Enzymatische Stabilität durch isothermen Titration Kalorimetrie Messung

Zusammenfassung

Die thermische Stabilität der Enzym-Aktivität wird leicht durch isothermen Titration Kalorimetrie (ITC) gemessen. Die meisten Protein Stabilität Assays derzeit verwendet Maßnahme Protein entfaltet, aber keine Informationen über enzymatische Aktivität. ITC ermöglicht die direkte Bestimmung der Wirkung des Enzyms Modifikationen auf die Stabilität der Enzym-Aktivität.

Zusammenfassung

Diese Arbeit zeigt eine neue Methode zur Messung der Stabilität der Enzymaktivität durch isothermen Titration Kalorimetrie (ITC). Der Gipfel Wärmerate nach eine einzige Injektion der Substrat-Lösung in eine Enzymlösung mit Enzym-Aktivität korreliert ist zu beobachten. Mehrere Injektionen des Substrates in das gleiche Enzym-Lösung im Laufe der Zeit zeigen den Verlust der Enzymaktivität. Der Test ist autonom, erfordert sehr wenig Personal Zeit und ist für die meisten Medien und Enzyme.

Einleitung

Enzyme sind Proteine, die in der Lage, eine breite Palette von organischen Reaktionen katalysieren. Die meisten Enzyme Funktion in wässriger Lösung an in der Nähe von neutralen pH-Wert, wodurch den Einsatz von harten Lösungsmitteln. Wegen der hohen Selektivität, katalysierten Enzymreaktionen produzieren weniger (in einigen Fällen keine Nebenprodukte) Nebenprodukte als nicht-selektive Katalysatoren wie Säuren und Laugen¹. Dies ist besonders relevant in der Lebensmittel verarbeitenden wo alle chemische Reaktionen durchgeführt werden müssen, so dass das Endprodukt für den menschlichen Verzehr unbedenklich ist. Derzeit werden Enzyme verwendet, um hohen Fructose Corn Sirup², Käse³, Bier⁴, laktosefreie Milch⁵und andere wichtige Nahrungsmittel zu produzieren. Während dieser Arbeit konzentriert sich auf Enzym-Einsatz in der Lebensmittelindustrie, gibt es viele andere Verwendungen für Enzyme, die unter anderem in grüne Chemie und Drogen-Synthese.

Das Dienstprogramm von Enzymen ist begrenzt durch die Stabilität der Enzym-Aktivität, die Aufrechterhaltung der dreidimensionalen Struktur des Enzyms abhängt. Die Enzymstruktur kann durch Modifikationen wie Pegylierung⁶, Immobilisierung auf eine solide Unterstützung⁷, gentechnische Veränderungen⁸und Formulierungen stabilisiert werden. Derzeit Enzymstabilität bemisst sich in der Regel durch differential scanning-Kalorimetrie (DSC) und Endpunkt Enzymaktivität assays⁹. DSC misst die Temperatur, bei der ein Enzym entfaltet; Je höher die Temperatur, desto stabiler ist die Struktur. Verlust der Aktivität tritt jedoch oft bei einer niedrigeren Temperatur als erforderlich, um das Enzym oder Domänen innerhalb der Enzym-¹⁰entfalten. DSC ist daher nicht ausreichend, um festzustellen, ob eine Änderung des Enzyms die Stabilität der Enzym-Aktivität erhöht. Endpunkt-Enzym-Assays sind in der Regel Zeit intensiv, erfordern mehrere Proben und beinhalten oft eine gekoppelte kolorimetrischen Reaktion, die auf stark farbigen oder opak Lösungen oder Suspensionen nicht anwendbar ist.

Diese Arbeit zeigt eine Methode zur direkten Messung der Stabilität der Enzymaktivität durch isothermen Titration Kalorimetrie (ITC). ITC misst die Geschwindigkeit von Wärme freigesetzt oder aufgenommen im Verlauf einer Reaktion. Da fast alle Reaktionen produzieren oder Wärme absorbieren, kann ITC verwendet werden, für die meisten Enzym-katalysierten Reaktionen, einschließlich der Reaktionen, die nicht über eine gekoppelte Reaktion oder auftreten in undurchsichtigen Medien wie Milch. ITC seit vielen Jahrzehnten verwendet wurde, um chemische kinetische Parameter für viele Arten von Reaktionen zu messen, aber das Protokoll hier vorgestellten mit ITC um zu messen, die Spitze Wärmerate von Enzym-katalysierten Reaktionen im Mittelpunkt und zeigt, dass Enzymaktivität linear mit der Spitze Wärmerate korreliert. ITC Messungen von Peak-Hitze-Preise sind meist autonom und benötigen sehr wenig Personal Zeit einzurichten und zu analysieren.

Protokoll

1. Vorbereitung der Proben

1. 1.000 mL 0,1 M-Natrium-Acetat-Puffer bei pH 4.6
   1. 800 mL destilliertem Wasser in ein Becherglas 1.000 mL Schloss zu messen.
   2. Gewicht 8,2 g wasserfreiem Natriumacetat und fügen Sie es den Becher.
   3. Stellen Sie den Becher auf einem Teller rühren, place einen rühren Stab in das Becherglas, schalten Sie die Platte rühren und rühren vollständig aufgelöst.
   4. Wenn wasserfreiem Natriumacetat vollständig aufgelöst ist, Messen Sie den pH-Wert der Lösung mit einem kalibrierten pH-Meter.
   5. Fügen Sie 1 M HCl oder NaOH entsprechend um den gewünschten pH-Wert 4,6 zu erhalten.
   6. Fügen Sie destilliertes Wasser hinzu, bis das Gesamtvolumen 1.000 mL beträgt.
   7. Bis zur Verwendung bei Raumtemperatur lagern.
2. Enzymlösung
   1. 10 mL von dem Enzym Lösung im Bereich 10-30 mg/mL durch die erste Messung 8 mL der 0,1 M Natrium Acetat-Puffer pH 4.6 in 15 mL graduierte Zylinder vorzubereiten.
   2. Fügen Sie die Pufferlösung in ein 15 mL konische Röhrchen mit Enzym hinzu und schütteln Sie kräftig, bis sich das Enzym aufgelöst hat.
   3. Fügen Sie weitere Pufferlösung, bis das Gesamtvolumen 10 mL beträgt.
   4. Speichern Sie das Enzymlösung bei 4 ° C bis zur Verwendung.
3. Substratlösung
   1. Um eine Substratlösung im Bereich von 300-600 mM vorzubereiten, berechnen Sie die Menge des Substrats in Gramm benötigt, um die gewünschte Konzentration zu machen.
   2. Wiegen Sie das Substrat und legen Sie in einem 100 mL-Becherglas
   3. Messen Sie 20 mL der Pufferlösung mit 25 mL graduierte Zylinder zu und fügen Sie ihn in das Glasgefäß.
   4. Stellen Sie den Becher auf einem Teller rühren und legen Sie einen Magnetisches Rühren Stab in das Becherglas. Schalten Sie die Hitze und anzupassen Sie die Rührgeschwindigkeit entsprechend.
   5. Lassen Sie rühren weiter, bis das Substrat aufgelöst hat.
   6. Gießen Sie die Substratlösung in ein 50 mL konische Röhrchen und 0,1 M Natrium Acetat-Puffer pH 4,6 bis 45 mL beträgt. Durch Schütteln mischen.
   7. Speichern Sie die Substratlösung bei Raumtemperatur bis zu seiner Verwendung.

2. Durchführung des Experiments

1. Vorbereitung des ITC-Instruments
   1. Sicherstellen Sie, dass die Referenzzelle mit 350 µL destilliertes Wasser geladen wird. Sicherzustellen Sie bevor das Enzym in den Sample-Zelle geladen, dass die Sample-Zelle gereinigt wurde.
   2. Reinigung Protokoll-Füllung der Laden-Spritze mit 500 µL 2 % Reinigungslösung (Table of Materials), stechen Sie die Nadel vorsichtig in die Sample-Zelle, füllen Sie die Zelle und entfernen Sie langsam die Flüssigkeit mit der gleichen Spritze. Entsorgen Sie die Flüssigkeit in einen Becher füllen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal mit 2 % Reinigungslösung (Table of Materials), drei Mal mit 70 % Ethanol und dann waschen Sie zehn Mal mit destilliertem Wasser.
   3. Füllen Sie die Spritze laden mit 450 µL Enzymlösung, sorgfältig stechen Sie die Nadel nach unten von der Sample-Zelle und drücken Sie den Kolben bis zu 100 µL Zeile langsam zur Bildung von Luftblasen zu verhindern.
   4. Waschen Sie die 50 µL Titration Spritze mit destilliertem Wasser dreimal durch Platzieren der Nadelspitze in Wasser langsam nimmt das Wasser in die Spritze, dann Verzicht auf das Wasser in einen Abfallbehälter.
   5. Restwasser durch das Ausspülen mit Substratlösung dreimal zu entfernen.
   6. Füllen Sie die Titration Spritze mit Substratlösung zeichnen die Lösung, bis die Spritze ohne Luftblasen voll ist.
   7. Entfernen Sie mit der Spritze immer noch in der Substratlösung den Kolben zu und ermöglichen Sie etwa 2 µL der Luft geben die Spitze der Spritze und den Kolben.
   8. Entfernen Sie die Bürette Griff des ITC, legen Sie die Spritze in die Bürette Griff und Schraube bis zum Anschlag.
   9. Wischen Sie die Spitze des Rührers mit einem fusselfreien Tuch ab, dann setzen Sie die Bürette Griff in der ITC-Instrument vorsichtig und verriegeln Sie ihn.

