Um modelo do rato para avaliar a resposta imune inata à infecção de Staphylococcus aureus

Resumo

Uma abordagem é descrita para a detecção em tempo real da resposta imune inata de ferimento cutâneo e Staphylococcus aureus infecção de ratos. Por LysM-EGFP comparando os ratos (que possuem fluorescentes neutrófilos) com um LysM-EGFP mestiços cepa de rato imunodeficientes, avançamos nossa compreensão da infecção e o desenvolvimento de abordagens para combater a infecção.

Resumo

Staphylococcus aureus Infecções (S. aureus), incluindo manchas resistentes à meticilina, são uma enorme sobrecarga para o sistema de saúde. Com taxas de incidência de infecção de S. aureus escalada anualmente, há uma demanda para a pesquisa adicional em sua patogenicidade. Modelos animais de doenças infecciosas avançam nossa compreensão da resposta do hospedeiro-patógeno e levam ao desenvolvimento de terapêuticas eficazes. Os neutrófilos desempenham um papel primordial na resposta imune inata que controla infecções de S. aureus , formando um abscesso para parede a infecção e facilitar a remoção de bactérias; o número de neutrófilos que se infiltrar em uma infecção de pele de S. aureus , muitas vezes se correlaciona com o resultado de doença. Camundongos LysM-EGFP, que possuem a maior proteína verde fluorescente (EGFP) inserida na região promotora de lisozima M (LysM) (expressada principalmente por neutrófilos), quando usado em conjunto com imagens de fluorescência todo animal in vivo (FLI) fornecem um meios de quantificar a emigração dos neutrófilos canaliza e longitudinalmente na pele ferida. Quando combinado com um bioluminescentes S. aureus estirpe e sequencial imagem bioluminescente todo animal in vivo (BLI), é possível monitorar longitudinalmente a dinâmica do recrutamento de neutrófilos e vivo em carga bacteriana no local da infecção em ratos anestesiados desde precoce da infecção, a resolução ou a morte. Os ratos são mais resistentes a uma série de fatores de virulência produzido por S. aureus que facilitam a colonização eficaz e infecção em seres humanos. Camundongos imunodeficientes fornecem um modelo animal mais sensível para examinar persistente S. aureus infecções e a capacidade da terapêutica para impulsionar inatas respostas imunes. Neste documento, podemos caracterizar respostas em camundongos LysM-EGFP que foram criados para camundongos deficientes em MyD88 (LysM-EGFP × MyD88^{- / -} ratos) juntamente com ratos de LysM-EGFP selvagem-tipo para investigar a infecção de ferida de pele de S. aureus . Multiespectral detecção simultânea habilitado o estudo da dinâmica de recrutamento dos neutrófilos usando FLI in vivo, carga bacteriana usando BLI in vivo e cicatrização longitudinalmente e de forma não invasiva ao longo do tempo.

Introdução

Staphylococcus aureus (S. aureus) é responsável para a maioria das infecções na pele e tecidos moles (SSTIs) no Estados Unidos¹. A incidência de methicillin-resistente S. aureus (MRSA) infecções aumentou constantemente durante as últimas duas décadas², motivando o estudo dos mecanismos de persistência e a descoberta de novas estratégias de tratamento. O padrão de atendimento para infecções por MRSA é antibioticoterapia sistêmica, mas MRSA tornou-se cada vez mais resistente aos antibióticos ao longo do tempo³ e estas drogas podem diminuir microbiome benéfico do hospedeiro, causando efeitos negativos para a saúde, especialmente em crianças⁴. Estudos pré-clínicos examinaram estratégias alternativas para tratamento de infecções de MRSA⁵, mas traduzir essas abordagens à clínica revelou-se um desafio devido ao surgimento de fatores de virulência que frustrar de respostas imunes do anfitrião⁶. Para dissecar a dinâmica hospedeiro-patógeno daquela unidade SSTIs de S. aureus , combinamos não invasiva e leituras longitudinais do número de neutrófilos recrutaram para o leito da ferida com medidas cinéticas de abundância bacteriana e ferida área.

