Studiando lo Stress ossidativo causato dagli streptococchi di gruppo Mitis in Caenorhabditis elegans

Riepilogo

Il nematode Caenorhabditis elegans è un eccellente modello per sezionare interazioni ospite-patogeno. Un protocollo per infettare il worm con membri degli streptococchi gruppo mitis e determinare l'attivazione della risposta di sforzo ossidativo contro H₂O₂ prodotto da questo gruppo di organismi è descritto qui.

Abstract

Caenorhabditis elegans (c. elegans), un nematode dissipato, è emerso come un modello interessante per studiare le interazioni ospite-patogeno. Il protocollo presentato utilizza questo modello per determinare la patogenicità causata da streptococchi gruppo mitis attraverso la produzione di H₂O₂. Gli streptococchi di gruppo mitis sono una minaccia emergente che causano molte malattie umane quali batteriemia, endocardite e cellulite orbitale. Descritto qui è un protocollo per determinare la sopravvivenza di questi vermi in risposta a H₂O₂ prodotto da questo gruppo di agenti patogeni. Usando il skn-1 del gene che codifica per un fattore di trascrizione di risposta di stress ossidativo, esso è indicato che questo modello è importante per l'identificazione di geni ospitanti che sono essenziali contro l'infezione streptococcica. Inoltre è dimostrato che l'attivazione della risposta allo stress ossidativo può essere monitorato in presenza di questi patogeni utilizzando un ceppo di vite senza fine di reporter transgenici, in cui viene fuso SKN-1 proteina fluorescente verde (GFP). Queste analisi forniscono la possibilità di studiare la risposta allo stress ossidativo di H₂O₂ derivato da una fonte biologica rispetto a esogenicamente aggiunto fonti (ROS) di specie reattive dell'ossigeno.

Introduzione

Gli streptococchi del gruppo mitis sono commensals umano della cavità orofaringea¹. Tuttavia, questi organismi possono sfuggire questa nicchia e causano una serie di malattie invasive². Le infezioni causate da questi microrganismi sono batteriemia, endocardite e cellulite orbitale^2,3,4,5,6. Inoltre, essi stanno emergendo come causativi agenti di infezioni del torrente sanguigno in immunocompromessi, neutropenic e malati di cancro sottoposti a chemioterapia^5,7,8,9 .

I meccanismi di patogenesi di gruppo fondo mitis è oscuro, perché sono stati identificati alcuni fattori di virulenza. Il gruppo di mitis è noto per la produzione di H₂O₂, che ha dimostrato di giocare un ruolo importante nella comunità microbica orale¹⁰. Più recentemente, diversi studi hanno evidenziato un ruolo per H₂O₂ come una citotossina che induce la morte delle cellule epiteliali^11,12. Polmonite S., che appartiene a questo gruppo, ha dimostrato di produrre alti livelli di H₂O₂ che induce il danno del DNA e l'apoptosi in cellule alveolari¹³. Utilizzando un modello animale di polmonite acuta, gli stessi ricercatori hanno dimostrato che la produzione di H₂O₂ dai batteri conferisce un vantaggio di virulenza. Studi su meningite pneumococcal hanno inoltre dimostrato che patogeno-derivati H₂O₂ agisce in sinergia con pneumolysin per innescare un neurone delle cellule morte¹⁴. Queste osservazioni stabiliscono chiaramente che H₂O₂ prodotto da questo gruppo di batteri è importante per loro patogenicità.

È interessante notare che, esso ha anche dimostrato che gruppo del mitis mitis dello s. e s. oralis causare la morte della del nematode c. elegans attraverso la produzione di H₂O₂^15,16. Questo nematode dissipato è stato utilizzato come un modello semplice, geneticamente trattabile per studiare molti processi biologici. Più recentemente, il worm è emerso come un modello per lo studio di interazioni ospite-patogeno^17,18. Inoltre, diversi studi hanno evidenziato l'importanza dello studio dello stress ossidativo tramite questo organismo^19,20,21. Suo ciclo di vita breve, la capacità di atterramento geni di interesse di RNAi e l'uso della proteina fluorescente verde (GFP)-reporter fuso per monitorare l'espressione genica sono alcuni degli attributi che lo rendono un sistema modello attraente. Ancora più importante, le vie che regolano lo stress ossidativo e l'immunità innata nel verme sono altamente conservate con mammiferi^20,22.

In questo protocollo, è dimostrato come utilizzare c. elegans per delucidare la patogenicità causata da streptococco-derivati H₂O₂. Un'analisi di sopravvivenza modificate è mostrata, e membri del gruppo mitis sono in grado di uccidere i vermi rapidamente tramite la produzione di H₂O₂. Utilizzando i membri del gruppo di mitis, una costante fonte biologica di specie reattive dell'ossigeno (ROS) è prevista, al contrario di fonti chimiche che inducono lo sforzo ossidativo nei vermi. Inoltre, i batteri sono in grado di colonizzare rapidamente, i vermi che permette per H₂O₂ essere direttamente indirizzati alle cellule intestinali (rispetto ad altre fonti che devono attraversare diverse barriere). Il dosaggio è convalidato o 1) per determinare la sopravvivenza del ceppo mutante skn-1 o 2) battendo giù skn-1 mediante RNAi in worms rispetto la N2 selvaggio-tipo e vettoriale controllo trattato worms. SKN-1 è un fattore di trascrizione importante che regola la risposta allo stress ossidativo in c. elegans^23,24,25. Oltre alle analisi di sopravvivenza, un ceppo di vite senza fine che esprimono un reporter transgenico SKN-1B/C::GFP viene utilizzato per monitorare l'attivazione della stress ossidativo risposta tramite la produzione di H₂O₂ dal gruppo mitis.

Protocollo

1. preparazione dei tuoi piatti di Agar (Estratto di lievito Todd-Hewitt)

1. Per 1 L di media, aggiungere 30 g di polvere di Todd-Hewitt, 2 g di Estratto di lievito e 20 g di agar per un matraccio di Erlenmeyer 2L. Aggiungere il contenuto del matraccio 970 mL di acqua deionizzata e includere una barra per l'agitazione. Sterilizzare in autoclave i media ad una temperatura di 121 ° C e pressione di 15 libbre/pollice² per 30 min. Successivamente, impostare il media su una zolla di mescolare e raffreddare con agitazione delicata.
2. Versare i media dimensioni appropriate Petri sterili (piatti 100 x 15 mm per la crescita e il mantenimento dei batteri, piatti 35 x 10 mm per l'uccisione di saggi) sotto un flusso laminare. Lasciare che i supporti ad asciugare per 2 ore sotto la cappa laminare. Da allora in poi, le piastre possono essere memorizzate a 4 ° C per 1 mese.

2. preparazione del terreno di coltura del Nematode (NGM) e piastre (NGM RNAi) di alimentazione di RNAi

1. Utilizzando un ancoretta, sciogliere 2,5 g di peptone e 3 g di NaCl in 970 mL di acqua deionizzata in un matraccio di Erlenmeyer 2L. Aggiungere 20 g di agar ai media. Autoclave i media ad una temperatura di 121 ° C e pressione di 15 libbre/pollice² per 30 min. impostare il media su una zolla di mescolare e raffreddare con agitazione delicata.
2. Aggiungere le seguenti soluzioni per i media per la preparazione di piatti NGM: 25 mL di tampone di fosfato di potassio 1 M (pH = 6.0), 1 mL di 1 M MgSO₄, 1 mL di 1 M CaCl₂, 1 mL di colesterolo (5 mg/mL di etanolo al 95%) , 1 mL di nistatina (10% v/w in etanolo) e 1 mL di 25 mg/mL di streptomicina.
3. Aggiungere le seguenti soluzioni per i media per la preparazione di NGM RNAi alimentazione piastre: 25 mL di tampone di fosfato di potassio 1 M (pH = 6.0), 1 mL di 1 M MgSO₄, 1 mL di 1 M CaCl₂, 1 mL di colesterolo (5 mg/mL di etanolo al 95%) , 1 mL di nistatina (10% v/w in etanolo), 1 mL di carbenicilline 50 mg/mL e 1 mL di IM IPTG.
4. Versare i media in 60 x 15 mm Petri sterili sotto flusso laminare. Lasciare che i supporti ad asciugare per 2 ore sotto la cappa laminare. Successivamente, piastre possono essere memorizzati a 4 ° C per 1 mese.

