Calretinin の免疫染色を行う直腸吸引生検によるヒルシュスプルング病の診断, S100 タンパク質およびタンパク質遺伝子産物9.5

要約

このプロトコルは、calretinin、S100 タンパク質、およびタンパク質遺伝子産物9.5 に対する免疫染色の直腸吸引生検のプロセスを記載している。ヒルシュスプルング病のためのこの新しいアジュバント診断法は、好ましい感受性および特異性率を有する。

要約

ヒルシュスプルング病 (HD) は、乳児の胎便を通過することができない、または小児の長期便秘として臨床的に明らかにされている先天性腸疾患である。神経節細胞および神経肥大の不在を決定する直腸の吸引のバイオプシー (RSB) は現時点で HD の診断のための最も正確なテストである。従来のヘマトキシリン・エオシン染色は感受性および特異性に欠ける。アセチルコリンエステラーゼ染色は、その複雑なプロセスのために広く使用することはできません.我々が RSBs で行った calretinin、S100 タンパク質およびタンパク質遺伝子産物 9.5 (PGP 9.5) のための免疫染色の新規プロトコルは、96.49% (95% 信頼区間、0.88-0.99) の高感度および特異性率を示し、100% (95% 信頼間隔は 0.97 ~ 1.00) です。HD に影響を受けるセグメントは、calretinin、S100 タンパク質、および粘膜下組織の神経肥大のマーカーである PGP 9.5 の発現が存在しないとしてしばしば存在する。このプロトコルは、この新しい診断方法の詳細な動作プロセスについて説明します。

概要

ヒルシュスプルング病 (HD) は、遠位腸管¹の異なるセグメントにおける神経節細胞の欠乏によって特徴付けられる一般的な先天性腸疾患である。ヒトの腸神経系は、胚性神経細胞の浸潤が完了したときに形成される。プロセスの乱れがあり、侵襲が完了しなかった場合、新生児の遠位腸管は aganglionic²になる。この潜在的に致命的な状態はヒルシュスプルング病と呼ばれます。増殖、運動性、および腸の成長は、コロニー形成の成功の3つの主要な要素である。

限定された粘膜下生検の伝統的なヘマトキシリンおよびエオシン (H & E) 染色は、手術から得られる全厚組織の H & E 染色としての結果に満足できるものとして達成することができない。さらに、直腸の吸引のティッシュのアセチルコリンエステラーゼ (痛み) の染色は 91%、および凍結セクション^3,4の複雑な処理である不十分な感受性が原因で理論的に挑戦的である。ホルマリン固定およびパラフィン包埋標本で染色されることができる神経節細胞および脳繊維の他のいくつかの免疫組織化学的マーカーは、徐々に主流の HD 診断になってきている。Calretinin は、HD 罹患セグメント⁵の myenteric および粘膜下叢において発現されていないビタミン D 依存性カルシウム結合性タンパク質である。S100 タンパク質は、神経線維およびグリア細胞などの神経堤に由来する細胞において発現され、これは、しばしば、HD 罹患セグメント⁶の粘膜下組織における神経肥大を示す。タンパク質遺伝子産物 9.5 (PGP 9.5) は、神経線維および神経節細胞を確実に染色する。PGP 9.5 染色は、特に孤立した hypoganglionosis の場合、calretinin 染色の補足として機能します。S100 および PGP 9.5 との二重染色は、偽陰性率を減少させ、感度を高めることができます。前提条件として、現在の研究は、この新規診断方法の十分な特異性および高感度を確保することを目的とする。私たちの新しいプロトコルは、aganglionic 腸と肥厚性神経線維の識別のために3つのマーカーすべてを使用しました。318子供の将来の研究は、私たちの研究室によって行われ、以前に詳細なプロトコル⁷なしで公開しました。詳細なプロトコルと注意事項については、この記事で説明します。出生後に重度の排便問題を患った新生児、または他の一般的な疾患を除く慢性便秘の小児は、直腸吸引生検 (RSB) の候補となる可能性がある。私達の新しい議定書は RSBs だけでなく、最終的な診断を作るために完全な厚さのバイオプシーまたは外科標本を染色のために適している。

プロトコル

このプロトコルは、科学技術の Huazhong 大学のユニオン病院の研究倫理委員会によって承認されました。

1. 直腸の吸引のバイオプシー

1. 十分に訓練された小児科の外科医によって直腸の吸引のバイオプシーを行い、保護者からのインフォームドコンセントを得た後 Rbi2 吸引の直腸のバイオプシーシステムを使用する助手。
   1. 以下の適応症を有する患者に RSB を行う: 小児の乳児における胎便の通過ができない、または便秘の有無にかかわらず長期膨満感;排便を完了するためにパラフィン油を必要とする長期便秘の子供。enterostomy を受けている子供の原因不明の腸閉塞または腸管穿孔。
      注: RSB のための禁忌は次のとおりです: 重度の症状を有する小児、体調が悪い人、または RSB を許容できない人。急性期腸炎の子供;完全な治癒のない腸の吻合を受けている子供たち.
2. 便の緩みや粘膜の過度の浮腫を避けるために、手順の前に腸の準備 36 h として通常の食塩水保持浣腸を実行します。小児に重度の便秘がある場合は、硫酸マグネシウム溶液を加える。新生児にビタミン K (1mg/kg) を投与する。
   注意: 術前の血液検査や抗生物質の投与は、必須ではないため、行わないでください。
3. 患者を lithotomy 位置に置く。チューブの表面をパラフィンオイルでコーティングします。鈍い端管 4-7 cm を直腸に挿入し、側孔を後部または横壁に向けます。
4. 直腸の壁に側面の穴の適切な付着を促進するために管に穏やかな圧力を加えなさい。トリガーを押して、すぐにツールを撤回してください。
5. バイオプシーの器械を使用して歯科ライン、前方および後方の上の 3 cm そして 6 cm の直径2つの mm の4つの吸引のバイオプシーを得なさい。生理食塩水で湿らせたガーゼに試料を置くために針を使用してください。
6. 処置の後2時間まで患者を観察して直腸出血を除外します。RSB 後の最初の24時間で、さらなる直腸および肛門の操作を避けてください。

2. RSB セクションの準備

1. 直腸の吸引のバイオプシーを 6 h のための 4% パラホルムアルデヒドにティッシュを固定するために置きなさい。組織容積の5倍以上の固定液容積を使用する。
2. 11時間の病理組織脱水機を用いて組織を脱水する。プログラム全体のプロセスは、次の5つの手順で構成されています。
   1. ホルムアルデヒドで組織を配置し、1時間を固定します。
   2. 75% エタノールに4時間組織を置きます。
   3. 組織を絶対エタノールに入れます (2 つの変化、それぞれ1時間)。
   4. 組織を絶対エタノールに入れます (2 つの変化、それぞれ30分)。
   5. ティッシュをキシレン (3 つの変化、それぞれ 1 h) に置きます。
3. 組織をパラフィンワックス (58-60 ° c) に置きます (3 つの変化、それぞれ1時間)。パラフィンブロックに RSB 組織を埋め込みます。
4. 組織が完全な断面で露出されるまで、ミクロトームを使用してパラフィンブロックをトリムします。
5. ミクロトームの0.4 μ m セクションにブロックを切りなさい。
6. セクションを平らなプレートに広げることができるように、各セクションを数秒間45-50 ° c の水に入れます。
7. パラフィンセクションをスライドに移動します。
8. スライドを60° c のオーブンで 3-5 h で焼く。長時間焼くことは避け、抗原の消失につながる可能性があります。
9. 張り付けスライドをキシレン (2 変更、各15分) に配置します。
10. スライドを無水エタノール、95%、80%、および 75% エタノールでそれぞれ5分間水和させる。次に、逆浸透 (RO)-精製水を別の5分間でそれらをすすいでください。

3. 抗原検索

1. 200 mL の RO 精製水で EDTA 抗原抽出バッファー 4 mL を混合することにより、calretinin 検索のための作業希釈を行います。99 mL の RO 精製水を使用してクエン酸ナトリウム (100x) を 1 mL 混合して、S100 および PGP 9.5 検索のための作業希釈を行います。
   注: Calretinin は、EDTA 検索ソリューションによって優先的に取得できます。ただし、S100 およびのクエン酸ナトリウムの緩衝液は、S100 および PGP 9.5 の検索に適しています。
2. スライドを coplin 染色瓶に入れます。取り出し溶液でジャーを充填し、予熱した熱湯浴に置きます。20分間沸騰させた後、水浴から瓶を取り出し、室温まで冷まします。冷却プロセスには約10分かかります。スライドを除去し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で軽くすすぎます。
3. 組織の周りにマーカーペンで円を描き、次の手順のための濡れたボックスを準備します。

4. ブロッキング

1. 30% H2 の 3 mL と RO 精製水の27 mlを混合して、作業希釈を行います。
2. 3% H2o 2 溶液を 2 ~ 3滴加えて組織に滴下し、peroxidates を遮断する。H2 溶液を速やかに追加して、溶液が円からあふれないようにします。37° c のインキュベーター内で peroxidates のブロッキングを20分間行います。
3. PBS (3 回の洗浄、それぞれ5分) でスライドをやさしくすすいでください。
4. 5% ウシ血清アルブミン (BSA、30 mL の RO 精製水と BSA 粉末の 1.5 g を混合することによって調製) で20分37° c でスライドをブロックします。
   注: 3% H2o でのブロッキングは 、非特異的染色および 5% BSA によるブロッキングの 95% を防ぐことができ、非特異的染色の他の 5% を防ぐことができます。信頼性の高い結果を得るために2つのメソッドを組み合わせます。

