Cuantificar la distribución heterogénea de una proteína sináptica en el cerebro de ratón mediante inmunofluorescencia

Resumen

Aquí, describimos un enfoque cuantitativo para determinar la distribución de una proteína sináptica en relación con un marcador proteico utilizando tinción de inmunofluorescencia, microscopia confocal y análisis basados en computadoras.

Resumen

La presencia, ausencia o niveles de proteínas sinápticas específicas pueden influir seriamente en transmisión sináptica. Además de dilucidar la función de una proteína, es vital para determinar su distribución. Aquí, describimos un protocolo de empleo de la inmunofluorescencia, microscopia confocal y análisis computarizado para determinar la distribución de la proteína sináptica Mover (también llamado TPRGL o SVAP30). Comparamos la distribución del motor a la de la vesícula sináptica proteína sinaptofisina, determinando la distribución del motor en términos cuantitativos en relación con la abundancia de vesículas sinápticas. En particular, este método podría aplicarse potencialmente para permitir la comparación de la distribución de proteínas con diversos anticuerpos o microscopios o a través de diferentes estudios. Nuestro método evita la variabilidad inherente de los stainings inmunofluorescentes cediendo una relación en lugar de los niveles de fluorescencia absoluta. Además, el método que se describe permite al investigador analizar la distribución de una proteína en diferentes niveles: desde rebanadas de todo el cerebro a regiones del cerebro a diversas subregiones de zona de un cerebro, como las diferentes capas del hipocampo o sensorial cortezas. Es una proteína específica de vertebrados que se asocia con vesículas sinápticas. Con este método, se muestra que Mover es heterogénea en las áreas del cerebro, con altos niveles en el pallidum ventral, el núcleo septal y la amígdala y también en áreas individuales del cerebro, como las diferentes capas del hipocampo.

Introducción

Comunicación entre las neuronas sucede en sitios especializados de contacto denominados sinapsis. Las sinapsis contienen un gran número de proteínas diferentes que orquestar la transmisión sináptica. Algunas de estas proteínas muestran una distribución heterogénea en todo el sistema nervioso y no están presentes en cada sinapsis¹. Un ejemplo de tal proteína es Munc13, que participa en el proceso de cebado de vesículas sinápticas. Existen diferentes isoformas de Munc13, que están distribuidos heterogéneamente en el cerebro², y la presencia o ausencia de isoformas específicas puede influir en la plasticidad sináptica a corto plazo y vesícula sináptica dinámica^{3, 4 , 5}. por lo tanto, es de vital importancia para poder identificar la presencia de diferentes proteínas sinápticas entre áreas del cerebro.

Los métodos de elección para la cuantificación de proteínas sinápticas - hasta ahora - son la espectrometría de masas y de Western Blot, en lugar de inmunohistoquímica^6,7,8,9. En algunos casos, se utilizan varios métodos que se complementan entre sí para evaluar la cantidad y la localización de proteínas específicas (es decir, Wilhelm et al. ¹⁰). el método se describe aquí permite la localización y cuantificación de proteínas de interés sin la necesidad de utilizar cualquier método bioquímico, simplemente empleando los stainings inmunofluorescentes. Otra ventaja aquí es que la cuantificación puede realizarse sobre áreas mucho más pequeñas y, por lo tanto, más específicos, que el logrado por otros métodos. Sin embargo, hay que tener en cuenta que una proteína de referencia confiable es necesario para evaluar la distribución de la proteína de interés.