3. manutenzione di c. elegans

1. Seme le piastre NGM spotting 50 µ l di pernottamento cresciuto OP50 Escherichia coli nel centro delle piastre. La cultura di e. coli è preparata in precedenza nei media di Luria-Bertani (LB) e conservata a 4 ° C per diversi mesi. Coprire le piastre e lasciarli asciugare per 24 ore sotto una cappa laminare e da allora in poi conservare le piastre in contenitore in polistirolo.
2. Sotto un microscopio per dissezione, pick up 10 a 12 adulti gravid usando un plettro di verme sterile e trasferire i vermi a un e. coli OP50 seminato piastra NGM. Incubare le piastre a 20 ° C durante la notte.
3. Il giorno successivo, rimuovere gli adulti usando un plettro di verme sterile e consentire gli embrioni di sviluppare per le larve L4 a 20 ° C (~2.5 giorni).

4. preparazione della popolazione in età sincrono di vermi

1. Lavare gravid adulti da due a quattro piastre NGM utilizzando M9W e raccoglierli in una provetta conica da 15 mL.
   1. Per preparare M9W: combinare 3 g di NaCl, 6 g di Na₂HPO₄e 3 g di KH₂PO₄ e sciogliere in un volume finale di 1 L di acqua deionizzata. Autoclave la soluzione e aggiungere 1 mL di 1 M MgSO₄.
2. Girare il tubo a 450 x g per 1 min, quindi decantare il supernatante, garantendo nel contempo che il pellet di verme rimane intatto.
3. Aggiungere 400 µ l di 8,25% ipoclorito di sodio (candeggina) e 100 µ l di 5 N NaOH per preparare la soluzione di lisi del verme. Aggiungere la soluzione di lisi al pellet di vite senza fine e mescolare il contenuto, spostando il tubo fino a 70% dei vermi adulti vengono lisate. Osservare periodicamente il contenuto del tubo sotto un microscopio per dissezione per garantire non c'è nessun overbleaching delle uova.
4. Diluire il mix di candeggina aggiungendo 10 mL di M9W al contenuto del tubo conico.
5. Girare il tubo a 450 x g per 1 min. decantare surnatante, quindi aggiungere 10 mL di M9W.
6. Ripetere il passaggio 4.5 altre due volte.
7. Risospendere il pellet di uovo risultante in 3-5 mL di M9W. Porre la provetta in un rotatore del tubo. Lasciare le provette ruotare ad una velocità di 18 giri/min a temperatura ambiente (TA) durante la notte.
8. Il giorno successivo, girare il tubo a 450 x g per 1 minuto agglomerare le larve L1. Rimuovere la maggior parte di M9W dall'aspirazione, lasciando dietro di sé ~ 250 µ l di liquido nel tubo. Risospendere le larve L1 e posto tre 5 µ l gocce della sospensione vite senza fine in una capsula di Petri coperchio, poi stima il numero di vermi per µ l utilizzando un microscopio per dissezione.

5. l'induzione di RNAi a Worms

1. Utilizzando una sterile del ciclo o prendere, striscia fuori i ceppi desiderati di RNAi contenenti Escherichia coli dalle scorte congelate (librerie Ahringer e Vidal) sulle piastre di agar 100 x 15 mm LB contenente 50 carbenicillina µ g/mL e 15 µ g/mL di tetraciclina. Incubare le piastre a 37 ° C per 24 h.
2. Pick e inoculare una colonia isolata dal ceppo RNAi desiderata in provette coniche da 15 mL sterile contenente 2 mL di LB completati con carbenicillina di 50 µ g/mL. Incubare le provette a 37 ° C per 16 h in un agitatore orbitale a 150 giri/min.
3. Il giorno successivo, sviluppa 150 µ l della coltura durante la notte coltivato sulle piastre d'alimentazione di RNAi NGM 65 x 15 mm utilizzando una spatola sterile. Incubare le piastre a 37 ° C per 24 h.
4. Le piastre raffreddare a RT dopo incubazione a 37 ° C. Aggiungere un volume adeguato di M9W contenenti larve L1 ~ 200 (ottenute dalla popolazione sincrono età dei passaggi di vermi) di e. coli seminato NGM RNAi piastre di alimentazione. Incubare le piastre a 20 ° C fino a quando le larve raggiungono la fase di L4 (~2.5 giorni).

