在 Vivo 钙成像中，在 C. elegans身体壁肌肉

摘要

这种方法提供了一种方法，将光遗传学和基因编码的钙传感器相结合，以成像基线细胞钙水平，以及模型生物体C.elegans身体壁肌肉中诱发的钙瞬变的变化。

摘要

模型有机体C. elegans提供了一个出色的系统，以执行体内钙成像。其透明的身体和遗传的可操作性允许基因编码钙传感器的靶向表达。该协议概述了使用这些传感器在靶细胞中钙动力学的体内成像，特别是蠕虫的身体壁肌肉。通过使用前突触通道性多普辛的共同表达，利用蓝光脉冲诱导兴奋运动神经元的乙酰胆碱释放，导致肌肉去极化和细胞质钙的可重复变化水平。讨论了两种蠕虫固定技术，难度不同。这些技术的比较表明，这两种方法都保留了神经肌肉结的生理，并允许钙瞬变的可重现定量。通过配对光遗传学和功能钙成像，可以在各种突变背景中评估午后钙处理和平衡的变化。提供的数据验证了固定技术，并具体考察了C.elegans sco（内科）质状性视网膜钙ATPase和钙激活的BK钾通道在体壁肌肉钙调节中的作用。

引言

本文介绍了利用光遗传学神经元刺激对C.elegans身体壁肌进行体内钙成像的方法。将肌肉表达的遗传编码钙指标（GECI）与蓝光触发神经元去极化，并提供一个系统来清楚地观察诱发的午贴钙瞬变。这避免了使用电刺激，允许对影响午睡钙动力学的突变体进行非侵入性分析。

单荧光基质GECI，如GCaMP，使用单个荧光蛋白分子融合到M13域的肌苷光链激酶在其N端和平静素（CaM）在C端。在钙结合后，对钙具有高亲和力的CaM域会经历一种构象变化，导致荧光蛋白随后的构象变化，导致荧光强度^增加1。GCaMP荧光在488nm时激发，因此不适合与通道性荧光结合使用，其激励波长相似，为473nm。因此，为了将钙测量与通道性多普司辛刺激结合使用，GCaMP的绿色荧光蛋白需要替换为红色荧光蛋白mRuby（RCaMP）。使用肌肉表达的RCaMP，结合胆碱能运动神经元表达的渠道多普辛，允许在蠕虫神经肌肉结（NMJ）的研究与同时使用光遗传学和功能成像在同一动物².

使用通道性多普辛绕过了电刺激的需要，以去极化C.elegans的神经肌肉结，这只能在解剖制剂中实现，从而使这种技术更容易使用和更精确瞄准特定组织时。例如，通道性多普辛以前曾用于C.elegans可逆地激活特定神经元，导致兴奋性神经元或抑制神经元的强健^{激活3，4。}使用光刺激的去极化也绕开神经元损伤的问题，由于直接电刺激。这提供了一个机会来检查许多不同的刺激方案的影响，包括持续和重复的刺激，对后午睡钙^{动力学4。}

C. elegans的透明特性使其成为荧光成像功能分析的理想选择。然而，当刺激NMJ的兴奋性乙酰胆碱神经元时，动物会立即对肌肉^收缩4做出反应，使蠕虫的固定性在可视化离散钙的变化时变得至关重要。传统上，药理剂被用来使动物瘫痪。其中一种使用的药物是左旋苯酚，一种胆碱能乙酰胆碱受体激动剂5，6，7。由于左旋基导致兴奋性肌肉受体亚型的持续激活，这种试剂不适合研究肌肉钙动力学。左旋面的作用诱导后脱极化，提升细胞钙，并在登步前刺激后进行闭塞观察。为了避免使用麻痹药物，我们研究了两种替代方法来固定C.elegans。动物要么被粘住，然后解剖打开，露出身体壁的肌肉，类似于现有的C.elegansNMJ电生理学^方法8，或纳米珠被用来固定完整的^动物9。这两个程序允许可重复的测量休息和唤起肌肉钙瞬变，很容易量化。

本文的方法可用于测量C.elegans中细胞后肝肌肉细胞的基线细胞钙水平和瞬变。给出了采用两种不同固定技术的数据实例。这两种技术都利用光遗传学来消除肌肉细胞的极化，而无需使用电刺激。这些例子证明了这种方法在评估影响蠕虫中贴菌后钙处理的突变的可行性，并指出两种固定方法的优缺点。

研究方案

1. 显微镜设置

1. 使用具有荧光功能的复合显微镜。在这项研究中，数据是在装有LED激发的直立显微镜（材料表）上收集的.
2. 为了正确可视化身体壁肌的荧光变化，使用高放大率目标。
   1. 对于解剖制剂，使用 60x NA 1.0 水浸物（材料表）。
   2. 对于使用纳米珠的制剂，使用 60x NA 1.4 油浸物（材料表）。这种放大倍率可确保足够的肌肉解析到相机传感器上。
3. 使用连接到显微镜的高灵敏度相机以高帧速率拍摄图像，以跟踪钙含量的快速变化。在这项研究中，具有sCMOS系统（材料表）的成像能力为100Hz，^因为Ca2+信号的上升时间可以高达几十毫秒。
4. 根据制造商的说明（材料表），使用 ImageJ¹⁰中运行的微型管理器软件控制摄像机采集和 LED 荧光激发。
5. 使用开源电子平台插件，连接外部开源微控制器板（材料表），管理外部正时脉冲，以控制荧光激发。
   注: 数字输出可从数字引脚 8 到 13 提供输出位 0 到 5。这些值可以作为基 2 值 1、10、100 等进行寻址。串行端口设置在表1中指示，可从微型管理器网站 （材料表） 获得。微控制器板的固件也可在本网站获得类似。
6. 要控制时序逻辑，请根据制造商的说明（材料表）激活软件中的微管理器采集协议。
   注:这将同时启动预设的摄像机帧持续时间和要激活的帧数，以及用于荧光激发的逻辑快门和预设琥珀色 LED。在这种情况下，琥珀色 LED 固态开关由微控制器位 1 输出通过引脚 9 控制。摄像机帧出 TTL（背板出 3 个连接器）触发刺激器。这正好是蓝光 LED 激活时间的时间，在激活成像序列后的设定时间激活通道性二氧化二红蛋白。
7. 要用蓝光刺激通道多普辛并记录 RCaMP 变化，请使用两个 LED。使用峰值发射波长为 470 nm 的 LED 和带通滤波器（455 至 490 nm）激活通道，使用峰值发射波长为 594 nm 的 LED 和带通滤波器（570 至 600 nm）激发 RCaMP。
8. 为了同时激活通道性二苯并捕获RCaMP荧光水平的变化，共同照亮两个LED，并使用二色光束组合器将光传输到同一光道。
9. 使用由 TTL 信号控制的固态开关（材料表）控制 LED 照明的时序（最大额定开机时间 1 毫秒，关机时间 0.3 ms:0 至 90% 开启和关闭时间 < 100 μs）。
10. 使用电流控制的低噪声线性电源（材料表）设置 LED 强度。
11. 为确保蓝光 LED 的精确定时，请通过 TTL 脉冲直接从刺激器将其激活到固态继电器。将蓝光刺激方案编程为刺激器（材料表），该刺激器从图像采集开始到蓝色LED照明，都起到精确的计时器作用。在本实验中，在仅捕获 RCaMP 荧光 2 秒后打开蓝光刺激，并使用 5，2 ms 的蓝光脉冲和 50 ms 的脉冲间隔激活通道性二甘素。
    注:蓝光脉冲前的延迟、蓝光脉冲的持续时间、脉冲之间的时间以及列车中的脉冲数都可以设置在这一点上，并且应该反映实验兴趣的特定参数。