Os neutrófilos são os leucócitos circulantes mais abundante nos seres humanos e as socorristas para uma infecção bacteriana⁷. Os neutrófilos são um componente necessário para uma resposta eficaz do hospedeiro contra S. aureus infecções devido a seus mecanismos bactericidas, incluindo a produção de espécies reativas de oxigênio, proteases, peptídeos antimicrobianos e respostas funcionais incluindo a fagocitose e a produção de neutrófilos extracelular armadilha^8,9. Pacientes humanos com defeitos genéticos na função dos neutrófilos, como a doença granulomatosa crônica e síndrome de Chediak-Higashi, mostram um aumento da susceptibilidade à infecção de S. aureus . Em adição, pacientes com genética (por exemplo, neutropenia congênita) e adquirida (como visto em pacientes de quimioterapia de neutropenia) defeitos em números de neutrófilos também são altamente suscetíveis a S. aureus infecção¹⁰. Dada a importância dos neutrófilos em compensação S. aureus infecções, aumentando a sua capacidade imune ou ajuste seus números dentro de uma lesão de S. aureus pode revelar uma estratégia eficaz na resolução de infecção.

Na última década, ratos transgénicos com repórteres de neutrófilos de fluorescência foram desenvolvidos para estudar seu tráfico de^11,12. Combinar os ratos repórter neutrófilos com técnicas de imagem todo animais permite análise spatiotemporal de neutrófilos em tecidos e órgãos. Quando combinado com bioluminescentes cepas de S. aureus, é possível controlar o acúmulo de neutrófilos em resposta a abundância de S. aureus e persistência no contexto da virulência bacteriana fatores que direta e indiretamente perturb neutrófilos números no tecido afetado^13,14,15,16.

Os ratos são menos suscetíveis a mecanismos de evasão de virulência e imune de S. aureus que os humanos. Como tal, ratos do selvagem-tipo não podem ser um modelo animal ideal para investigar a eficácia de um dado terapêutico para tratar a crônica de S. aureus infecção. Deficiência de MyD88 ratos (ou seja, MyD88^{- / -} ratos), uma cepa de rato imunocomprometidos que carece de receptor funcional interleucina-1 (IL-1R) e Toll-like receptor (TLR) sinalização, mostrar maior susceptibilidade à infecção de S. aureus em comparação com rato do selvagem-tipo¹⁷ e um comprometimento em tráfico de neutrófilos para um site de S. aureus infecção na pele¹⁸. Desenvolvimento de uma cepa de rato que possui um repórter neutrófilos fluorescente no MyD88^{- / -} ratos forneceu um modelo alternativo para investigar a eficácia de terapias para tratar a infecção de S. aureus em relação ao atual neutrófilos ratos de repórter.

Neste protocolo, podemos caracterizar a infecção de S. aureus nos imunocomprometidos LysM-EGFP × MyD88^{- / -} ratos e comparar a evolução temporal e resolução de infecção com os camundongos LysM-EGFP. LysM-EGFP × MyD88^{- / -} ratos desenvolvem uma infecção crônica que não resolve, e 75% sucumbem à infecção após 8 dias. Um defeito significativo no recrutamento de neutrófilos inicial ocorre mais de 72 h da fase inflamatória da infecção, e menos de 50% neutrófilos recrutam durante o último estágio da infecção. O aumento da susceptibilidade da LysM-EGFP × MyD88 ratos^{- / -} isso torna particular Coe um rigoroso modelo pré-clínicos para avaliar a eficácia de novas técnicas terapêuticas visando a infecção de S. aureus em relação ao atual que modela Utilize o selvagem-tipo ratos, especialmente técnicas com o objetivo de aumentar a resposta imune inata contra infecção.

Protocolo

Todos os estudos de rato foram revisados e aprovados pelo Comitê de uso na UC Davis e institucional Cuidado Animal e foram realizados de acordo com as diretrizes do Animal Welfare Act e o ato de extensão de pesquisa de saúde. Não se esqueça de usar luvas estéreis, ao trabalhar com animais.

1. mouse fonte e habitação

1. Derivar de camundongos LysM-eGFP sobre um fundo genético C57BL/6J conforme descrito anteriormente,¹². Derive LysM-EGFP × MyD88^{- / -} os ratos por travessia camundongos LysM-EGFP com MyD88^{- / -} ratos em um fundo de C57BL/6J.
2. Ratos de casa em um viveiro. Para estes estudos, os animais estavam alojados na Universidade da Califórnia, Davis em grupos antes da cirurgia e cirurgia seguir alojada única. Use o rato entre as idades de 10-16 semanas.

2. quantificação e preparação bacteriana

1. Remover o bioluminescentes cepa S. aureus de interesse do armazenamento-80 ° C para descongelar no gelo. Raia em uma placa de ágar de sangue bovino de 5%. Incube a placa listras em uma incubadora umidificada a 37 ° C durante a noite (16 h).
   Nota: No presente protocolo, a estirpe ALC2906 SH1000 foi usada. Esta estirpe contém o vaivém do plasmídeo pSK236 com o promotor de proteína ligadora de penicilina 2 fundido ao estojo repórter luxABCDE de Photohabdus luminescens¹⁸.
2. Prepare o caldo tryptic soja (TSB) misturando 0,03 g de pó TSB por mL de água pura e autoclave TSB para esterilizar. Quando esfriar, adicione qualquer antibiótico necessário usando uma técnica estéril. Neste protocolo, adicione 10 µ g/mL de cloranfenicol¹⁸ para o TSB para selecionar para a expressão do plasmídeo de transporte para o pSK236, que contém a fita de luxABCDE de bioluminescência.
3. Escolha 3-4 colónias separadas da placa de S. aureus em TSB com 10 cloranfenicol µ g/mL para iniciar uma cultura durante a noite. Incube as bactérias em um agitador de incubação a 37 ° C durante a noite (16 h).
4. Inicie uma nova cultura bacteriana da cultura durante a noite, diluindo-se uma amostra 01:50 em TSB com 10 cloranfenicol µ g/mL. Cultura em um shaker incubação a 200 rpm e 37 ° C.
5. Duas horas depois de dividir o S. aureus, monitorar a densidade óptica em 600 nm (OD₆₀₀) em um espectrofotômetro. Observe o OD₆₀₀ vs tempo para encontrar o crescimento fase meados-logarítmica. Para a tensão de ALC2906 SH1000, uma OD₆₀₀ de 0.5 é meados-logarítmica e corresponde a uma concentração de 1 x 10⁸ UFC/mL (Figura 1).
6. Quando OD₆₀₀ é 0.5, lave as bactérias 1:1 com DPBS gelada. Centrifugar as bactérias durante 10 minutos a 3.000 x g e 4 ° C. Cuidadosamente, decante o sobrenadante e adicionar adicionais DPBS refrigerados e vórtice completamente. Centrífuga, mais uma vez, durante 10 minutos a 3.000 x g e 4 ° C.
7. Cuidadosamente, decante o sobrenadante. Resuspenda o pellet bacteriano em uma concentração desejada. Para estes estudos, coletar 3 mL de ALC2906 SH1000 e ressuspender em 1,5 mL de PBS, correlacionando a uma concentração de bactérias de cerca de 2 x 10⁸ UFC/mL. Mantenha as bactérias no gelo até o uso.
8. Para verificar a concentração de bactérias, dilua 100 µ l da amostra bacteriana 1:10,000 e 1: 100.000 em PBS. Placa 20 alíquotas µ l sobre uma placa de ágar. Incubar a 37 ° C numa incubadora umidificado para 16 h. Conde CFUs por exame bruto e calcular uma concentração bacteriana no dia seguinte.

3. excisional Wounding pele e inoculação com S. aureus

1. Administre 100 µ l de cloridrato de buprenorfina 0,03 mg/mL (~0.2 mg/kg) para cada rato via intraperitoneal da injeção.
2. Pós-injeção de vinte minutos, lugar 2-4 ratos em uma câmara com o oxigênio de 2-3 LPM com 2-4% de isoflurano. Uma vez que os ratos são totalmente anestesiados, transferi os ratos de uma vez para um cone de nariz ligado ao oxigênio de 2-3 LPM com 2-4% de isoflurano. Verifique se os ratos são totalmente anestesiados beliscando firmemente cada pata traseira entre um polegar e o indicador. Prossiga para a próxima etapa, se o animal não responder para o aperto.
3. Raspar uma 1 polegada por secção de 2 polegadas na parte traseira do mouse com tosquiadeiras elétricas e limpar a área de recortes de pele usando uma limpeza limpa ou gaze. Evite usar creme depilatório, pois pode causar inflamação em excesso.
4. Limpo, o parte de trás do mouse primeiro com gaze embebido iodo-povidona 10% e, em seguida, com um etanol a 70% embebido gaze. Limpe a área em um padrão espiral, movendo-se para fora do centro da área cirúrgica. Espere aproximadamente 1 min. para a área cirúrgica secar antes da cirurgia.
5. Segure o raspado atrás o mouse levemente entre os dedos e pressione firmemente uma biópsia do perfurador estéril de 6 mm no centro da área cirúrgico preparado. Não puxe a pele esticada.
   1. Torça a biópsia do perfurador para criar um contorno circular na pele que corta totalmente através da pele pelo menos uma seção da estrutura de tópicos. Tenha cuidado para não cortar o fáscia ou tecido subjacente.
   2. Use uma tesoura esterilizada e pinça para cortar através da epiderme e derme seguindo o padrão circular imprimido pela biópsia do perfurador.

4. S. aureus inoculação

1. Encha uma seringa de insulina de 28 G com o inóculo bacteriano bioluminescente desejado. Neste estudo, administrar uma concentração de 1 x 10⁸ UFC/mL (50 µ l). Não administre mais de 100 µ l de volume.
2. Injete 50 µ l de inóculo entre a fáscia e tecido no centro da ferida na parte de trás do mouse. Certifique-se de que o inóculo forma uma bolha no centro da ferida com vazamento mínimo ou dispersão.
   1. Puxe a derme para o lado, segurar a seringa quase paralela ao tecido e empurre lentamente a seringa no tecido até sentir uma súbita diminuição na resistência, que indica a perfuração da fáscia. Cuidadosamente, levar a seringa para o centro da ferida e dispense o inóculo lentamente. Remova a seringa lentamente do animal.
3. Injete o mesmo volume de PBS estéril as feridas dos animais não infectados como descrito acima.
4. Retorno do animal para sua gaiola. Coloque a gaiola sob uma lâmpada de calor ou em cima de uma almofada de aquecimento e monitorar o animal até a recuperação da anestesia.

5. em BLI Vivo e FLI

1. Inicialize o tonalizador todo animal através do software do instrumento. ANESTHETIZE ratos numa câmara recebendo oxigênio 2-3 LPM com 2-4% de isoflurano. Entrega a anestesia para os nosecones dentro do sistema de imagem.
2. Posicione o mouse infectado e ferido para a câmera. Posicione o mouse tal que a ferida é tão plana quanto possível. Use a seguinte configuração de sequência para os ratos de imagem.
   1. Selecione a luminescência e fotografar como o modo de imagem. O tempo de exposição é de 1 min no pequeno binning e F/stop 1 (luminescência) e 8 (fotografia) de F/stop. O filtro de emissão está aberto. Clique no botão adquirir para gravar a imagem.
   2. Selecione a fluorescência e fotografar como o modo de imagem. O tempo de exposição é 1 s em pequenas binning e 1 de F/stop (fluorescência) e 8 (fotografia) de F/stop com um comprimento de onda de excitação de 465/30 nm e uma nm de comprimento de onda de 520/20 de emissão com uma intensidade de luz alta. Clique no botão adquirir para gravar a imagem.
3. Retorno do animal para sua gaiola e monitor até à recuperação da anestesia.
4. Imagem ratos diariamente conforme descrito acima.

