metropolitanos ha permitido entender el mecanismo que regula la producción de cafeína^10,11. CS, que tiene N -methyltransferase actividad, cataliza los dos últimos pasos de la vía biosintética del cafeína¹¹. En plántulas de cafeto, se ha demostrado que la radiación de la luz puede aumentar actividad de la CS, que se traduce en un aumento en la biosíntesis de la cafeína. Recientemente, demostró que el mantenimiento de suspensiones celulares de C. arabica L. bajo irradiación de la luz es la condición óptima para la evaluación de los efectos que producen los factores de estrés abióticos que afectan la vía biosintética del cafeína⁸. La información obtenida en estos estudios puede tener aplicaciones en la biología ingeniería y sistemas metabólica para maximizar el estudio de la vía biosintética de la cafeína en estos sistemas in vitro .

Dadas las ventajas de obtener un modelo adecuado para el estudio de la biosíntesis de la cafeína, hemos optimizado las condiciones de extracción de la cafeína en suspensiones celulares de C. arabica L. También fue posible desarrollar un protocolo útil para el estudio de la actividad enzimática así como los pasos metodológicos para evaluar el nivel de las transcripciones del gene del synthase del cafeína de Coffea 1 (ECC1) codificación de esta enzima. Adjunto, Divulgamos un protocolo para extraer y cuantificar cafeína en suspensiones celulares de C. Arábica por cromatografía en capa fina y densitometría (TLC-densitometría).

Protocolo

1. la cafeína extracción en suspensiones celulares de C. arabica L.

1. Uso de suspensiones de células de C. arabica ⁹. Mantener las suspensiones quincenales subcultivos en un medio Murashige y Skoog a pH 4.3 con constante 100 rpm de agitación a 25 ° C bajo luz continua (8,3 W/m²).
2. Cosecha de las células debajo de filtración de vacío utilizando papel de filtro de poro de 11 μm y un embudo de Buchner.
3. Registrar el peso fresco de las células colectadas usando una escala, envuelva en papel aluminio, congelar en nitrógeno líquido y mantenerlos a-80 ° C hasta su análisis.
4. Liofilizar el material celular congelado durante 72 h.
5. Registrar el peso de las células liofilizadas para estimar el rendimiento del peso seco.
6. Almacenar el material en polvo en bolsas de polietileno reutilizables (9 cm x 7,5 cm). Macerar el material a un polvo fino y guárdelo en un desecador hasta su uso.
7. Medir 0.5 g de materia seca de celular en la balanza analítica y agregar a un matraz de vidrio (25 mL).
   1. Añadir 10 mL de acetona a las células liofilizadas y mezclar en un vórtex durante 30 s de homogeneización. Luego, sellar el frasco con papel de aluminio.
   2. La mezcla a 100 rpm usando un agitador a temperatura ambiente (25 ° C) durante 5 h.
8. Transferir todo el material a un tubo cónico de 15 mL y centrifugar a 13.000 x g durante 10 minutos traspaso el líquido a un tubo nuevo de la fase y reducir a él sequedad a temperatura ambiente en la campana.
9. Resuspender la muestra con 25 μl de acetona.

2. condiciones para la evaluación de cafeína por delgada capa de cromatografía (TLC)-densitometría

1. 1 μl del extracto de cafeína previamente resuspendido se aplican a la fase estacionaria.
   Nota: las placas de gel de sílice (F254) se utilizan como la fase estacionaria. Antes de aplicar las muestras, las placas se desarrollaron con 10 mL de Cloroformo-metanol [9:1 v/v] en una cámara de cromatografía (14 cm x 12 cm x 9.5 cm), y las placas se secaron a temperatura ambiente. Las características de la placa cromatográfica donde se aplican las muestras se muestran en la figura 1. La cámara se saturó por 30 min con solvente antes de desarrollar la placa. Placas de TLC deben manipular usando guantes para evitar la contaminación.
2. Desarrollar el TLC en la cámara de cromatografía con 10 mL de la fase móvil ciclohexano-acetona [40:50 v/v].
   Nota: Esta mezcla permite la separación de la cafeína en un factor de retención (Rf) de 0.34.
   1. Retire la placa de TLC de la cámara y dejarla secar completamente a temperatura ambiente.
3. Visualizar bandas de cafeína en la luz ultravioleta de longitud de onda corta (Ultravioleta, 254 nm). Utilice una lámpara de UV compactada. Además, para este paso, uso gafas con protección UV.
4. Cuantificar los niveles de cafeína por densitometría en 273 nm. El instrumento es controlado con el software de cromatografía.