5. 抗原抗体反応

1. 5% BSA を取り外し、1次抗体 (calretinin、S100、または PGP 9.5) の50μ l をスライドに加えます。4° c で一晩インキュベートします。
2. スライドを PBS (3 回、各3分) で洗います。
3. セクションに50μ l のポリマーエンハンサー (試薬 A;材料のテーブルを参照) を加え、37° c のインキュベーター内で20分間インキュベートします。次に、スライドを PBS (3 回、各3分) で洗浄する。
4. セクションに50μ l の二次抗体 B (ヤギ抗ウサギ/マウス IgG 二次抗体) を加え、37° c のインキュベーター内で30分間インキュベートします。セクションを PBS で洗ってください (それぞれ3回、5分ずつ)。

6. 3、3-ジアミノベンジジンおよびヘマトキシリン染色

1. 850μ l の RO 精製水を 1.5 mL チューブに加え、A、B、および c. の順序で染色試薬 (材料の表を参照) を加えます。各試薬の50μ l を加えて、合計1ml の 3, 3-ジアミノベンジジン (DAB) 作業溶液を得る。沈殿物がある場合は、濾過後に溶液を使用する。
2. DAB 作業用ソリューションをティッシュセクションに追加し、3-10 分間染色します。茶色の染色が検出されるまで、室温で DAB でスライドをインキュベートします。明視野の顕微鏡を使用して注意深く監察しなさい。DAB 作業用ソリューションを光から遠ざけてください。次に、PBS でスライドを5分間洗浄する。
3. 約1分間核を対比染色するためにヘマトキシリンのドロップを追加します。その後、coplin を保持し、余分な染料が除去されるまで約 30-40 s のための水のトリクルの下で洗ってください。ティッシュのセクションを傷つけないように注意しなさい。
4. RSB のスライドを 25-30 s の PBS を含む coplin 瓶に浸します。その後、1% 塩酸エタノールを10秒間に分化させる。スライドを PBS で1分間洗浄します。
5. 水和とは逆の順序でスライドを脱水します:75%、80%、95%、絶対エタノール (各5分)。
6. スライドをキシレン (2 変更、各5分) に公開します。
7. ウルトラクリーンマウントを使用してカバースリップをマウントします。顕微鏡を使用して可視化する前にスライドを乾燥させます。

結果

合計で、318人の患者が我々の研究に登録された。全ての患者は RSB を経験し、組織は calretinin、S100、および PGP 9.5 のために染色された。私たちの斬新なプロトコルに基づく診断は、97ケースで HD、非 HD は213のケースで、HD は8ケースで疑われました。手術後の132人の外科患者のうち、99人の患者は、外科手術後に全厚の標本を免疫染色することで HD と診断された。S100 ?...

ディスカッション

ここでは、HD の診断のために RBS セクションを染色する3つの異なる免疫組織化抗体を用いた手順について説明した。診断プロトコールの感度は 96.49% (95% CI, 0.88-0.99) であり, 特異性は 100% であった (95% CI, 0.97-1.00)。

プロトコルの最も重要なステップは、RSB および抗原抗体反応である。生検のサイズは、染色の精度を決定する。小さな生検は、正確な診断を下すために十分?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
calretinin antibody	MXB Biotechnologies	MAB-0716 170416405c	antibody: primary antibody
S-100 antibody	MXB Biotechnologies	Kit-0007	antibody: primary antibody
PGP9.5 antibody	Shanghai long island antibody Co. Ltd	R-0457-03	antibody: primary antibody
enhancer reagent	MXB Biotechnologies	KIT-9902-A 170416405a	antibody: secondary antibody A
Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary Antibody	MXB Biotechnologies	KIT-9902-B	antibody: secondary antibody B
DAB staining kit (containing reagent A B and C)	MXB Biotechnologies	DAB-0031	staining kit
Heat incubator	Shanghai yiheng instrument Co. Ltd	DHP-9082	instrument
Rbi2 suction rectal biopsy system	Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia	CP1200 HP1000 SS1000	instrument
microtome	Leica	leica RM2016	instrument
citric acid sodium citrate buffer(100X)	MXB Biotechnologies	MVS-0101	antigen retrieval buffer
pathological tissue dehydrator	wuhan junjie electronic Co. Ltd	JT-12F	instrument