Diskriminierung von sieben Immunzelle Teilmengen von zwei-Fluorochrom Flow Cytometry

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Fluss durchflusszytometrischen Protokoll um CD4 zu identifizieren⁺ und CD8⁺ T Zellen, γδ T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen und Monozyten im menschlichen peripheren Blut durch Verwendung von nur zwei Fluorochromes anstelle von sieben. Mit diesem Ansatz können fünf zusätzliche Markierungen auf den meisten fließen Cytometers aufgezeichnet werden.

Zusammenfassung

Immunzelle Charakterisierung stützt sich stark auf multicolor Durchflusszytometrie, basierte auf differentielle Expression der Oberflächenmarker Subpopulationen zu identifizieren. Setup von einem klassischen multicolor Panel erfordert High-End-Instrumente, benutzerdefinierte beschriftete Antikörper und sorgfältiges Studiendesign spektrale Überlappung zu minimieren. Wir entwickelten eine multiparametric Analyse, um die großen menschliche Immunsystem Populationen zu identifizieren (CD4⁺ und CD8⁺ T Zellen, γδ T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen und Monozyten) im peripheren Blut durch die Kombination von sieben Linie Marker mit nur zwei Fluorochromes. Unsere Strategie basiert auf der Beobachtung, dass Linie Markierungen ständig in einer einzigartigen Kombination von jeder Zellenbevölkerung ausgedrückt werden. Kombinieren diese Informationen mit einer sorgfältige Titration der Antikörper ermöglicht Ermittler, fünf weitere Symbole erweitert die optische Grenze von den meisten fließen Cytometers aufzuzeichnen. Direktvergleich gezeigt, dass die überwiegende Mehrheit der immun-Zell-Populationen im peripheren Blut mit vergleichbarer Genauigkeit zwischen unsere Methode und die klassische "ein Fluorochrom-One Marker Approach", charakterisiert werden kann, obwohl letztere ist nach wie vor genauer gesagt zur Identifizierung von Bevölkerungsgruppen wie NKT und γδ T-Zellen. Kombination von sieben Marker mit zwei Fluorochromes ermöglicht die Analyse von komplexen immun-Zell-Populationen und klinischen Proben auf erschwingliche 6-10 Fluorochrom fließen Cytometers und sogar auf 2-3 Fluorochrom Feldgeräte in Gebieten mit begrenzten Ressourcen. High-End-Geräte können auch von diesem Ansatz profitieren, mit zusätzlichen Fluorochromes, um tiefer Flow-Zytometrie-Analyse zu erreichen. Dieser Ansatz eignet sich auch sehr gut für das screening von mehreren Zellpopulationen im Falle von klinischen Proben mit begrenzten Anzahl von Zellen.

Einleitung

Durchflusszytometrie ist eine Technik, die entwickelt wurde, um mehrere Parameter auf einzelne Teilchen mit einer Geschwindigkeit von mehreren tausend von Ereignissen pro Sekunde¹zu analysieren. Beispiele von Flow Cytometry analysierten Proben enthalten, aber sind nicht beschränkt auf, Perlen, Bakterien, Vesikel, Zellen und Chromosomen. Fluidische System leitet Partikel zum Verhör Zeitpunkt jedes Partikels kreuzt ihren Weg mit einem oder mehreren Lasern, wobei mehrere Parameter sind für die weitere Analyse aufgezeichnet. Nach vorne und seitliche Streuungen, durch Streuung von der reinen Laserlicht erzeugt werden verwendet, um die Zielgruppe zu identifizieren und Abrufen von Informationen über die relative Größe und interne Komplexität/Granularität der Teilchen, bzw.. Alle anderen Parameter, die meisten Daten in einer durchflusszytometrischen Analyse Rechnung zu tragen, werden durch Fluorochrom-markierte Sonden abgeleitet, die erkennen und binden an spezifische Ziele auf die Partikel von Interesse.