3. ácido ribonucleico (ARN) aislamiento

1. Tomar las suspensiones de células de paso 1.1 y vacío filtrado con papel de filtro (tamaño de poro de 11 μm).
2. Recoger el material celular del papel de filtro, pesar 0.5 g de material celular en una balanza analítica y envuélvalo en papel de aluminio. Congelación de la muestra con líquido N₂.
3. Macerar la muestra de células en un mortero de porcelana con nitrógeno líquido y añadir 1 mL de reactivo de aislamiento de RNA hasta homogeneizada.
   Nota: se deben esterilizar los morteros de porcelana en un horno a 300 ° C por 6 h. RNA aislamiento reactivo contiene isotiocianato de guanidina, fenol y otros componentes.
   1. Transferir 500 μl de la muestra a un tubo de microcentrífuga estéril (1,5 mL). Añadir 300 μL de cloroformo-isoamyl alcohol (24:1) y 300 μL de fenol equilibrado (pH 8.0).
4. Mezclar la muestra con un mezclador de tipo vórtex y luego lo Centrifugue a 20.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
5. Transferir 300 μL de la fase superior a un tubo de microcentrífuga. Añadir 200 μL de isopropanol. Incubar el tubo por 1 h a-20 ° C.
6. Centrifugar el tubo a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° C y luego decantar la fase líquida.
   1. Añadir 1 mL de etanol (70%) para formar un pellet en el tubo. Centrifugar a 12.000 x g durante 10 minutos y decantar. Repita este paso dos veces.
7. Secar la muestra durante 1,5 h a temperatura ambiente (25 ° C). Agite el extracto de RNA con 25 μL de dietil pirocarbonato (DEPC)-agua tratada.
   Nota: Para la extracción de RNA, use agua tratada con DEPC 0.1% v/v.

4. incubación de transcripción de ARN con desoxirribonucleasa (DNasa)

1. En un tubo de microcentrífuga estéril, agregar Extracto de 2 μg de ARN total. Añadir 1 μL de tampón de reacción de 10 x (100 mM Tris-HCl 25 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂). Añadir 1 μL de DNasa U/μL 1.
   1. Llevar la reacción hasta un volumen final de 10 μL con agua tratada con DEPC. Mezcle la muestra y centrifugar brevemente a 2.000 x g durante 1 minuto.
2. Incubar la muestra a 37 ° C durante 30 minutos.
3. Detener la reacción con la adición de 1 μL de 50 mM disódica, dihidrato ethylenediaminetetraacetate (Na₂EDTA) e incubar la muestra a 65 ° C durante 10 minutos.
4. Análisis de la integridad del ARN por electroforesis en gel de agarosa.
   1. Preparar un estándar del gel de agarosa al 1% y tinción con 1 μl de 3 x intercalando solución de tinción de ácido nucleico.
   2. Aplicar 500 ng de ARN a la agarosa gel y correr el gel.
   3. Visualizar la integridad del RNA usando un sistema de documentación de foto de gel.
   4. Uso el RNA como plantilla para síntesis de cDNA por la transcriptasa inversa.

5. como complemento del ácido desoxirribonucléico (cDNA) síntesis

1. Añadir 2,5 μg de RNA total a un tubo de microcentrífuga. Añadir 1 μL de cebador oligo-deoxythymine (dT) y llenar el tubo hasta un volumen final de 13 μL con agua libre de nucleasa. Mezcle la muestra y luego centrifugar a 2.000 x g durante 1 minuto.
2. Incubar la muestra a 65 ° C por 5 min y luego a 4 ° C por 2 min.
3. Añada 4 μL de 5 x buffer de reacción para la transcriptasa reversa, 2 μL de mezcla de Deoxinucleótidos trifosfatos (dNTPs) (10 mM de cada dNTP) y 1 μL de transcriptasa reversa (200 U/μL). Mezclar suavemente y centrifugar a 2.000 x g durante 1 minuto.
4. Incubar la muestra a 45 ° C durante 50 minutos y luego a 70 ° C durante 10 minutos.
5. Cuantificar la concentración de cDNA utilizando un espectrofotómetro UV.
6. Utilice el cDNA como plantilla para la reacción en cadena de polimerasa (PCR).
   Nota: Se utilizó el buffer de reacción 10 x (paso 4.1.1) y 5 veces x concentraron (paso 5.3), respectivamente.