3. Einrichten der ITCrun

1. Öffnen Sie auf dem Computer ITCrun und klicken Sie auf Einrichten.
2. Klicken Sie unter ständigem Rühren Rate und bis 350 u/min eingestellt. Überprüfen Sie die Spritze Größe (µL) und sicherzustellen Sie, dass es bei 50 µL.
3. Stellen Sie die Temperatur ein, und drücken Sie Update. Es wird empfohlen, dass dieser Schritt durchgeführt werden mindestens 1 h vor der Zubereitung der ITC. Damit genügend Zeit für das Instrument zu erwärmen oder abkühlen, je nach Bedarf.
4. Wählen Sie für das Experiment-Setup inkrementelle Titration.
5. Klicken Sie auf Einfügen , um die Injektionen setup. Passen Sie die Injektion-Intervall auf 5.400 s, Injektionsvolumen (µL) auf 4 und Anzahl der Injektionen bis 4. Drücken Sie "OK" , um die Einstellungen zu bestätigen.
6. Wählen Sie im Gleichgewichtherstellung Box Auto equilibrate und große erwartet erwärmt. (Wenn die erwarteten heizt klein sind, kann eine auswählen kleine unter erwarteten erwärmt, dadurch erhöht sich jedoch die Gleichgewichtherstellung Zeit.)
7. Legen Sie die erste Grundlinie auf 300 s.
8. Auf der Flucht, klicken Sie auf start der starten symbol neben rühren bewerten und klicken Sie neben das Schraubenschlüssel-Symbol starten .
9. Speichern Sie die Datei und lassen Sie das Gerät laufen.

4. Analyse von Daten

1. Öffnen Sie die Datei in NanoAnalyze. Klicken Sie auf Daten und wählen Sie Datenspalten.
2. Wählen Sie alle Daten, kopieren Sie und fügen Sie dann die Daten in Microsoft Excel.
3. Stellen Sie Null Grundlinie durch Mehrwert erforderlich bei 300 s zu Null. Gelten Sie diese Korrektur für die gesamte Spalte der Hitze Rate Werte.
4. Den minimalen oder maximalen Wert der Hitze Rate für jede Injektion mithilfe der Gleichung zu finden: =MIN(cell:cell) oder MAX(cell:cell). Jeder Datenpunkt stellt die Höhepunkt enzymatische Aktivität des Enzyms bei jeder Injektion.
5. Plot-Diagrammen der MIN oder MAX Werte gegen die Zeit, zu der der Wert während der Titration aufgetreten ist.

Ergebnisse

Die repräsentativen Ergebnisse in Abbildung 1 und Abbildung 5 zeigen Daten aus zwei Enzyme, Laktase und Invertase. Laktase und Invertase katalysieren die Hydrolyse von einem Disaccharid in zwei Monosaccharide, endothermically und exotherm, beziehungsweise. Beide enzymatischen Reaktionen wurden bei Konzentrationen ausgeführt, die Sättigung des Enzyms ausgeschlossen.

Die Laktase-Daten zeigen, Verwendung von ITC Daten Enzymstabilität...

Diskussion

Automatisierung ist ein großer Vorteil des ITC Enzym Stabilität Tests hier beschrieben. Sobald die entsprechende Puffer und Lösungen vorgenommen werden, wird die Rüstzeit für jedes Assay ca. 15 min für die Person, die den Assay. Im Gegensatz dazu die konventionellen Assays für die Invertase und Laktase-Aktivität erfordern ca. 2 h mit kontinuierlichen Beteiligung von der Person, die die Probe und viele enzymatische Aktivität Assays nehmen wesentlich mehr Personenstunden. In einer früheren Publikation haben wir g...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
a-Lactose	Fisher Scientific	unknown (too old)	500g
Sodium Acetate, Anhydrous 99% min	Alfa Aesar	A13184-30	250g
Lactase	MP Bio	100780	5g
Hydrocholric Acid Solution, 1N	Fisher Scientific	SA48-500	500mL
Benchtop Meter- pH	VWR	89231-622
Ethanol 70%	Fisher Scientific	BP8231GAL	1gallon
Micro-90	Fisher Scientific	NC024628	1L (cleaning solution)