Durchflusszytometrie ist ein wichtiges Werkzeug für immunologische Studien zu identifizieren und zu charakterisieren, Zell-Populationen. Um die Komplexität des Immunsystems zu sezieren, werden mehrfarbige Tafeln ständig weiterentwickelt, erweitern die Anzahl der Markierungen, die gleichzeitig für tiefe Immunphänotypisierung der Zelle Bevölkerungen¹aufgezeichnet. Dies führt zu der Entwicklung leistungsfähiger Instrumente und Fluorochromes, mit den letzten High-End-fließen Cytometers von mehr als 20 fluoreszierenden Parameter. Dies führt zu komplexen Studiendesign aufgrund Fluorochrom spektrale Überlappung und höhere Kosten im Zusammenhang mit benutzerdefinierten Antikörper Kennzeichnung und qualifizierte Betreiber. In mehreren Fällen Komplexität und Kosten werden reduziert, mit separaten Feldern Marker für verschiedene Zellpopulationen. Dieser Ansatz jedoch fehleranfällig ist, reduziert die Information in jeder Gruppe und kann schwierig sein, auf Proben mit begrenzten Anzahl von Zellen anwenden. Darüber hinaus schließt die Erhöhung der Anzahl der Marker Tiefe Immunphänotypisierung auf Instrumente mit weniger fluoreszierende Parametern. Wir zuvor entwickelt Färbung Protokoll um große Bevölkerungsgruppen immun zu identifizieren (CD4⁺ und CD8⁺ T Zellen, γδ T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen und Monozyten) in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) durch die Kombination von sieben Linie Markierungen mit nur zwei Fluorochromes anstelle von den sieben erforderlich mit Hilfe der traditionellen "ein Fluorochrom-One Marker" Ansatz (www.hcdm.org)^2,3. Unserem erste Bericht untersucht und bestätigt das Konzept der Kombination von sieben Markierungen in zwei Fluorochromes für tiefe Immunphänotypisierung. In diesem Bericht stellen wir eine Schritt-für-Schritt-Protokoll zu isolieren und peripheren Blutzellen beflecken mit Schwerpunkt auf den praktischen Aspekt und Problembehandlung Schritte, um eine erfolgreiche Färbung zu erreichen.

Dieses Protokoll basiert auf der Beobachtung, dass Linie Marker einen konstanten Ausdruck auf der Zelloberfläche und dass jede Zellpopulation eine exklusive Kombination von Linie Marker hat. In PBMCs, CD3 Ausdruck Immunzellen in zwei Hauptkategorien unterteilt: CD3-positiven T-Lymphozyten und CD3-negativen Zellen. Innerhalb der CD3 positiven Untergruppe, CD4⁺, CD8⁺ und γδ T-Zellen mit Antikörpern, die ausschließlich CD4, CD8 und der γδ-Rezeptor getrennt werden können. In vergleichbarer Weise, innerhalb der CD3 negativen Untergruppe können B-Zellen, NK-Zellen und Monozyten eindeutig identifiziert werden mit Antikörpern gegen CD19, CD56 und CD14, beziehungsweise. In einen standardisierten Ansatz für ein Fluorochrom-One Marker Anti-CD3-CD4,-CD8, -CD14,-CD19 - CD56 und -TCR γδ-Antikörper mit sieben verschiedenen Fluorochromes erkannt werden. Unser Ansatz kombiniert Anti-CD3 - CD56 und -TCR γδ Antikörper in einem Fluorochrom (für Bequemlichkeit Fluorochrom A beschriftet) und Anti-CD4-CD8, -CD14 und - CD19-Antikörper in einer unterschiedlichen Fluorochrom (Fluorochrom B). Dies ist möglich durch eine Kombination von Antikörper-Titration und differenzielle Antigen Ausdruck. Beide CD4⁺ und CD8⁺ T Zellen sind für den Anti-CD3-Antikörper in Fluorochrom A positiv, aber sie trennten sich im Fluorochrom B den Ausdruck des CD8-Signals während des Einsetzens mit einer ad-hoc-Titration, die CD4-Signal zwischen der CD8 zu maximieren und die CD3 positiven-CD4/CD8 doppelt Negative Zellen. Γδ T-Zellen drückt höheres Maß an CD3 CD4 und CD8, und daher als CD3 hoch⁴ausgewiesen werden können. Dieses Signal wird weiter verstärkt durch Kennzeichnung γδ T-Zellen in Fluorochrom A mit einer Anti-TCR γδ-Antikörpern, die Trennung zwischen niedrigen T-Zellen CD3 und CD3 hohe γδ T Zellen so zu verbessern. B-Zellen erkennen Sie als CD3^– in Fluorochrom A und CD19⁺ in Fluorochrom B. Um negative NK-Zellen CD3 von B-Zellen zu trennen, wurde ein Anti-CD56-Antikörper in Fluorochrom A als Anti-CD3 verwendet. Dies ist möglich, weil CD56 auf NK-Zellen auf einem viel niedrigeren Niveau als CD3 auf T-Zellen-⁵zum Ausdruck gebracht. Zu guter Letzt sind Monozyten über eine Kombination von vorwärts-Side Scatter Eigenschaften und Expression von CD14 in Fluorochrom B. erkennbar

Die Idee der Kombination von bis zu vier Marker mit zwei Fluorochromes hat bereits erfolgreich vor^6,7,8versucht worden und wurde in ein klinisches Protokoll verwendet, um bösartige lymphatische Populationen^{9 identifizieren} . Ein früheren Bericht auch kombiniert sieben Markierungen (mit unterschiedlicher Spezifität von den Markern als wir in unser Protokoll verwendet) mit zwei Fluorochromes, aber dieser Ansatz auf eine komplexe Kennzeichnung jedes Antikörpers mit unterschiedliche Höhe der Fluorochrom¹⁰verlassen. Dies steht im Gegensatz zu unserer Methode, die im Handel erhältlichen Antikörper verwendet und kann angepasst werden, um die Gerätekonfiguration und profitieren von der neuen Generation von Polymer-Fluorochromes.