6. en tiempo real PCR cuantitativa (qPCR) para amplificar el gen ECC1

1. Añadir 7,5 μL de Taq ADN polimerasa 2 x (0,1 U/mL) y 0.1 μM de 5-carboxi-X-rodamina (ROX) a un tubo de microcentrífuga PCR.
   Nota: El hot start Taq ADN polimerasa 2 x fue utilizado como una solución 2 x concentrado.
   1. Añadir 5 μL de agua libre de nucleasa.
   2. Añadir 0,75 μL de 10 μM hacia adelante y hacia atrás la cartilla para amplificar el gen ECC1 (AB086414) (forward: 5'-CCTGTATCCTGCGATGAACA-3' y hacia atrás: 5'-AACACTATCATAGAAGCCTTTG-3'). Usar primers de tubulina como el gen de mantenimiento de la casa en una reacción independiente (adelante: 5'-GTGCCCAACTGGGTTCAA-3' y hacia atrás: 5'-CCTTCCTCCATACCTTCACC-3')⁹.
   3. Agregar 600 ng de plantilla de cDNA.
2. Realizar la reacción de amplificación a 50 ° C por 2 min y 95 ° C por 5 min incuban la reacción en el sistema PCR en tiempo real durante 40 ciclos de 95 ° C por 30 s, 60 ° C durante 30 s y 72 ° C por 30 s.
3. Incubar la muestra a 50 ° C para 30 s y 20 ° C durante 10 s.
4. Analizar los datos con el software PCR.
5. Calcular la expresión relativa de la 2-^ΔΔCT método descrito por Livak y Schmittgen (2001)¹².
   Nota: Analizar una reacción de control que contiene todos los componentes excepto la plantilla de la DNA (sin control de plantilla, NTC) reactivos de desecho contaminado o cartilla-dímeros de amplificación.

7. total extracto proteico de suspensiones celulares de C. arabica L.

1. Suspensiones celulares de filtro al vacío con un papel de filtro de poro mediano.
2. Pesar 1 g de material celular y envuélvalo en papel de aluminio.
   1. Congelación de la muestra con nitrógeno líquido. Macerar la muestra en un mortero esterilizado porcelana hasta obtener un polvo fino.
3. Transferir la muestra a un frasco de vidrio y agregar 2,5 mL de tampón de extracción (400 mM tris (hidroximetil) aminometano clorhidrato (Tris-HCl), a pH 8.0, que contienen β-mercaptoetanol de 10 mM, 5 mM Na₂EDTA y ascorbato de sodio 0.5% (p/v).
   1. Mezclar la muestra en un vórtex durante 2 minutos.
      Nota: Es importante que la muestra se mantiene en hielo para evitar la desnaturalización de la proteína.
4. Centrifugar la muestra a 20.000 x g durante 20 min a 4 ° C y transvasar 500 μL en frascos criogénicos (2 mL). Almacenar las muestras a-72 ° C hasta su uso.
5. Medir la concentración de proteína de la muestra a 562 nm en un espectrofotómetro usando análisis ácido bicinchoninic con albúmina sérica bovina como estándar.

8. ensayo enzimático para la cafeína sintasa

1. Preparar una mezcla de reacción en un tubo de microcentrífuga que contiene 200 μm SAM, 4.07 kBq de metilo [³H]-SAM 200 teobromina μm, 200 μm MgCl₂y cafeína 5 μm. Aumentar el volumen a 200 μL con 100 mM Tris-HCl a pH de 8.0.
2. Mantenga el tubo de microcentrífuga en hielo y añadir un volumen de la fracción soluble contiene 7-9 mg de proteína. Luego, mezclar por vortex e incubar durante 30 min a 30 ° C en un baño termostático/circulador. Para un lote de varias muestras, incubar cada muestra por duplicado en períodos de 1 min para dar tiempo suficiente para parar las reacciones para todas las muestras en un período de tiempo exacto de 30 minutos.
   1. Añadir 1 mL de cloroformo para detener la reacción y luego agitar la muestra con un mezclador de tipo vórtex. Agite la muestra usando un mezclador de tipo vórtex durante 3 minutos para eliminar la cafeína radiactiva en el solvente.
3. Centrifugar las muestras a 11.000 x g durante 5 minutos y con cuidado recuperar un volumen de 900 μl. Luego, se transfieren las muestras a viales de centelleo.
4. Evaporar el cloroformo para completar sequedad en la campana a temperatura ambiente a 25 ° C. Añadir 5 mL de líquido de centelleo para el vial y mezclar la muestra.
5. Analizar la radiactividad incorporada en la cafeína en un contador de centelleo.

