Geração rápida de culturas de melanócitos e fibroblastos de Murina primária

Resumo

Este protocolo esboça um método rápido para gerar simultaneamente culturas do melanócito e do fibroblasto da pele de 0-4 ratos velhos do dia. Estas culturas primárias podem ser mantidas e manipuladas in vitro para estudar uma variedade de processos fisiologicamente relevantes, incluindo biologia celular da pele, pigmentação, cicatrização de feridas e melanoma.

Resumo

Os defeitos na função do fibroblasto ou do melanócito são associados com as doenças de pele, incluindo a função pobre da barreira, a cura defeituosa da ferida, defeitos da pigmentação e cancro. Vital para a compreensão e melhora dessas doenças são experimentos em fibroblastos primários e culturas de melanócitos. Não obstante, os protocolos atuais para a isolação do melanócito exigem que as camadas epidérmicas e dérmicas da pele estejam tripsinizadas e desassociaram manualmente. Este processo é demorado, tecnicamente desafiador e contribui para rendimentos inconsistentes. Além disso, os métodos para gerar simultaneamente culturas puras do fibroblasto da mesma amostra do tecido não estão prontamente-disponíveis. Aqui, nós descrevemos um protocolo melhorado para isolando melanócitos e fibroblastos da pele dos ratos em dias pós-natal 0-4. Neste protocolo, a pele inteira é homogeneizada mecanicamente usando um interruptor inversor do tecido e então digerido momentaneamente com o colagenase e o Trypsin. As populações da pilha são isoladas então com o chapeamento seletivo seguido pelo tratamento G418. Este procedimento resulta em rendimentos consistentes de melanócitos e fibroblastos de um único rato em menos de 90 min. Este protocolo também é facilmente escalável, permitindo que os pesquisadores processem grandes coortes de animais sem um aumento significativo no tempo hands-on. Nós mostramos através das avaliações cytometric do do fluxo que as culturas estabelecidas usando este protocolo são enriquecidas altamente para melanócitos ou fibroblasto.

Introdução

A pele de mamíferos é um órgão multicamada que protege o corpo de patógenos estrangeiros e irradiação ultravioleta (UVR). A pele também desempenha um papel crítico em processos homeostáticos como cicatrização de feridas, regulação da temperatura e produção de vitamina D^1,2,3. A pele de mamíferos consiste em três tipos principais da pilha: melanócitos, fibroblasto e keratinocytes. Estes tipos de células povoam diferentes camadas da pele, com queratinócitos que compõem a epiderme, fibroblastos residentes na derme e melanócitos localizando a junção epidérmica-dérmica e folículos pilosos⁴. Aqui, nós detalham um procedimento simples que permita a geração simultânea de culturas primárias do melanócito e do fibroblasto da pele murino.

Os melanócitos são células produtoras de pigmentos encontradas em muitos locais em todo o corpo humano, incluindo a epiderme basal, íris, cóclea, cérebro e folículos pilosos⁵. A função primária dos melanócitos é gerar e secretar vesículas contendo melanina^,denominadas melanosomas^5,6. Os melanosomas contêm duas classes principais da melanina: eumelanina marrom/preto e feomelanina amarelo/vermelho^6,7. Os processos bioquímicos dentro do melanócito regulam a abundância relativa de cada espécie da melanina e ajudam a determinar a cor do cabelo, da pele e do olho^8,9. A melanina também serve para absorver a UVR e proteger os tecidos expostos ao sol da mutagenese¹⁰.

A disfunção de melanócitos pode causar defeitos pigmentares e aumentar a susceptibilidade do cancro da pele. Por exemplo, os remendos da pele Hyper-pigmented característicos do melasma são o resultado da superprodução focal da melanina, visto que as mutações genéticas do germline que comprometem genes envolvidos na síntese da melanina conduzem ao albinismo^11,12 . O conhecimento íntimo da biologia do melanócito é exigido para desenvolver as estratégias que corrijam tais defeitos pigmentários e melhoram finalmente o bem-estar psicossocial dos indivíduos afligidos com estas doenças. Os déficits na produção de melanina e/ou a síntese preferencial de feomelanina também estão associados ao aumento do risco de câncer de pele¹⁰. Acredita-se que esse risco resulte da redução da proteção UVR^6,13. Assim, métodos para melhorar ou restaurar a produção de eumelanina em melanócitos podem reduzir a incidência de câncer de pele nessas populações.

Os fibroblastos mesenquimais estabelecem o tecido conjuntivo e o suporte estrutural para todos os órgãos do corpo, incluindo a camada dérmica da pele¹⁴. A excreção de proteínas como colágeno, elastina, laminina e fibronectina permitem que os fibroblastos formem a matriz extracelular (ECM) que é essencial para a integridade tecidual^1,14. Os fibroblastos também desempenham papéis essenciais em processos como cicatrização de feridas, inflamação, angiogênese e formação/progressão do câncer^1,15,16.

Similar aos melanócitos, os defeitos na ativação e na função do fibroblasto podem promover o tumorigênese e a doença. Por exemplo, a ativação inadequada do fibroblasto conduz geralmente à formação da fibrose, resultando da deposição aumentada de componentes excedentes do ECM no tecido circunvizinho. Como os fibroblastos mantêm grande parte da integridade estrutural do corpo, a fibrose promove doenças que afetam inúmeros tecidos e órgãos, incluindo fibrose pulmonar idiopática, esclerose sistêmica, cirrose hepática e Fibrose cardíaca¹⁵. Os fibroblastos também desempenham um papel crítico no câncer¹⁶. Os fibroblastos associados ao câncer (CAFs) são as células não malignas mais abundantes no microambiente de muitos tumores. Os CAFs demonstraram promover a proliferação tumoral, a progressão e a resistência terapêutica, modulando a rigidez tecidual, a produção local de citocinas e a função imune¹⁶.

As culturas de células primárias fornecem aos pesquisadores modelos geneticamente tratável para identificar e mitigar os defeitos de melanócitos e fibroblastos que levam à doença. No entanto, os métodos atuais para estabelecer culturas de melanócitos são demorados e tecnicamente desafiadores. A necessidade de tripsinização e a separação delicada da epiderme e da derma contribuem à variabilidade no rendimento experimental e fazem difícil executar experimentos em grande escala. Além disso, os protocolos para isolar simultaneamente os melanócitos e os fibroblasto da pele inteira estão faltando atualmente no campo.

Desenvolvemos um método para reduzir as etapas de processamento, a variabilidade e o tempo necessário para estabelecer culturas de melanócitos e fibroblastos da mesma amostra de pele inteira. Usando um método mecânico da homogeneização seguido por uma digestão breve, nossa estratégia diminui significativamente a quantidade de tempo hands-on exigido para isolar melanócitos preliminares ao permitir o isolamento simultâneo do fibroblasto. O aumento da velocidade, eficiência e consistência deste protocolo, em combinação com a capacidade de isolar melanócitos de camundongos de 0-4 dias de idade, fornece aos pesquisadores a flexibilidade para realizar uma ampla gama de experimentos do que antes possível.

Protocolo

Obter aprovação do seu Comitê de ética animal institucional antes de iniciar este ou qualquer outro estudo envolvendo animais. Os experimentos realizados neste protocolo foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade Estadual de Ohio (IACUC, protocolo #2012A00000134).

1. preparação do protocolo

Nota: As seguintes instruções da preparação do reagente são apropriadas para a geração de 9 cm² culturas do melanócito e do fibroblasto de um único rato. Consulte o guia de preparação do reagente na tabela 1 para isolamentos de maior escala.

1. Prepare 1,5 mL de solução de colágeno contendo 50 μg/mL de colágeno em 0,1 M de ácido acético glacial.
2. Em um armário do fluxo laminar, cubra um poço de um prato da cultura da pilha de 6 poços com 8 μg/cm² (1,44 ml) solução do colagénio. Assegure-se de que o poço esteja completamente coberto pela solução de colágeno. Incubar o prato a 37 ° c durante 3 h ou a 4 ° c durante a noite. Antes da utilização, lave o poço revestido com colágeno duas vezes com 1,35 mL de solução salina tampão fosfato estéril (PBS) (150 μL de PBS por 1 cm²).
3. Monte o helicóptero do tecido em um armário do fluxo laminar coloc com cuidado um disco de desbastamento na plataforma do interruptor inversor do tecido e prendendo uma lâmina estéril ao braço móvel.
4. Prepare 3 mL de 1x antibiótico/antimicótico solução diluindo 100x antibiótico/antimicóticos solução de estoque em PBS estéril.
5. Prepare 3 mL de tampão de digestão da pele fresco contendo 10% de soro bovino fetal, 1% de solução de penicilina/estreptomicina, 1% de L-glutamina, 10 mg/mL de colagenase tipo I, 0,25% de tripsina suína e 0, 2 mg/mL de desoxiribonuclease I em RPMI 1640.
6. Prepare 6 ml de meios de melanócitos frescos contendo 10% de soro bovino fetal, 7% de soro de cavalo, 1% de solução de penicilina/estreptomicina, 1% de L-glutamina, 0,5 mm di-butyryl amp cíclico (dbcamp), 20 nm de phorbol 13-acetato (TPA) e 200 PM Nutriente Mix F-12 Ham ' s Media.
   Nota: As soluções de estoque concentrado de dbcAMP, TPA e CT podem ser feitas, aliquotadas e armazenadas por > 1 ano a-80 ° c. Os suportes de dados de base que faltam estes componentes podem ser guardados até 1 mês a 4 ° c.
7. Prepare 4 mL de fibroblastos contendo 10% de soro bovino fetal, 1% de penicilina/estreptomicina e 1% de L-glutamina no meio de águia modificada de Dulbecco. Esta mídia pode ser armazenada a 4 ° c por até 1 mês.
8. Prepare 40 mL de solução de paraformaldeído a 4% diluindo o paraformaldeído a 16% em PBS. