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要約

斑は、様々 な生理学的なプロセスに関わるニューロンの小さいクラスターです。ここでは、蛋白質やこの核で金属の研究のマウスの脳のセクションを準備するためのプロトコルについて述べる。

要約

軌跡青斑核 (LC) は、ノルエピネフリン生理機能の数を調節する神経細胞の生産の主要なハブです。液晶の構造的または機能的な異常皮質、海馬、小脳などいくつかの脳領域に影響を与えるし、うつ病、双極性障害、不安、パーキンソン病、アルツハイマー病に貢献するかもしれない。これらの疾患はしばしば金属 misbalance に関連付けられている、lc における金属の役割は部分的にしか理解されています。LC の形態と機能の研究は、人間の病態と金属の貢献を理解する必要です。マウスは、広く使用されている実験モデル、マウス液晶が小さい (~0.3 mm 径) と非専門家を特定するは難しい。ここでは、マウスの脳で LC をローカライズする段階的な免疫組織化学ベースのプロトコルについて述べる。ドパミン-β-水酸化酵素 (DBH)、およびまた、チロシンヒドロキシラーゼ (TH)、両方の酵素を液晶で高発現は、脳切片での免疫組織化学的マーカーとして使用されます。X 線蛍光顕微鏡 (XFM) による詳細な分析、組織形態学的研究、代謝性のテストと同様の金属のイメージングを含む LC を含むセクションに隣接するセクションを使用できます。

概要

軌跡青斑核 (LC) は、脳幹とノルエピネフリン (NE) 生産1の主要なサイトで重要な地域です。LC 脳2全体の予測を大脳皮質、海馬、小脳3に送信し、概日リズム4、5注意と記憶6を含む主要な生理的プロセスを調節します。7、認知過程8、および感情9,10を強調します。LC の機能不全は、神経疾患、精神神経疾患11を含むパーキンソン病12,13,14アルツハイマー病1415 うつ病に関与しています。 ,16,17, 双極性障害18,19, そして不安20,21,22,23,24します。 これらの役割を考えると、LC の分析はその機能と機能障害を勉強することが重要です。

マウスは、生理学的および病態生理学的プロセスの研究に広く使用されます。サイズが小さいためマウス LC は ~ 300 μ m、構造を見つける難しさにつながるの平均直径を有する。脳の断面、中に、LC は、コロナや矢状のセクションで簡単に逃したことが。動物で LC の同定を記述する利用可能な研究は、ステップバイ ステップのプロトコルを提供していない非専門家が1,25を従うことができます。したがって、LC のローカリゼーションのためのガイダンスを提供するいくつかのアプリケーション (図 1, , 図 2図 3) マウス脳のこの領域を検出する開発したプロトコルについて述べる。プロトコルは、胸高直径26,27, または日24、注意深く制御された脳区分および免疫組織化学的検出 LC28の高濃縮両方の酵素を適用されます。LC を免疫組織化学で見つかったら、隣接する脳スライスはさらなる研究、形態および代謝解析、x 線蛍光顕微鏡 (XFM)29を介して金属のイメージング研究などに使用できます。このプロトコル (図 3) の例として XFM について述べる。

プロトコル

動物の研究は、ジョンズ ・ ホプキンス大学動物ケアと (ACUC) を使用するプロトコル番号 M017M385 によって承認されました。

1. 脳スライス

  1. 固定、3% イソフルランのアプリケーションでマウスを麻酔します。
    1. イソフルランの滴でコットン ボールを浸すし、15 mL 遠心チューブ内に配置します。動物の鼻にチューブを置き、イソフルランを吸い込むことができます。つま先ピンチへの応答の欠乏によって麻酔の深さを確認します。
  2. その裏に動物を置き、その腹部へのアクセスをしながら、T ピンでその四肢を固定することによってそれを固定します。
  3. 腹部の皮膚から切り取り領域することによって手術ハサミで動物をカットし、胸部領域で皮膚をカットします。皮膚 T ピンを釘付けに。胸部まで腹膜の膜を破る。割れ胸腔内横隔膜を切断して、心臓を公開します。
  4. 動物の外に流す血を許可する右房をカットします。左心室に 25 g 針、10 mL シリンジを挿入し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 10 ml を灌流します。
    注: これにより、ソリューションが全身循環と出口を通過する右心房を。
  5. 10 mL 注射器を取り出し、60 mL の注射器に接続されている 25 ゲージの針を挿入します。50 ml の氷冷 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の左心室を介して灌流します。
    1. H2O 10 %pfa 溶液を希釈し、4 ° C で最終 4 %pfa 溶液を低温の氷冷 4 %pfa 溶液を準備します。
  6. マウスの頭を分離し、頭蓋骨から脳を削除します。
    1. 首の皮膚をカットし、頭蓋骨を公開する目に向かって切り取ります。首、鼻を他に 1 つの眼球から頭蓋骨を割る。頭蓋骨の取り出しの皮をむき、脳全体を切除します。
  7. 4% で脳を孵化させなさい 4 ° C で 24 h の PFA
  8. 30% ショ糖溶液の 25 ml、50 mL の円錐管に鉗子で脳を転送します。脳が管の底に沈むまで 4 ° C 48-72 時間でそれを維持します。
  9. 中脳 (前の ~ 3 mm 前後) をマトリックス コロナ、成体マウス脳スライサーと脳をカットします。脳幹を含む脳のセクションを保ちます。
    注: これは 2 つの脳のセクション-(カットの前部) 皮質と脳幹・小脳 (カットの後部) を含む 1 つの含んでいる最もになります。次の手順で脳幹セクションを使用します。
  10. 囲まれた化合物の最適な切削温度 (OCT); 埋め込みの金型の下に置かれたカット表面と脳幹セクションを埋め込む-80 ° C のフリーザーに埋め込まれた脳を移動し、さらに使用するまで、少なくとも 12 時間-凍結します。
  11. クリオスタットで切断:; クライオスタットに年 10 月脳を含む金型埋め込み場所クリオスタットの頭脳のブロックの温度を調整して数時間用クライオスタットでそれを孵化させなさい。
  12. 脳を含む 10 月のブロックを公開する埋め込み型をはがします。
  13. かみそりの刃を使用して、ブロックの面から脳に触れることがなく 10 月の超過分を削除します。
  14. 正面に向かって脳の切断面を公開する、クライオスタットのチャックに 10 月のブロックをマウントします。
  15. それ、クリオスタットの razorblades に平行に配向するように脳の切断面を調整します。
  16. 吻方 100 μ m のセクションをカット、延髄から始まる脳をトリムします。
  17. 小脳と脳幹を 1 つの連続スライス カットまで吻方をトリミングします。50 μ m の厚みでスライスを収集を開始します。
    注: 1 つの髄質から吻方トリム, 脳幹と小脳がカット 2 つの独立したセクションとして。吻側のセクションで、脳幹と小脳が 4th心室レベルで最終的にマージされます。4番目の脳室の横方向のエッジは、小脳と脳幹が 1 つの連続スライスとして出てくるだろうし、整形が。
    1. 鉗子で 10 月囲まれた脳スライスを収集し、それを満ちている PBS (図 2 a) 24 ウェル プレートのウェルに配置。小脳と下丘 ~-5.52 mm 前 (図 1 b) の後方で互いに会うとき、LC は最も著名ななります。
      注: 小脳が完全に切断されている、もはや ~-5.34 mm 前 (図 1 c) の後部の下丘を囲む一度 LC の最も前方部分が表示されなくなります。

2. ドーパミン β-水酸化酵素またはチロシン水酸化酵素 (図 2) の免疫組織化学

  1. 日 1
    1. PBS で 5 分間 3 回選択したスライスを洗います。
    2. 4 ° C で洗剤 (PBSD) 0.5% リン酸緩衝生理食塩水で 24 時間を permeabilize します。
      1. 125 μ L の PBS の 25 の mL の洗剤を希釈します。
  2. 日 2
    1. 0.5% で 5 分間 3 回スライスを洗う PBSD。
    2. 1: 500 で 0.5% の希釈で一次抗体、抗 DBH またはアンチ-日 18 h を追加 4 ° C で PBSD
  3. 日 3
    1. 0.5% で 3 回 10 分間のスライスを洗う PBSD。
    2. 0.5% で 1: 1000 希釈に必要な二次抗体 (488 蛍光グリーンのロバ反うさぎ) を追加 16 h の PBSD。
    3. アルミと 4 ° C の場所で 24 well プレートをラップします。
    4. 0.5% で 5 分間 3 回スライスを洗う PBSD。
    5. PBS で 5 分間洗浄します。
    6. 鉛筆ブラシでスライスを水容器に転送します。
    7. 充電されたスライド上の水に浮かんでいるスライスをマウントします。
    8. (DAPI) なしメディアをゆるませたマウント Coverslip セクション。
    9. 室温で 30 分間マウントされた脳のセクションを乾燥させます。
    10. 適切な二次抗体蛍光波長からの信号を検出するための設定や共焦点蛍光顕微鏡でイメージ脳スライス。
    11. 10 倍の倍率で 1 つの画像を取るし、脳スライスの焦点面に顕微鏡を調整します。
    12. 脳スライスの可能な LC 地域を検索するには、4th心室を使用向き。ポンスと脳幹、小脳は心室の上にある、30以下発見されます。
    13. 4th心室; の横方向のエッジに焦点を当てて、LC を見つけるには、4th心室と橋に向かってポイントの端に由来する LC/脳幹領域 (図 2 b, 2 c)。
    14. 以下の画像と特定の脳のスライスで LC の局在, 4 ° C で脳切片を含むスライドを保存します。

3. 脳スライスで LC の検出

  1. LC を含む脳セクションを見つけます、前述のように、マウスの脳をスライスし、PBS のセクションを収集を図 2 aに示すように 24 よく料理をいっぱい。
    1. LC の適切な局在化を可能にするにあたり 1 つの脳のセクションに配置します。
  2. 脳あたり immunostained になる 48 の脳スライスの合計を収集します。
    注:図 2 aに示すように 2 つの料理のすべての井戸には、1 つの動物から脳スライスが含まれています。
  3. Immunostain 胸高直径、または木のすべての第五のスライス好ましくは、試金されるそれらに隣接しているそれらの脳切片の免疫組織化学を実行 (x 線蛍光顕微鏡、XFM) を経由してさらに。
    注: この手順により、最終的なアッセイのスライスで LC の厳密な局在化のため (図 2 a; 井戸間の数字の付いている)。
  4. 彼らはセンターと、LC または概算だけのエッジの正確な位置を必要とするかどうかは、アプリケーションによっては、例えばimmunostained 脳スライスの数を調整します。
  5. 免疫組織化学、次 4回心室 (図 2 b, 2 c) の両側の式の特徴的なパターンで LC を含む脳スライスを検出します。図 2 d, 2 e; 連続脳スライスの LC で DBH 信号の表示倍率が表示されます。TH を示すために染色は LC の拡大図 2 f.
  6. 金属レベル (図 3) を定量化する XFM の場合それら含む LC のさらなる研究のために隣接するセクションを使用します。
  7. XFM を実行すると、高分子薄膜、試料ホルダーにマウントされているし、できるシンクロトロンでイメージに 10-30 μ m (セットアップ) によって薄いコロナ脳スライスを収集します。
  8. 常温 XFM の高分子薄膜に用意し、実行 XFM 脳スライスを保存します。

4 XFM を介して lc 金属のイメージング

  1. 上記のように例のマウス脳をスライス LC を判断し、LC を含むこれらの脳のスライスから XFM を介して金属の濃度を測定します。
  2. ビームライン 2-ID-E 高度な光子源 (アルゴンヌ国立研究所、イリノイ州アルゴンヌ) での元素分布をイメージ。
  3. 'オンザフライ' データを記録31を前述のよう。
  4. プログラム マップ32,33を使用して液晶を含む脳スライス中元素濃度を決定します。

結果

(Cu、Fe、Zn, Mn) など金属恒常性の変化は、神経学的疾患、LC34,35の変化などで多く観察されます。したがって、脳内金属のレベルを決定する疾患のメカニズムを理解するために必要です。記述のプロトコルを使用して生成された脳のセクションは、Cu と LC で他の金属のレベルを定量化し、LC 以外の地域のレベルにそれらを比?...

ディスカッション

このプロトコルの重要なステップは、供試体を正しく方向づけます。LC (小脳と下丘間の境界) を検索する脳の背側表面の解剖学的特徴を使用している我々 は、ためには、セクションが正しく位置合わせされることが重要です。マウス脳スライサー行列に脳を正しく設定に注意が必要です。核の欠落を回避する LC に前部と後部に 〜 500 μ m より多くの組織を切断をお勧めします。最も一般的な...

開示事項

なし。

謝辞

我々 はマウス コロニーの維持のための Abigael Muchenditsi を感謝します。アルゴンヌ国立研究所で高度な光子源の使用は、米国エネルギー省科学局オフィスの基本的なエネルギー科学、契約番号によって支えられた: デ AC02 06CH11357。ユーザー サポートや高度な光子源援助、オルガ Antipova と博士ステファン Vogt に感謝します。この作品は、SL に国立衛生研究所の助成金 2R01GM101502 で賄われていた。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Adult mouse brain slicer matrixZivic InstrumentsBSMAS001-1
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (source - donkey)Thermo Fisher ScientificA-21206
Charged glass slidesGenesee29-107
Confocal microscopeZeissLSM 800
CryostatMicrom GmbHHM 505E
Cryostat cutting bladesThermo Fisher ScientificMX35
Scissors Mini, 9.5cmAntech Diagnostcs503241
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)Sigma-AldrichD9542-10MG
Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody - inhouse production (source - rabbit)B. Eipper-
Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody - commercially availabe (source - rabbit)Cell Signaling8586
Falcon tubes, 50mlUSA Scientific339652
Forane (isofluorane)BaxterNDC 1019-360-60
Forceps Micro AdsonAntech Diagnostcs501245
Hardset mounting mediaEM sciences17984-24
MicroscopePascalLSM 5
Multi-well plates, 24 wellsThermo Fisher Scientific930186
Optimal cutting temperature compound (OCT)VWR/ tissue tech102094-106
Paraformaldehyde (PFA)/ formalin 10%Fisher ScientificSF98-4
Peel-A-Way disposable embedding moldsPolysciences Inc.18646A
Pencil brush
Phosphate buffered saline (PBS)Life Tech14190250
Razor bladesAmazonASIN: B000CMFJZ2
SpatulasAntech Diagnostcs14374
T pinsOffice Depot344615
The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Paxinos and Franklin, 3rd EditionAmazonISBN: 978-0123694607
Triton-X 100 (to prepare PBSD)Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP7949-500ml
Tyrosine hydroxylase (TH) antibody (source - rabbit)EMD MilliporeAB152
Ultralene thin film for XRFSPEX Sample Prep3525
Wide-field fluorescent microscopeZeissAxio Zoom.V16

参考文献

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