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, die optischen Grenzen der meisten fließen Cytometers für die Aufzeichnung von fünf zusätzliche Markierungen ermöglichen komplexe Zellpopulationen zu verhören zu erweitern. Infolgedessen erweiterte immunologische Analysen auf erschwingliche 6-10 Fluorochrom fließen Cytometers durchgeführt werden kann, und 2-3 Fluorochrom Feldgeräte können bemerkenswerte Ergebnisse in Regionen mit begrenzten Ressourcen erreichen. High-End-Geräte können auch von diesem Ansatz profitieren, durch zusätzliche Fluorochromes tiefer Flow-Zytometrie-Analyse durchzuführen und um modulare Fluss durchflusszytometrischen Panels auf mehreren Linien an der gleichen Zeit¹¹zu erstellen. Dies kann potenziell reduzieren die Anzahl der Platten in modularen Immunphänotypisierung Durchflusszytometrie verwendet und Umgang mit Zeit, Kosten und Fehler. Dieser Ansatz eignet sich auch sehr gut bei klinischen Proben mit begrenzten Anzahl von Zellen.

Protokoll

Alle Studien der menschlichen Materialien wurden von der Johns Hopkins Institutional Review Board unter der Health Insurance Portability and Accountability Act genehmigt. Patienten und Kontrolle Proben wurden anonymisierte. PBMCs und Blut von gesunden Kontrollpersonen wurden durch Einwilligung erhalten.

Hinweis: Dieses Protokoll wurde getestet auf frisch oder gefroren isoliert peripheren Blutzellen und Vollblut.