2. C. Elegans样品制备和数据采集

1. 为了在光学上刺激前突触神经元，获得动物在兴奋性胆碱能神经元中表达通道性多普辛，由unc-17启动子区域驱动，RCaMP 在所有身体壁肌肉中表达，由myo-3启动子驱动区域².
   注:仅推荐使用具有集成转基因和强健荧光水平的动物，作为相应细胞类型的可变表达式可能会影响数据采集的可靠性。
2. 通过稀释乙醇中的视网膜粉末（材料表）来形成全透视网膜的工作库存，形成100 mM的最终浓度，并储存在-20°C。这项工作将稳定约一年。
3. 创建 OP50大肠杆菌的库存，生长在 LB 介质中，辅以步骤 2.2 中工作库存的全跨视网膜，最终浓度为 80 μM。用于 OP50_视网膜库存的体积取决于实验所需的板数。
4. 种子线虫生长介质 （NGM） 板，约 300 μL 的 OP50μ 视盘，允许板在黑暗中室温下干燥过夜。
5. 在20°C的OP50视网膜NGM板上，在黑暗中将C.elegans菌株生长到所需的年龄。对于这个实验，使用成人蠕虫。
   1. 对于使用解剖制剂的实验，只使用肉体成年蠕虫对更年轻、更小的动物进行解剖是极具挑战性的。将动物留在OP50视网膜板上至少3天，以进行有效的导引性腺蛋白激活。
6. 如果使用解剖^{制剂8，11（}图1A），在低光下进行解剖。
   1. 将动物放入带有硅胶涂层盖玻片底座的解剖盘中，该底板填充了 1 mM Ca²⁺细胞外溶液，由 150 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM CaCl_2、4mM MgCl_2、10mM 葡萄糖、5 mM 蔗糖和 15 mM HEPES （pH 7.3） 组成，-340 Osm）。
   2. 使用液体局部皮肤粘合剂沿蠕虫的背侧涂上蓝色，并使用玻璃针沿胶水/蠕虫界面进行横向角质切口。
   3. 使用口腔移液器清除蠕虫腔内内脏。
   4. 粘下动物的角质皮瓣，露出腹腔内体壁肌肉进行成像。
7. 如果使用纳米珠制剂 （图1B）
   1. 使用 ddH₂O 将熔融 5% 的甘蔗溶液制作成 100 mL 的最终体积。
   2. 使用巴斯德移液器，将一滴熔融的甘蔗糖溶液放在玻璃玻片上，并立即将第二个玻璃滑块放在顶部，垂直于第一个，使用温和的压力创建均匀的甘蔗垫。使用前请取出顶部幻灯片。
   3. 在甘蔗垫中间加入约4μL的聚苯乙烯纳米珠（材料表）。
   4. 在低光下，将4-6摄氏度的elegans挑入纳米珠溶液中，确保动物不会躺在彼此的上面，并小心地在顶部放置一个盖玻片。
8. 将准备好的幻灯片或解剖盘放在显微镜上，使用 10 倍放大倍率和暗淡的明亮场照明查找并聚焦蠕虫。
9. 切换到 60 倍放大倍率和 RCaMP 荧光激发，以识别在前和正确焦平面中的心室体壁肌肉。
   注:选择外阴前肌，因为它们反映了电生理学实验中通常刺激的肌肉。
10. 通过拉出切换并单击数据采集软件（材料表）中的Live，将图像路径从目镜更改为相机。
    注:确保此时关闭了蓝光刺激通路，以确保通道在捕获图像之前不会激活。
11. 使用显微镜精细聚焦，在数据采集软件中聚焦图像。
12. 一旦肌肉明显聚焦，通过取消单击"实时"按钮关闭实时图像。
13. 单击数据采集软件中的ROI按钮，围绕所聚焦的肌肉创建一个框。
14. 在刺激器上，打开先前在步骤 1.10 中编程的蓝色光刺激通路。
15. 单击"在成像软件中获取"以通过 CMOS 摄像机捕获图像。为此，将曝光时间设置为 10 秒，1，000 帧和 2 倍分箱。

3. 数据分析

1. 在成像软件（材料表）中打开数据文件，并使用多边形工具勾勒出感兴趣的肌肉。这就是投资回报率。
2. 转到图像|堆栈|绘制 Z 轴轮廓并将结果数据点导出到电子表格软件（材料表）。此函数绘制 ROI 选择平均值与时间点。
3. 将使用多边形工具创建的肌肉 ROI 移到动物外部，以便使用 3.2 中概述的步骤进行背景荧光测量。将结果数据导出到电子表格工作簿中。
4. 在电子表格工作簿中，从每个时间点的肌肉荧光值中减去背景荧光值。这提供了背景减去荧光信号。
5. 对前 2 个数据点的背景减去荧光进行平均值。这将给出基线荧光测量，F。
6. 使用基线荧光测量计算每个时间点的标准化荧光水平。为此，请使用公式 （+F/F）+1。*F 表示 （F（t）-F，其中 F（t） 是任何给定时间点的荧光测量，F 是基线值。+1 作为 y 轴偏移添加。
7. 对收集的每个肌肉图像重复步骤 3.2-3.6。使用单或多肌肉细胞每图像是由研究人员的酌处权。可以通过执行功率分析来确定实验的 n。
8. 使用步骤 3.2-3.6 中的已处理数据，根据制造商的说明（材料表）跟踪绘图软件中的荧光值。
9. 根据此曲线，使用绘图软件中提供的工具，根据制造商的说明，测量钙瞬态的动力学，如上升到峰值时间和半衰减时间。

结果

这项技术评估了被认为会影响钙处理或肌肉脱极化的突变体的变化。基线荧光水平和荧光瞬变被可视化，并评估肌肉内的细胞钙和钙动力学。重要的是，动物在全视网膜上生长至少三天，以确保视网膜的成功结合，从而随后激活通道性多普司林（图2A）。如果动物没有暴露于全视网膜，肌肉钙瞬时触发（图2B

讨论

GEC是C.elegans神经生物学的有力工具。以前的工作已经利用钙成像技术检查神经元和肌肉细胞的各种功能，包括感觉和行为反应，具有不同的刺激方法。一些研究已经使用化学刺激触发钙瞬变在感觉ASH^{神经元22，23}或诱导钙波在咽部^肌肉24。另一组利用机械刺激，而蠕虫则被关在微流体芯片中，以检查触摸受体神经元^?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
all-trans retinal	Sigma-Aldrich	R2500	Necessary for excitation of channel rhodopsin
Amber LED			RCaMP illumination
Arduino UNO	Mouser	782-A000066	Controls fluorescence illumination
Blue LED			channelrhodopsin illumination
BX51WI microscope	Olympus		Fixed state compound microscope
Current controlled low noise linear power supply	Ametek	Sorenson	Controls LED intensity
Igor Pro	Wavemetrics	Wavemetrics.com	Graphing software
ImageJ	NIH	imagej.nih.gov	Image processing software
LUMFLN 60x water NA 1.4	Olympus		Water immersion objective for dissected preparation
Master-8 Stimulator	A.M.P.I		Master timer for image acquisition and LED illumination
Micro-Manager		micro-manager.org	Controls camera acquisition and LED excitiation
Microsoft Excel	Microsoft		Spreadsheet software
pco.edge 4.2 CMOS camera	pco.	4.2	High-speed camera
PlanApo N 60x oil NA 1.4	Olympus		Oil immersion objective for nanobead preparation
Polybead microspheres	Polysciences, Inc.	00876-15	For worm immobilization
solid state switches	Sensata Technologies	Crydom CMX100D6	Controls timing of LED illumination
Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]	Richmond Lab	SY1627	Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele
Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]	Richmond Lab		Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele
Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]	Gottschalk Lab	ZX1659	Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line