6. preparazione degli streptococchi del gruppo Mitis per infezione

1. Striscia fuori desiderati ceppi di streptococchi la 100 mm x 15 mm THY agar (se le piastre sono stati conservati a 4 ° C, pre-riscaldare le piastre a 37 ° C prima di striature i rispettivi ceppi), quindi incubare le piastre a 37 ° C durante la notte (~ 18 h) in un barattolo di candela fornendo un en microaerofili vironment per la crescita degli streptococchi (le tavole striate possono essere memorizzate per una settimana a 4 ° C).
2. Per propagare gli isolati clinici di streptococchi, utilizzare tryptic soy agar di anima. Incubare le piastre a 37 ° C in un barattolo di candela durante la notte (~ 18 h).
3. Il giorno successivo, rimuovere le piastre dal vaso candela e pick colonie isolate con un'ansa sterile. Inoculare sterile provette coniche da 15 mL contenente 2 mL di tuo brodo. Per propagare gli isolati clinici di streptococchi, supplemento THY brodo con 5% v/v di sangue di pecora. Chiudere i tappi stretti e incubare le provette a 37 ° C in condizioni statiche.

7. sopravvivenza saggi

Nota: I passaggi coinvolti in questo saggio sono illustrati nella Figura 1. Per dimostrare che l'H₂O₂ derivati dal mitis group è responsabile dell'uccisione del worm, integrare i media con catalasi, o il ceppo mutante ΔspxB e del complemento di ceppo ΔspxB; spxB + di S. gordonii può essere utilizzato. SpxB codifica per una piruvato ossidasi, che è responsabile per la produzione di H₂O₂ nel gruppo mitis.

1. Pre-riscaldare 35 x 10 mm THY piastre a 37 ° C. Aggiungere 80 µ l di pernottamento culture coltivate dei desiderata ceppi di streptococchi e diffondere i batteri completamente su tutta la superficie dell'agar utilizzando una spatola sterile. Incubare le piastre a 37 ° C in un barattolo di candela durante la notte (~ 18 h). Come controllo, piastre di NGM seme due 35 x 10 mm con 80 µ l di pernottamento coltivate colture di Escherichia coli OP50. Incubare le piastre a 37 ° C durante la notte.
2. Per confermare che l'H₂O₂ prodotte dal gruppo mitis è responsabile per l'uccisione dei vermi, aggiungere 50 µ l contenente 1.000 unità di catalasi c su THY piastra. Stendere la soluzione di catalasi utilizzando una spatola sterile e lasciare le lastre a secco nel flusso laminare per 30 min. seme le piastre da allora in poi con i ceppi di streptococco rispettivi come descritto al punto 7.1.
3. Il giorno successivo, rimuovere le piastre dal vaso candela e consentire le piastre raffreddare a RT per 10-15 minuti usando un verme sterile pick, trasferimento 30 larve L4 dalla NGM o RNAi NGM alimentazione piastre per lo streptococco seminato tuo piastre. Utilizzare due teste di serie THY piastre con un totale di 60 worm al ceppo di streptococco. Incubare le piastre a 25 ° C.
4. Usando un microscopio per dissezione, contare il numero di vivi e morti larve L4 su ogni piatto timepoints diversi. Inizialmente, segnare i vermi come morto o vivo ogni 30 min. Da allora in poi, quando vermi rapidamente iniziano a morire, Punteggio loro ad intervalli di 15 min. Utilizzare il plettro di verme sterile delicatamente prod i vermi e determinare se sono vivo o morto. Un worm è considerato morto se non c'è nessun movimento in risposta al pungolo.
5. Il test avrà 5-6 ore per completare. Ripetere l'esperimento altre due volte. Dopo il completamento del test, piscina i dati delle due placche. Inserire i dati di ogni gruppo, confrontare le curve di sopravvivenza ed eseguire analisi di sopravvivenza di Kaplan-Meier utilizzando il software statistico.