Fluorescente de tinción por inmunohistoquímica permite identificar rutinariamente la localización de proteínas entre las áreas del cerebro, así como dentro de diferentes compartimientos neuronales. Para identificar los diferentes compartimentos, se utilizan marcadores específicos. Por lo general, los anticuerpos contra la sinapsina y synaptophysin¹¹ pueden utilizarse para etiqueta de vesículas sinápticas, mientras que la zona activa de un terminal presináptico¹²la etiqueta anticuerpos contra fagot. Transportadores vesiculares, como los transportadores vesiculares de glutamato (vGluT) o el transportador vesicular de GABA (vGAT), se utilizan para etiquetar excitatorios¹³ e inhibitorio¹⁴ terminales presinápticos, respectivamente. En el lado postsináptico, anticuerpos contra la proteína Homer pueden ser empleados para marcar las terminales postsinápticas y anticuerpos contra densidad postsynaptic proteínas 95 (PSD95)^15,16,17 o gephyrin^{18 , 19 , 20} puede etiquetar terminales postsinápticos excitatorios o inhibitorios, respectivamente. Mediante el uso de anticuerpos contra una proteína de interés y marcadores tales como los descritos anteriormente, uno puede determinar la localización de dicha proteína. Muchos estudios hasta la fecha han hecho esto en una forma cualitativa²¹. Sin embargo, determinar confiablemente la distribución diferencial de una proteína sináptica específica, uno debe no sólo determinar su presencia o ausencia sino también su concentración relativa. La heterogeneidad de tamaños y densidad de las sinapsis, es importante establecer una relación entre el marcador sináptico y la proteína de interés. De lo contrario, muestra una alta densidad de proteínas sinápticas, solamente debido a la mayor densidad de sinapsis pero no debido a una fuerte presencia de esa proteína en regiones ricas en sinapsis como las capas no piramidal del hipocampo y la capa molecular del cerebelo cada sinapsis (por ejemplo, Wallrafen y Dresbach¹). Por otro lado, las proteínas en el soma neuronal (p. ej., TGN38²²) generalmente presentan fuerte presencia en la capa de células piramidales hipocampales o capa de células de hipocampo o cerebelosas del gránulo debido a la alta concentración de cuerpos celulares neuronales en esas áreas. Por lo tanto, esta distribución no homogénea de las estructuras, en este caso sinapsis, puede conducir a una falsa estimación de la distribución de la proteína del interés propio. Además, hay una variabilidad intrínseca en la tinción de intensidades a través de muestras en los stainings de immunohistochemical. El protocolo descrito aquí tiene esto en cuenta y evita tales sesgos, así como otras advertencias que surgen de métodos inmunohistoquímicos.

En nuestro reciente estudio, hemos utilizado este método para describir la expresión diferencial del motor (también denominado TPRGL²³ SVAP30²⁴) a través de 16 cerebro diferentes zonas¹. Es una proteína sináptica específica de vertebrados que puede encontrarse en asociación a las vesículas sinápticas e influye neurotransmisor lanzamiento^25,26,27. Hemos relacionado la expresión de Mover a la abundancia de vesículas sinápticas, de coloración para el synaptophysin como un marcador de referencia de la vesícula sináptica. Se encontraron altos niveles del motor particularmente en la amígdala, los núcleos septales y el pallidum ventral. En el hipocampo, encontramos una distribución heterogénea de Mover, con altos niveles en las capas asociadas con cómputo intra-hippocampal y bajos niveles en las capas de entrada y salida.

Protocolo

Este protocolo no implica experimentos en animales vivos. Experimentos con euthanizing animales para obtener muestras de cerebro fueron aprobados por las autoridades locales de protección animal (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) bajo el número T 10/30.

Nota: Para este protocolo, se utilizaron ratones C57BL/6 de machos adultos 3.