1. Zelle-Vorbereitung

1. Isolierung der peripheren Blutzellen (PBMC) aus Vollblut
   1. Zeichnen Sie Blut in ein 10 mL-grün-Top-Röhrchen mit Natrium Heparin. Nachdem das Röhrchen mit Blut gefüllt worden ist, sofort umkehren des Schlauchs mehrmals Gerinnung zu verhindern.
      Hinweis: Röhrchen mit anderen Gerinnungshemmer wie Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) oder Natriumcitrat können mit vergleichbaren Ergebnissen verwendet werden. Wenn eine andere Menge an Blut gesammelt wird, sollten die folgenden Schritte in das Protokoll entsprechend skaliert.
   2. Übertragen Sie sorgfältig gezeichneten Blut in ein 50 mL konische Röhrchen. Verdünnen Sie das Blut mit einer gleichen Menge von Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) ohne Calcium und Magnesium.
   3. Fügen Sie 15 mL Dichte Gradienten Medium (z. B. Ficoll) auf Grund einer neuen 50 mL konische Röhre und sorgfältig überlagern das verdünnte Blut auf Dichte Gradienten Medium, jede Vermischung zu vermeiden zwischen Dichte Gradienten und verdünnte Blut.
      Hinweis: Dies ist ein wichtiger Schritt für eine korrekte Trennung der PBMCs von Erythrozyten.
   4. Zentrifugieren Sie bei 400 X g für 30 min bei Raumtemperatur (RT), mit keine Bremse, Unterbrechungen der Schnittstelle zu vermeiden.
   5. Nach Zentrifugation vorsichtig abzusaugen Sie die obere Schicht mit einer Pipette und verwerfen Sie es, Aufmerksamkeit auf die Zellen an der Schnittstelle zwischen dem Plasma und Dichte Gradienten Medium nicht zu entfernen, ist, wo PBMCs schichtet. Sammeln Sie so viele Zellen wie möglich von der Schnittstelle ohne die Erythrozyten Pellet am unteren Rand der 50 mL konische Rohr und Übertragung auf eine neue 50 mL konische Rohr zu berühren.
   6. Fügen Sie PBS zu bringen das Endvolumen bis 25 mL und invertieren mehrmals zu mischen. Zentrifugieren Sie bei 300 X g für 10 min bei RT mit der Bremse auf der Zellsuspension Dichte Gradienten mittlere Verunreinigungen entfernen.
   7. Aspirieren Sie sorgfältig überstand ohne störende Zelle Pellet. Fügen Sie PBS zu bringen das Endvolumen bis 25 mL und invertieren mehrmals zu mischen. Zentrifugieren Sie bei 200 X g für 10 min bei RT mit der Bremse an Thrombozyten entfernen.
   8. Aspirieren Sie sorgfältig des Überstands ohne zu stören die Zelle Pellet. Aufschwemmen PBMCs in 1 mL PBS/0.1% Natriumazid. Natriumazid reduziert Deckelung, vergießen, Internalisierung der Antikörper und Erhöhung der Zelle Erholung, sondern seine Giftigkeit Zellviabilität beeinträchtigen kann. Aus diesem Grund sollte Natriumazid in allen Schritten vermieden werden, wenn die Zellen für spätere Experimente kultiviert werden. Zelle isoliert und ohne Natriumazid Färbung gab ähnliche Ergebnisse zu Verfärbungen im Beisein von Natriumazid durchgeführt.
      Vorsicht: Natriumazid kann zum Tod durch eine Beeinträchtigung des zentralen Nervensystems führen. Kontakt kann zu Verbrennungen an Haut und Augen führen.
   9. Verdünnen Sie die Zellen für die Zählung durch die Übertragung von 30 µL PBMCs in einem Microcentrifuge Schlauch 1,5 mL. Dann fügen Sie 120 µL PBS und 150 µL Trypan blau, Handynummer und Lebensfähigkeit zu bestimmen (01:10 Handy-Verdünnung). Aufschwemmen Sie sorgfältig.
   10. Übertragen Sie 10 µL auf ein Hemocytometer, Anzahl der Zellen entsprechend der verwendeten zählen Kammer und bestimmen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen. Entwicklungsfähigen Zellen = Anzahl der Trypan blau negative Zellen X 10 (den Verdünnungsfaktor in diesem Protokoll verwendeten insgesamt) X 10⁴.
       Hinweis: Durchschnittlich 7-15 x 10⁶ PBMCs von 10 mL Blut gesammelt werden sollten.
   11. Aufschwemmen der Zellen bei 10 x 10⁶ pro mL PBS/0.1% Natriumazid
       Hinweis: PBMC werden eingefroren und in flüssigem Stickstoff für längere Zeit gespeichert. Ausdruck von Markern wie Chemokin-Rezeptoren kann jedoch durch dieses Verfahren verändert werden.
2. Vorbereitung der Zellen von gefrorenen PBMC
   Hinweis: verschiedene einfrierende Verfahren beeinflussen Zelle Erholung und Lebensfähigkeit¹². PBMCs für diese Experimente wurden eingefroren Spezialformel Einfrieren, Medien oder fötalen Rinderserum (FBS)/10% Dimethyl Sulfoxid (DMSO) mit ähnlichen Ergebnissen.
   Vorsicht: DMSO kann leicht gefährlich einatmen (Lunge reizend), Hautkontakt (reizend, Permeator), von der Einnahme (reizend), Blickkontakt.
   1. Entfernen Sie gefrorene PBMC von flüssigem Stickstoff zu und auf Eis. Übertragen Sie die Cryoröhrchen aus dem Eis direkt in das 37 ° C-Wasserbad. Halten Sie die Cryoröhrchen an Wasseroberfläche und schütteln Sie die Fläschchen, bis eine kleine Eis-Pellets bleiben. Übertragen Sie die Cryoröhrchen wieder auf Eis.
   2. Wasser mit einem 70 % Ethanol besprüht abwischen entfernt werden. 1 mL PBS/0.1% Natriumazid bei 4 ° C langsam hinzugeben und sorgfältig die Zelle auf eine 15 mL konische Rohr übertragen. Fügen Sie langsam kalt PBS/0.1% Natriumazid bei 4 ° C zu einem Endvolumen von 15 mL zu erreichen.
   3. Zentrifuge bei 300 X g für 10 min. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, Aufschwemmen der Zellen in 1 mL PBS/0.1% Natriumazid.
      Hinweis: Die Zellen können auch in RPMI Nukleinsäuretablette 10 % FBS mit ähnlichen Ergebnissen.
   4. Verdünnen Sie die Zelle für die Zählung durch die Übertragung von 30 µL PBMCs in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Dann fügen Sie 120 µL PBS und 150 µL Trypan blau, Handynummer und Lebensfähigkeit zu bestimmen (01:10 Handy-Verdünnung). Aufschwemmen Sie sorgfältig.
   5. Übertragen Sie 10 µL auf ein Hemocytometer, Anzahl der Zellen entsprechend der verwendeten zählen Kammer und bestimmen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen. Entwicklungsfähigen Zellen = Anzahl der Trypan blau negative Zellen X 10 (den Verdünnungsfaktor in diesem Protokoll verwendeten insgesamt) X 10⁴.
   6. Die Zellen bei 10 x 10⁶ pro mL in PBS/0.1% Natriumazid aufzuwirbeln.
3. Vorbereitung der Zellen aus dem Vollblut
   1. Zeichnen Sie Blut in ein 10 mL-grün-Top-Röhrchen mit Natrium Heparin. Nachdem das Röhrchen mit Blut gefüllt worden ist, sofort umkehren des Schlauchs mehrmals Gerinnung zu verhindern.
      Hinweis: Röhrchen mit anderen Antikoagulans, wie z. B. EDTA oder Natriumcitrat mit vergleichbaren Ergebnissen verwendet werden kann. Wenn eine andere Menge an Blut gesammelt wird, sollten die folgenden Schritte in das Protokoll entsprechend skaliert.
   2. 200 µL Vollblut zu einem Schlauch 12 x 75 mm begrenzt zu übertragen, fügen Sie 2 µL Natriumazid und Wirbel sanft für 2 s.