8. preparazione di pastiglie di agarosio per microscopia

1. Sciogliere 2% p/v di agarosio in acqua deionizzata riscaldando la soluzione in un forno a microonde. Un volume di 5 mL di soluzione è sufficiente per preparare 20 vetrini.
2. Attaccare il nastro di laboratorio longitudinalmente lungo due lastre di vetro. Questo determinerà lo spessore delle pastiglie dell'agarosi. Posto un vetrino pulito tra le due diapositive nastrate.
3. Posto 100 µ l di agarosio fuso al centro del vetrino pulito. Posizionare immediatamente un altro bicchiere pulito in cima l'agarosio fuso e premere delicatamente per rendere un pad. Consentire l'agarosio solidificare e successivamente rimuovere la slitta superiore. Il pad dell'agarosi è pronto per l'uso.

9. osservazione della localizzazione di SKN-1 in risposta all'infezione di streptococco

Nota: I passaggi coinvolti in questo saggio sono rappresentati in Figura 2. Localizzazione di SKN-1 è stata determinata utilizzando il ceppo di verme transgenici SKN-1B/C::GFP. Per dimostrare la localizzazione di SKN-1 dovuta alla produzione di H₂O₂ dal gruppo mitis, wild type (WT), ΔspxB e il complemento di ceppo ΔspxB; spxB + di S. gordonii sono stati usati. Inoltre, il ceppo transgenici reporter SKN-1B/C::GFP e la tecnica di interferenza di RNAi sono stati utilizzati per dimostrano che le componenti del pathway MAPK p38 regolano la localizzazione di SKN-1.

1. Pre-riscaldare 35 x 10 mm THY piastre a 37 ° C. Aggiungere 80 µ l di pernottamento culture coltivate dei desiderata ceppi di streptococco e diffondere i batteri completamente su tutta la superficie dell'agar utilizzando una spatola sterile. Incubare le piastre a 37 ° C in un barattolo di candela durante la notte (~ 18 h). Come controllo, piastre di NGM seme tre 35 x 10 mm con 80 µ l di pernottamento coltivate colture di Escherichia coli OP50. Incubare le piastre a 37 ° C per ~ 18 h.
2. Il giorno successivo, rimuovere le piastre dal vaso candela e consentire le piastre raffreddare a RT per 10-15 min Wash L4 larve utilizzando M9W da NGM e piastre d'alimentazione NGM RNAi. Raccogliere i vermi in provette coniche da 15 mL.
3. Girare i tubi a 450 x g per 1 min. decantare il supernatante e aggiungere 10 mL di M9W.
4. Ripetere il punto 9.3 tre volte di più.
5. Risospendere i vermi in ~ 250 µ l di M9W e luogo gocce tre 5 µ l della sospensione verme sul coperchio pulito di Petri e stimare il numero di vermi per µ l utilizzando un microscopio per dissezione.
6. Aggiungere larve L4 ~ 100 a ogni tuo streptococco seminato e NGM Escherichia coli seminato piastre. Utilizzare tre piastre al ceppo di batteri. Incubare le piastre per 2-3 h a 25 ° C.
7. Successivamente, rimuovere le piastre dall'incubatrice, lavarli con M9W e raccogliere i vermi in provette coniche da 15 mL.
8. Lavare i vermi 3 x come descritto nei passi 9.3.
9. Rimuovere la maggior parte della M9W dall'aspirazione e aggiungere 500 µ l di M9W contenente 2 mM sodio azide o 2mm Tetramisolo cloridrato al pellet di verme. Questo sarà anestetizzare i vermi, assicurando che nessun movimento si verifica quando imaged sotto il microscopio.
   Attenzione: Utilizzare dispositivi di protezione individuale (PPE) durante la manipolazione di sodio azide. Preparare la soluzione di azide sotto una cappa chimica.
10. Incubare i pellet di verme a RT per 15 min. Quindi, individuare 15 µ l della sospensione verme su un blocchetto di agarosio preparati. Posizionare delicatamente un vetrino coprioggetti n. 1.5 sopra il pad di agarosio contenente i vermi anestetizzati.
11. Utilizzando un microscopio a fluorescenza, visualizzare la localizzazione di SKN-1 che utilizzano filtri FITC e DAPI. Vermi di immagine alle 10 x e 20 x ingrandimenti.
12. Segnare i vermi sulla base del livello di localizzazione di SKN-1. Nessuna localizzazione nucleare, la localizzazione di SKN-1B/C::GFP nell'anteriore o posteriore del verme e localizzazione nucleare di SKN-1B/C::GFP in tutte le cellule intestinali sono classificati come basso, medio e alto livello di localizzazione, rispettivamente.
13. Dopo aver segnato i micrografi fluorescente, determinare le differenze statistiche di chi-quadrato e test esatto di Fisher, utilizzando software statistico.

Risultati

Gruppo del mitis S. mitis, S. oralis e S. gordonii rapidamente uccisi i vermi, al contrario di S. mutans, S. salivarius e non patogeni di e. coli OP50 (Figura 3A). La sopravvivenza mediana per S. mitis, S. oralis e S. gordonii era 300 min, min 300 e 345 min, rispettivamente. Per determinare se l'uccisione è stata mediata dalle H₂O₂, catalas...

Discussione

I metodi descritti possono essere utilizzati per altri batteri patogeni quali Enterococcus faecium, che produce anche H₂O₂ cresciuti sotto anaerobico o microaerofili condizioni²⁶. In genere, per più germi patogeni, ci vogliono diversi giorni per settimane per completare le analisi di sopravvivenza. Tuttavia, a causa della produzione robusta di H₂O₂ dai membri del gruppo di mitis, queste analisi potrebbero essere completate entro 5-6 h nelle con...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Media and chemicals
Agarose	Sigma Aldrich	A9539-50G
Bacto peptone	Fisher Scientific	DF0118-17-0
BD Bacto Todd Hewitt Broth	Fisher Scientific	DF0492-17-6
BD BBL Sheep Blood, Defibrinated	Fisher Scientific	B11947
BD Difco Agar	Fisher Scientific	DF0145-17-0
BD Difco LB Broth	Fisher Scientific	DF0446-17-3
Blood agar (TSA with Sheep Blood)	Fisher Scientific	R01200
Calcium Chloride	Fisher Scientific	BP510-500
Carbenicillin	Fisher Scientific	BP26481
Catalase	Sigma Aldrich	C1345-1G
Cholesterol	Fisher Scientific	ICN10138201
IPTG	Fisher Scientific	MP21021012
Magnesium sulfate	Fisher Scientific	BP213-1
Nystatin	Acros organics	AC455500050
Potassium Phosphate Dibasic	Fisher Scientific	BP363-500
Potassium phosphate monobasic	Fisher Scientific	BP362-500
Sodium Azide	Sigma Aldrich	S2002-25G
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	SS266-1
8.25% Sodium Hypochlorite
Sodium Phosphate Dibasic	Fisher Scientific	BP332-500
Streptomycin Sulfate	Fisher Scientific	BP910-50
Tetracyclin	Sigma Aldrich	87128-25G
(−)-Tetramisole hydrochloride	Sigma Aldrich	L9756
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500
Consumables
15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-269
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL	Fisher Scientific	07-200-574
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL	Fisher Scientific	07-200-575
Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 x 10 mm)	Fisher Scientific	08-757-100A
No. 1.5  18 mm X 18 mm Cover Slips	Fisher Scientific	12-541A
Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm)	Fisher Scientific	FB0875713A
Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm)	Fisher Scientific	FB0875712
Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm)	Fisher Scientific	12-544-4
Software
Prism	Graphpad
Bacterial Strains
S. oralis ATCC 35037
S. mitis ATCC 49456
S. gordonii DL1 Challis
E. coli OP50
E. coli HT115
Worm Strains
Strain	Genotype	Transgene	Source
N2	C. elegans wild isolate		CGC
EU1	skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V)		CGC
LD002	IdIs1	SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006)	Keith Blackwell