1. preparación de la muestra

1. Preparar fijador y tampón de fosfato de 0,1 M (PB; ver tabla 1).
2. Fijar el animal por la perfusión de transcardial como se describe en Gage et al. ²⁸. primero lavar la sangre con 0.9% de solución de NaCl, luego perfusión con 30 mL de paraformaldehído al 4% (PFA).
3. Abrir el cráneo con las tijeras y aislar cuidadosamente el cerebro con una cuchara con cantos romos para evitar dañar el tejido.
4. Llene un tubo de reacción de 50 mL con fijador y postfix el cerebro en el 4% PFA a 4 ° C durante la noche.
5. Retirar el fijador y lavado el cerebro en 50 mL de 0.1 M de PB en un agitador durante 30 minutos.
6. Después del lavado, incubar el cerebro en un tubo de reacción de 50 mL en 30% de sacarosa en PB 0.1m durante 48 h o hasta que se hunde en el tubo a 4 ° C para crioprotección.
7. Recorte el cerebro de cryoprotected con una cuchilla afilada, colocar en una cryomold e incrustar con la temperatura de corte óptima (OCT) compuesto. Evitar las burbujas. Oriente el cerebro y congelar el cryomold en el congelador de-80 ° C.
8. Montar el tejido congelado para seccionamiento. Equilibrar el tejido a la temperatura de cryomicrotome para por lo menos 15 min antes de seccionamiento.
9. Sección del cerebro en 25 μm espesor rebanadas coronales. Toque el OCT cuidadosamente con un gancho de vidrio sin tocar el tejido cerebral. Recoger 3 rebanadas adyacentes por pozo en una placa bien 24 y almacenarlas en PB 0.1m a 4 ° C hasta la coloración.
   Nota: El protocolo puede hacer una pausa aquí durante dos semanas. Tiempo de almacenamiento puede interferir con la calidad del tejido y así influir en el resultado del experimento.

2. inmunofluorescencia

1. Preparar soluciones incluyendo el amortiguador de bloqueo, almacenador intermediario del anticuerpo, lavado tampón 1 y el tampón de lavado 2 (ver tabla 1).
2. Enjuague trozos de una vez con PB para quitar exceso OCT.
   1. Retirar la solución con una pipeta de plástico sin aspirar en las rebanadas de cerebro. Añadir 250 μl de PB fresco con una pipeta de 1000 μl.
      PRECAUCIÓN: Rebanadas deben no, así que quitar y añadir líquidos bien por bien.
3. Retirar el PB con una pipeta de plástico y añadir 250 μl de solución amortiguadora de bloqueo por pozo con una pipeta de 1000 μl. Incubar durante 3 h a temperatura ambiente (RT) en el agitador.
4. Durante el tiempo de incubación, diluir los anticuerpos primarios en tampón en un tubo de reacción de anticuerpos. Utilizar 250 μl de tampón de anticuerpo por bien y añadir la cantidad adecuada de anticuerpos (ver tabla 2) mediante Pipeteo directamente en la solución con una pipeta de 2 μl. Mezcle la solución mediante pipeteo suavemente arriba y abajo varias veces. Vórtice poco después para asegurar una mezcla adecuada.
   Nota: Para determinar la fluorescencia de fondo, los stainings debe también realizarse sin añadir el anticuerpo primario. Para ello, incubar la rebanada en la solución de anticuerpo sin anticuerpos primarios según el protocolo.
5. Después del tiempo de incubación, retirar el amortiguador de bloqueo con una pipeta de plástico y añadir 250 μl de solución de anticuerpo que contiene anticuerpos primarios por pozo. Incuban rebanadas con anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C en un agitador.
6. Al día siguiente, lave las rebanadas con lavado tampón 1 3 x 10 min a temperatura ambiente en un agitador.
   1. Retirar el medio con una pipeta de plástico y añadir 300 μL de buffer 1 de lavado por pocillo. Incubar a temperatura ambiente por 10 minutos, repetir 3 veces.
7. Durante los pasos de lavado, diluir los anticuerpos secundarios fluoróforo acoplado en tampón en un tubo de reacción de anticuerpos. Utilizar 250 μl de tampón de anticuerpo por bien y añadir la cantidad adecuada de anticuerpos (ver tabla 2) mediante Pipeteo directamente en la solución con una pipeta de 2 μl. Mezcle la solución mediante pipeteo suavemente arriba y abajo varias veces. Vórtice poco después para asegurar una mezcla adecuada.
   PRECAUCIÓN: Debido a que los anticuerpos son sensibles a la luz, todos los pasos desde este punto en necesitan a realizarse en la oscuridad.
8. Tras los pasos de lavado, quitar el lavado tampón con una pipeta de plástico y añadir 250 μl de solución de anticuerpo que contiene anticuerpos secundarios por pozo. Incubar las rebanadas con el anticuerpo secundario durante 90 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
9. Lavar las rodajas con lavado Tampón 2 3 x 10 min a TA.
10. Durante los pasos de lavado, diluir 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) en 0,1 M de PB en una concentración de 1: 2000.
11. Eliminar el tampón de lavado 2 con una pipeta de plástico y añadir 250 μl de solución DAPI por pozo. Incubar por 5 min a temperatura ambiente en la coctelera.
12. Retirar la solución DAPI con una pipeta de plástico y agregar 500 μl de 0,1 M de PB por pozo con una pipeta de 1000 μl.
13. Monte cortes sobre portaobjetos.
    1. Colocar un portaobjetos bajo el estereoscopio. Con un pincel fino, añadir tres gotas separadas de 0,1 M de PB en la diapositiva. Coloque una rebanada por cada gota sobre el portaobjetos.
    2. Utilice el pincel fino para aplanar y orientar los cortes sobre el portaobjetos.
    3. Cuando todos los sectores estén posicionados correctamente, quite exceso PB con un pañuelo y secar el portaobjetos cuidadosamente.
       PRECAUCIÓN: Evitar que se sequen totalmente las rebanadas de cerebro.
    4. Añadir 80 μl de incrustación medio en la diapositiva. Baje cuidadosamente el cubreobjetos sobre el portaobjetos, así incorporar las rebanadas de cerebro.
    5. Dejo las diapositivas para secar en la campana para 1-2 h (cubierta para evitar la exposición a la luz) y guardarlos en una caja de portaobjetos de microscopio a 4 ° C.
       Nota: El protocolo se puede detener aquí.

3. la proyección de imagen

1. Después de que el medio de inclusión es totalmente endurecido, coloque el portaobjetos en el microscopio confocal.
   Nota: Microscopía de epifluorescencia, combinado con el software de deconvolución debe producir calidad de imagen similar.
2. Ajuste el laser aumentando o disminuyendo la intensidad del láser para cada canal de modo que algunos píxeles sobreexpuestas para una máxima distribución de valores de gris.
3. Adquirir tejidos virtuales de la rebanada del cerebro entero para los distintos canales.
   1. En el software de proyección de imagen (véase Tabla de materiales), seleccione la opción de azulejos y delinear manualmente la rebanada del cerebro con la Configuración de región de azulejo.
   2. Distribuir puntos de apoyo en toda la región de azulejo y ajustar el enfoque para los puntos de apoyo diferentes presionando Verificar azulejo regiones/posiciones...
   3. Ajustar la configuración en el Modo de adquisición según el tamaño deseado de la resolución y el archivo de la imagen resultante y empezar la exploración.
4. Una vez terminada la exploración, utilizar la función de costura para procesar el tejido virtual. Exporte el archivo como un .tif con la función de Exportación de la imagen.

4. análisis informático

1. Cargar todos los canales solo para una imagen en FIJI²⁹ haciendo clic en archivo | Abierto.
2. Con la herramienta selección a mano alzada , delinear un hemisferio en el canal del DAPI. Crear una máscara de la selección haciendo clic en edición | Selección | Crear máscara.
3. Determinar la intensidad de fluorescencia media de los canales individuales (Mover y sinaptofisina) haciendo clic en analizar | Medida.
   Nota: Asegúrese de seleccionar los canales diferentes para determinar los valores de intensidad de fluorescencia media para cada canal.
4. Copie la intensidad de fluorescencia media de los canales individuales en una hoja de cálculo.
5. Determinar la intensidad de fluorescencia media para los canales solo en un área de interés por delinear la zona también con la herramienta selección a mano alzada . Usar un atlas del cerebro de ratón como referencia.
6. Repita los pasos 4.1-4.5 para los hemisferios y en todas las áreas de interés.
   Nota: Determinar los valores para cada hemisferio por separado para luego comparar los valores de un área de interés para que en el hemisferio (ver paso 5.2).

5. manejo de datos

1. En el caso de la fluorescencia de fondo es alta (ver discusión), puede necesitarse una sustracción de fondo. Para ello, determinar la intensidad de fluorescencia media para la rebanada procesada sin anticuerpo primario contra la proteína de referencia (aquí: sinaptofisina) y restar ese valor de todos los valores obtenidos para las regiones del cerebro y hemisferios.
2. Cuando las intensidades de fluorescencia promedio de los canales individuales para cada hemisferio y cada área de interés se han determinado (ver tabla 3), calcular el cociente de Mover al synaptophysin dividiendo el valor para Mover el valor para el synaptophysin ( amarillo en la tabla 3). Realizar esta acción para cada área de interés y cada hemisferio por separado.
3. Dividir el cociente obtenido para un área de interés por la relación obtenida para el hemisferio correspondiente (color naranja en la tabla 3) para determinar la relación entre el área de interés para el hemisferio.
4. Para determinar la abundancia relativa de Mover, traducir la relación obtenida 5.2 en un porcentaje por determinar su desviación de 1 (en rojo en la tabla 3). Una proporción de 1.25 por lo tanto daría una abundancia relativa de la Mover de un 25% por encima de la media, y una proporción de 0,75 produciría una abundancia relativa de la Mover de un 25% por debajo de la media.

Resultados

Representante de patrones de diferentes marcadores de tinción puede verse en la figura 1. El patrón varía en función de la distribución de la proteína. Se muestran ejemplos de cinco niveles rostro caudal en columnas (A)-(E). Un representante de tinción DAPI se muestra en la primera fila: DAPI se adhiere al ADN de una célula y por lo tanto se tiñen los núcleos. Esto resulta en un patrón punteado. Regiones con una al...

Discusión

El método había presentado aquí tiene como objetivo cuantificar la distribución de una proteína de interés en relación con la abundancia de una proteína del marcador con una distribución conocida. Tinción de inmunofluorescencia puede mostrar una alta variabilidad de la coloración de intensidades entre los diferentes sectores. El enfoque de cuantificación descrito aquí evita este problema mediante la determinación de la proporción de la proteína de interés para el medio a través del hemisferio. Por lo ta...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL reaction tubes	Eppendorf	30120094
50 mL reaction tubes	Greiner Bio-One	227261
multiwell 24 well	Fisher Scientific	087721H
plastic pipette (disposable)	Sarstedt	861,176
1000 mL pipette	Rainin	17014382
2 ml pipette	Eppendorf	3123000012
Vortex Genius 3	IKA	3340001
Menzel microscope slides	Fisher Scientific	10144633CF
Stereoscope	Leica
LSM800	Zeiss		Confocal microscope
freezing microtome	Leica
PBS (10X)	Roche	11666789001
PFA	Sigma	P6148-1kg
NaCl	BioFroxx	1394KG001
sucrose	neoFroxx	1104KG001
Tissue Tek	Sakura	4583	OCT
Na2HPO4	BioFroxx	5155KG001
NaH2PO4	Merck	1,063,460,500
normal goat serum	Merck Millipore	S26-100ML
normal donkey serum	Merck	S30-100ML
Triton X-100	Merck	1,086,031,000
rabbit anti-Mover	Synaptic Systems	RRID: AB_10804285
guinea pig anti-Synaptophysin	Synaptic Systems	RRID: AB_1210382
donkey anti-rabbit AF647	Jackson ImmunoResearch	RRID: AB_2492288
goat anti-mouse AF488	Jackson ImmunoResearch	RRID: AB_2337438
Mowiol4-88	Calbiochem	475904
ZEN2 blue software	Zeiss		Microscopy software
FIJI	ImageJ		Analysis software
Microsoft Excel	Microsoft