Resultados

Extractos de cafeína obtenidos mediante el proceso aquí presentado fueron analizados por TLC-densitometría sometiendo las muestras para la placa de cromatografía de acuerdo con el esquema mostrado en la figura 1. Para cuantificar los niveles de cafeína en los extractos de la célula, una curva con diferentes concentraciones del estándar comercial para este compuesto fue utilizado (figura 2A). Se analizó el patrón de absor...

Discusión

Aquí presentamos las condiciones óptimas para evaluar el contenido de cafeína, niveles de actividad y transcripción de CS en una en vitro planta de cultivo de tejidos, tales como suspensiones celulares de C. arabica. Informes anteriores han confirmado que las células manteniendo bajo irradiación de la luz y en presencia de teobromina en el medio de cultivo son los parámetros adecuados para incrementar el nivel de cafeína, lo que es posible evaluar los métodos de separación de la cafeína utili...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Murashige & Skoog Basal salt mixture	PhytoTechnology Laboratories	M524	Packge Size: 50 L Reagent (mg/L) Ammonium Nitrate (1650) Boric acid (6.2) Calcium chloride, anhydrous (322.2) Cobalt Chloride•H2O (0.025) Cupric Sulfate•5H2O (0.025) Na2EDTA•2H2O (37.26) Ferrous Sulfate•7H2O (27.8) Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) Manganese Sulfate•H2O (16.9) Molybdic Acid (Sodium Salt)• 2H2O (0.25) Potassium Iodide (0.83) Potassium Nitrate (1900) Potassium Phosphate, Monobasic (170) Zinc Sulfate•7H2O (8.6) Supplemented with myo-inositol (100) thiamine (10) cysteine (25) sucrose (30000) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 6-benzylamine purine (1)
Caffeine	SIGMA	C0750-5G	STANDARD-5g
Theobromine	SIGMA	T4500	20 g
CAMAG TLC Scanner-4	CAMAG	27.62
WinCATS Planar Chromatography Manager software	CAMAG	1.4.10	Software
Isoamyl alcohol (24:1)	SIGMA	C-0549	500 mL
Cyclohexane	JALMEX	C4375-13	1 L
Acetone	J.T. BAKER	900643	4 L
Methanol	J.T. BAKER	9093-03	4 L
Chloroform	JALMEX	C-4425-15	3.5 L
TLC silica gel 60 F254	Merck	1.05554.0001	TLC plate
β-mercaptoethanol	M6250	SIGMA	100 mL
(+)-sodium L- ascorbate	A4034	SIGMA	100 g
Trizma base	SIGMA	T6066	1 Kg
Hydrochloric acid 36.5-38%	J.T. Baker	9535-05	2.5 L
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo scientific	232227	Kit
Methyl [3H]-S-adenosyl methionine	Perkin Elmer	NET155	Specific activity of 15 Ci/mmol
Liquid scintillation vials	SIGMA	Z253081
Thermostatic bath/circulator	Cole Parmer	60714
Micro centrifugue tube	Eppendorf		Tube of 1.5 mL
Cryogenic vials	Heathrow Scientific	HS23202A	2 mL
Centrifuge 5804	Eppendorf	5804 000925
Vortex	Thermolyne	LR 5947
Porcelain mortar	Fisherbrand	FB961B
Filter paper	Whatman	Z274844	Porosity medium
Picofuge	Stratagene	400550	2000 x g
Analytical balance	AND	HR-120	Model HR-120
Scintillation counter	Beckman Coulter	6500
Gel photodocumentation system	Bio-Rad	Chemic XRS	Model Chemic XRS
Compact UV lamp	UVP	95002112	UVGL-25
Scienceware HDPE Buchner funnel	SIGMA	2419907	Type 37600 mixer
TRIzol reagent	Thermo scientific	15596-018	200 mL
ReverdAid Reverse transcriptase	Thermo scientific	#EP0441	10000 U
Oligo (dT)18 primer	Thermo scientific	#S0131	100 µM
DNase I, RNase-free	Thermo scientific	#EN0525	1000 U
Magnesium chloride	Thermo scientific	EN0525	1.25 mL
Ethylenediaminetetraacetic acid	Thermo scientific	EN0525	1 mL
dNTP mix	Thermo scientific	R0191	R0191
SYBR Green qPCR Master Mix (2X)	Thermo scientific	K0251	For 200 reactions of 25 µL
PikoReal	Thermo scientific	2.2	Software
Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure	USB	J75829	100 mL
Isopropyl alcohol	Karal	2040	1 L
Ethyl alcohol	SIGMA	64175	1 L
Diethyl pyrocarbonate	SIGMA	D5758	100 mL
Lab Rotator	LW Scientific	Mod. LW210