(2) Zelle färben

Hinweis: Paare von Fluorochromes mit praktisch keine spektrale Überlappung Wahl ist wichtig zur Verbreitung von Daten aufgrund der hohen Spillover Fluorochrom im Fluorochrom-Detektor zu verringern. Um einer optimale Identifikation der al die Zelle Teilmengen zu erreichen, sollte die Fluorochromes mit eine hohe Quantenausbeute wie Antikörper Paare PE-BV421 und PE-APC verwendet werden.

1. Färbung von frischen und gefrorenen PBMC
   1. Übertragen Sie 100 µL der PBMC (1 x 10⁶ Zellen) auf eine 96-Well-V-Boden-Platte.
      Hinweis: Beliebige Anzahl von Feldern niedriger als 1 x 10⁶ kann mit ähnlichen Ergebnissen²verwendet werden.
   2. Zentrifugieren bei 350 X g für 3 min bei RT und sorgfältig Aspirieren des Überstands ohne zu stören die Zelle Pellet. Hinzu kommt jeweils gut 100 µL PBS mit einer lebenden/Toten fixierbar Färbung, die mit freien Amin auf Proteine für 10 min reagiert, abgestorbene Zellen zu kennzeichnen.
   3. Bereiten Sie für jede Probe 30 µL einer Mischung enthält alle Antikörper (Anti-CD3.-CD56, TCRγδ in Fluorchrome-A und Anti-CD4, CD8, CD19, CD14 in Fluorchrome B). Konzentration der Antikörper sind in Tabelle 1 und Tabelle2angegeben. In diesem Stadium betitelten Antikörper gegen verschiedene Zielmoleküle und in verschiedenen Fluorochromes können auch hinzugefügt werden (z.B. Tabelle 3).
      Hinweis: Antikörper-Konzentration variiert je nach Hersteller und Chargennummer. Daher sollte Vorversuche durchgeführt werden, um das optimale Signal zu erreichen. PBS, PBS/0.5% BSA, PBS/0.2% Natriumazid oder PBS/0.5% BSA/0.1% Natriumazid mit ähnlichen Ergebnissen dienten Antikörper²verdünnen. Zelle kann auch gebeizt werden in Mengen von 30 µL, integrieren Sie diese Methodik auf bereits vorhandene Protokolle Färbung.
   4. Zentrifugieren bei 350 X g für 3 min bei RT und sorgfältig Aspirieren des Überstands ohne zu stören die Zelle Pellet. Fügen Sie des Antikörper-Cocktails in jede Vertiefung und Aufschwemmen Sie sorgfältig ohne Luftblasen zu generieren. 30 min bei RT im Dunkeln inkubieren.
      Hinweis: Es ist möglich, die Proben bei 4 ° C mit ähnlichen Ergebnissen zu beflecken.
   5. 150 µL Färbung Puffer und Zentrifuge bei 350 X g für 3 min bei RT hinzufügen und vorsichtig Aspirieren des Überstands ohne zu stören die Zelle Pellet. Die Zellen in 200 µL PBS Aufschwemmen und Daten auf einem Durchflusszytometer erwerben. Wenn Färbung Bände geändert werden, stellen Sie sicher mindestens eine 20-fold Verdünnung des ursprünglichen Antikörper-Mix verwendet, um den Überschuss an Antikörper zu waschen.
      Hinweis: Gefärbte Zellen können mit in PBS/2% Paraformaldehyd fixiert, über Nacht im Kühlschrank bei 4 ° C aufbewahrt und dann auf einem Durchflusszytometer am folgenden Tag erworben werden.
      Vorsicht: Paraformaldehyd ist schädlich, wenn geschluckt und können Hautreizungen verursachen
2. Färbung von Vollblut
   1. Jedes Rohr 12 mm x 75 mm begrenzt, hinzufügen den Cocktail von Antikörpern (Anti-CD3.-CD56, TCRγδ Fluorochrom-A und Anti-CD4, CD8, CD19, CD14 in Fluorochrom (B) und 30 min bei RT im Dunkeln bei RT inkubieren. Konzentration der Antikörper sind in Tabelle 4angegeben. In dieser Phase Antikörper gegen verschiedene Zielmoleküle titriert und in verschiedenen Fluorochromes kann auch hinzugefügt werden. Antikörperkonzentration kann variieren je nach Hersteller und Chargennummer. Daher sollte Vorversuche durchgeführt werden, um das optimale Signal zu erreichen.
      Hinweis: Es ist möglich, Proben bei 4 ° C mit ähnlichen Ergebnissen zu beflecken.
   2. Zentrifugieren bei 350 X g für 3 min bei RT und sorgfältig Aspirieren des Überstands ohne zu stören die Zelle Pellet. Machen Sie eine 1 X Lösung des Puffers Erythrozyten Lyse nach Anweisungen des Herstellers.
      Hinweis: Die Lyse-Lösung sollte vor der Verwendung bei RT.
   3. Jedes Rohr fügen Sie 2,0 mL 1 x rote Blutzelle Lysis Puffer hinzu, verschließen Sie gut und invertieren Sie mehrmals zu mischen. Mit Folie abdecken und 15 min. ruhen lassen.
   4. Spin-down bei 300 X g für 5 min. vorsichtig Aspirieren den Überstand ohne zu stören die Zelle Pellet.
   5. 2 mL PBS und Zentrifuge bei 300 X g für 5 min zugeben.
      Hinweis: an dieser Stelle sollte die Zelle Pellet eine blasse weiße Färbung zeigt eine erfolgreiche Erythrozyten Lyse haben. Aspirieren Sie sorgfältig den Überstand um die Zelle Pellet nicht stören und sanft Aufschwemmen der Zellen in 200 µL PBS.
   6. Belastung der Zellen durch 12 x 75 mm Rohre mit 40 µm Filter Kappen entfernen Zelle Aggregate und Erfassung von Daten auf einem Durchflusszytometer.

(3) Antikörper-Titration

Hinweis: Antikörper-Titration ist der wichtigste Schritt für qualitativ hochwertige und reproduzierbare Daten zu erhalten. Titration von Anti-CD3-CD8,-CD14 - CD19 und TCR - γδ folgt das Standardverfahren, die Konzentration der Antikörper, positive und negative Spitzen optimal zu trennen wird abgeleitet, indem bis zu beflecken Index^13,14. Verdünnungen am Gipfel oder näher an der Spitze auf der steigenden Seite der Fleck Index Kurve sollte ausgewählt (Abbildung 1A-C). Der Anti-CD4 Antikörper ist um den Gipfel der positiven Bevölkerung zwischen CD3 einzigen positiven Populationen und CD3 CD4 platzieren titriert + / CD8 + T-Zellen, näher auf das CD3 einzigen positiven Signal, besser die CD8dim Bevölkerung (CD8 + γδ T-Zellen und NK-T-Zellen) unterscheiden. Auf der gleichen Linie Zellen CD56 Titration soll Position NK CD56⁺ zwischen der CD3⁺ und die CD3^– Bevölkerung.

1. Maximale Fleck Index Kurve
   Hinweis: Titration von Anti-CD3-CD8,-CD14 - CD19 und TCR - γδ folgt das Standardverfahren, die Konzentration der Antikörper, positive und negative Spitzen optimal zu trennen wird abgeleitet, indem bis zu beflecken Index Kurve¹⁵. Wenn Antikörper gegen andere Marker zum Panel hinzugefügt werden, müssen sie auch mit einer maximalen Färbung Index Kurve titriert werden.
   1. Bereiten Sie eine 2-fold Antikörper-Verdünnung durch 10 Bohrungen einer 96-Well-Platte mit 40 µL der Färbung Puffer zu füllen. In den ersten Brunnen erhöhen das Endvolumen zu 80 µL Färbung Puffer und fügen des Antikörpers von Interesse in einer Konzentration 4 Mal die Konzentration vom Hersteller empfohlen.
   2. Gut mischen und gut 40 µL auf die zweite übertragen. Mischen Sie gut und wiederholen Sie diesen Schritt für die alle anderen Brunnen.
   3. Fleck 10 Proben von PBMC oder Vollblut mit 30 µL 10 verschiedenen 2-fold Verdünnungen von Antikörpern nach dem Protokoll beschrieben vor.
   4. Erfassung von Daten mit einem Durchflusszytometer und zeichnen das Signal von jedem Verdünnung (Abbildung 1A).
   5. Tor auf die negativen und positiven Bevölkerung für jeden Antikörperkonzentration. Erhöhung der Konzentration von Antikörpern führen zu einem höheren Hintergrund. Daher verkleinern Sie die negativen Tor entsprechend.
   6. Extrahieren Sie für jede Antikörperkonzentration Informationen zum Median und Standardabweichung für die Fluoreszenz Intensität der negativen Bevölkerung und der Median für die Fluoreszenz Intensität der positiven Bevölkerung. Für jede Antikörperkonzentration Fleck Index mit dieser Formel berechnen: (Median Fluoreszenz Intensität der positiven Bevölkerung – mittlere Fluoreszenz Intensität der negativen Bevölkerung) ÷ (2 X Standardabweichung der Fluoreszenz Intensität der der negative Bevölkerung) (Abbildung 1 b).
   7. Plot der Fleck Index Vs. der Antikörperkonzentration ausgedrückt als Bruchteil der Antikörper Verdünnung (z. B. 01:10 Verdünnung = 0,1), und die Konzentration der Antikörper mit der maximalen Fleck-Index-Wert (Abbildung 1) zu identifizieren.
2. Anti-CD4 und -CD56-Antikörper-titration
   Hinweis: Anti-CD4 und -CD56-Antikörper-Titration beruht auf vorherige Titration der anderen Markern im Bedienfeld "zwei-Fluorochrom". Für den Anti-CD4 Antikörper die Titration zielt darauf ab, bei der Unterbringung der Anti-CD4-signal zwischen der doppelten CD8⁺/CD3⁺ Signal und der CD3 einzelne positive Bevölkerung (Abbildung 1).
   1. Titrieren Anti-CD4 und CD56-Antikörper mit einer 2-fold Verdünnung Strategie wie beschrieben vor, Hinzufügen von zusätzlichen Konzentrationen dazwischen um fein identifizieren Sie die Konzentration, die es ermöglichen, um CD4 zu trennen⁺ T-Zellen und NK-Zellen aus der anderen Zelle Populationen.
   2. Den Anti-CD4 Antikörper titrieren, indem man das Anti-CD4-Signal zwischen der doppelten CD8⁺/CD3⁺ Signal und der CD3 einzelne positive Bevölkerung (Abbildung 1).
      Hinweis: Besonderer Sorgfalt sollte getan werden, um klar CD4 trennen⁺ T von CD8-Zellen⁺ dim Populationen.
   3. Titrieren Sie den Anti-CD56-Antikörper nach einer Strategie, die ähnlich wie die Anti-CD4 Antikörper-Titration, indem man NK-Zellen zwischen den CD3-negativ und der CD3-positiven Bevölkerung.

4. gating Strategie

1. Lymphatischer und monozytären Zellpopulationen zu identifizieren und Entfernen von abgestorbenen Zellen und ein Großteil der verbleibenden Erythrozyten aus der Analyse.
   1. Wählen Sie die gesamte Bevölkerung mit Lymphozyten und Monozyten basierend auf vorwärts Vs Seitenbereich Scatter (FSC-A Vs SSC-A). Entfernen Sie Zelle Aggregate, von der Analyse über forward Scatter Höhe Vs forward Scatter Breite (FSC-H Vs FSC-W) und Side Scatter Höhe Vs Seite Streuung Breite (SSC-H Vs SSC-W).
   2. Verwenden Sie einen lebenden/Toten Diskriminierung-Stift, um helle positiv abgestorbene Zellen und verbleibende rote Blutkörperchen aus der Analyse ausgeschlossen. Tor auf Lymphozyten und Monozyten, die anhand der verschiedenen FSC-A und SSC-A-Profil.
2. Zwei-Fluorochrom sieben-Marker gating Strategie der lymphozytären Bevölkerungen.
   Hinweis: innerhalb der CD3 positiven Untergruppe, CD4⁺, CD8⁺ und γδ T-Zellen mit Antikörpern, die ausschließlich CD4, CD8 und der γδ-Rezeptor getrennt werden können. In vergleichbarer Weise, innerhalb der CD3 negativen Untergruppe können B-Zellen, NK-Zellen und Monozyten eindeutig identifiziert werden mit Antikörpern gegen CD19, CD56 und CD14, beziehungsweise.
   1. Wählen Sie die Lymphozyten-Tor und erstellen Sie einen Dot-Plot mit auf jeder Achse eine der zwei Fluorochromes, die in diesem Protokoll (Abb. 2 b) verwendet.
   2. Tor auf CD8⁺ T Zellen identifiziert als CD3⁺/CD8⁺ doppelt positiven Zellen in der oberen rechten Ecke des Dot-Plot (Abb. 2 b). Ausschließen der Dimmen CD8-Bevölkerung die NKT Zellen enthalten. Tor auf CD4⁺ T als Bevölkerung zwischen CD8 Zellen⁺ T Zellen und der CD3 einzelne positive Populationen. Tor auf γδ T-Zellen als hohe CD3 Zellen identifiziert. Unterteilen Sie γδ T-Zellen CD8 positiven und negativen CD8.
   3. Tor auf NK-Zellen als die Bevölkerung zwischen CD3-positiven identifiziert und CD3-negativen Zellen. Unterteilen Sie NK-Zellen CD8 positiven und negativen CD8. Tor auf B-Zellen als CD3-Negative CD19⁺ Bevölkerung auf der rechten unteren Ecke des Dot-Plot.
   4. Wählen Sie die Monocyte-Tore und erstellen Sie einen Dot-Plot mit auf jeder Achse eine der zwei Fluorochromes, die in diesem Protokoll (Abbildung 2) verwendet. Tor auf der CD3^–/CD14⁺ Bevölkerung.