6. análise de imagens

1. Abrir imagens para ser quantificada.
2. Coloque uma grande região circular de interesse (ROI) sobre a área ferida toda incluindo circundantes da pele para cada rato na imagem. Os neutrófilos em vivo que FLI EGFP sinais e vivo em sinais BLI S. aureus estende além da borda da ferida, depois de vários dias e foram incluído nestes estudos (Figura 2A e 2B). Clique em Medida ROI e valores de registo para fluxo médio para cada rato. Traça o fluxo médio de cada sinal (p/s) versus tempo.
3. Se o número absoluto de neutrófilos ou S. aureus na ferida é desejado, realize os experimentos seguintes.
   1. Para correlacionar números dos neutrófilos para os sinais de FLI EGFP in vivo, ferida de camundongos C57BL/6J como descrito acima e transferir uma gama de derivados da medula óssea de neutrófilos (5 x 10⁵ 1 x 10⁷) de LysM-EGFP ou LysM-EGFPxMyD88^{- / -} doadores diretamente em cima de ferimentos diferentes. Imagem conforme descrito acima e correlacionar a vivo em FLI EGFP sinaliza para a quantidade de neutrófilos.
   2. Para correlacionar S. aureus CFU aos sinais BLI in vivo, ferida e infectar ratos como descrito acima. No dia 1 pós-infecção registro vivo em BLI sinais de ratos e imediatamente eutanásia e frio carcaças. Impostos especiais de consumo a ferida, homogeneizar o tecido e placa bacterianas diluições em ágar para incubação durante a noite. No dia seguinte, contagem das colónias para determinar CFU por ferida.
4. Para medir a ferida cura ajuste um ROI circular sobre a borda da ferida e a medida da área da ferida (cm²) e plotar a mudança fracionária da linha de base vs. tempo (Figura 2).

7. estatísticas

Nota: Todos os dados são apresentados como média ±SEM. p < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

1. Determinar as diferenças entre os dois grupos em um único dia, usando o método Holm-Sidak, com alfa = 0,05 e analisar cada ponto de tempo individualmente, sem assumir uma consistente SD
2. Compare as diferenças entre os vários grupos no mesmo dia por One-Way ANOVA com o Tukey múltiplas comparações depois do teste. Sobrevivência entre grupos experimentais foi analisada pelo método de Mantel-Cox.

Resultados

LysM-EGFP × MyD88^{- / -} os ratos são mais suscetíveis à infecção de S. aureus que camundongos LysM-EGFP

A cepa de S. aureus utilizado neste estudo, ALC2906¹⁸, foi construído com um plasmídeo que contém a construção de lux que produz sinais bioluminescentes de bactérias vivas e ativamente metabolisante. Quando inoculado em camundongos, bioluminescênci...

Discussão

Modelos de infecção de S. aureus que utilizam bioluminescentes S. aureus infecção em um rato de repórter neutrófilos fluorescente em conjunto com técnicas avançadas de imagem óptica em vivo todo animal tem nossa conhecimento avançado da inata resposta imune à infecção. Usando o mouse LysM-EGFP de estudos anteriores mostraram que acima de 1 x 10⁷ neutrófilos recruta para uma ferida infectada de S. aureus durante as primeiras 24 horas de infecção¹⁴

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube	Falcon	352059
6 mm Disposable Biopsy Punch	Integra Miltex	33-36
Bioluminescent S. aureus	Lloyd Miller, Johns Hopkins	ALC 2906 SH1000
Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics	VWR	10118-938
Buprenoprhine hydrochloride injectable	Western Medical Supply	7292	0.3 mg/mL
C57BL/6J Mice	Jackson Labratory	000664
Chloramphenicol (crystalline powder)	Fisher BioReagents	BP904-100
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Insulin Syringes	Becton, Dickson and Company	329461	0.35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2'')
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	Perkin Elmer	124262
Living Image Software – IVIS Spectrum Series	Perkin Elmer	128113
LysM-eGFP Mice	Thomas Graff Albert Einstein College of New York	NA
Microvolume Spectrophotometer	ThermoFisher Scientific	ND-2000
MyD88 KO Mice	Jackson Labratory	009088
Non-woven sponges	AMD- Ritmed Inc	A2101-CH	5 cm x 5 cm
Povidone Iodine 10% Solution	Aplicare	697731
Prism 7.0	GraphPad Software	License
Tryptic Soy Broth	Becton, Dickson and Company	211825