Ergebnisse

Einrichtung und Analyse eines Flow Cytometry Experiments des menschlichen peripheren Blutzellen gebeizt mit sieben Linie Marker (Anti-CD3-CD4,-CD8, -CD14,-CD19 - CD56 und -TCR γδ-Antikörper) mit nur zwei Fluorochromes werden vorgestellt.

Repräsentative Ergebnisse sind für Anti-CD8 und -CD56-Antikörper-Titration beschrieben. Für jeden Antikörper (in diesem Beispiel Anti-CD8), Daten aus zehn aufeinander folgenden 2-fold Ve...

Diskussion

Die hier vorgestellten Protokoll hat sich gezeigt, ganz flexibel und unempfindlich gegen Änderungen in der Färbung, Puffer, Temperatur und peripheren Blutzellen Vorbereitung durch die hohe Expression der Linie Marker auf der Zelloberfläche. Der wichtigste Schritt für den Erhalt qualitativ hochwertige und reproduzierbare Daten ist Antikörper-Titration. Der Hinweis Da die Titration der Antikörper immer während der Installation von einem Fluss durchflusszytometrischen Panel durchgeführt werden sollte wird dieser Sch...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD3	BD Biosciences	562426	Antibody for staining RRID: AB_11152082
CD56	BD Biosciences	562751	Antibody for staining RRID: AB_2732054
TCRgd	BD Biosciences	331217	Antibody for staining RRID: AB_2562316
CD4	BD Biosciences	555347	Antibody for staining RRID: AB_395752
CD8	BD Biosciences	555367	Antibody for staining RRID: AB_395770
CD14	BD Biosciences	555398	Antibody for staining RRID: AB_395799
CD19	BD Biosciences	555413	Antibody for staining RRID: AB_395813
CD3	BD Biosciences	555335	Antibody for staining RRID: AB_398591
CD56	BD Biosciences	555518	Antibody for staining RRID: AB_398601
TCRgd	BD Biosciences	331211	Antibody for staining RRID: AB_1089215
CCR7	Biolegend	353217	Antibody for staining RRID: AB_10913812
CD45RA	BD Biosciences	560674	Antibody for staining RRID: AB_1727497
CCR4	BD Biosciences	561034	Antibody for staining RRID: AB_10563066
CCR6	BD Biosciences	353419	Antibody for staining RRID: AB_11124539
CXCR3	BD Biosciences	561730	Antibody for staining RRID: AB_10894207
CD57	BD Biosciences	562488	Antibody for staining RRID: AB_2737625
HLA-DR	BD Biosciences	563083	Antibody for staining RRID: AB_2737994
CD16	BD Biosciences	563784	Antibody for staining RRID: AB_2744293
Dead cells	Life technologies	L-23105	Live/dead discrimination
Falcon 5 mL round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap	BD Bioscience	352235	to filter cell suspension before passing though the flow cytometer
Falcon 5 mL round-bottom polystyrene test tube	BD Bioscience	352001	to stain whole blood
Recovery Cell Culture Freezing Medium	Thermo fisher	12648010	Freezing cells
96-well V-bottom plate	Thermo fisher	249570	plate for staining
FACSAria IIu Cell Sorter	BD Biosciences		Flow cytometer
FCS Express 6	De Novo Software		FACS analysis
Graphpad Prism	GraphPad software		Data analysis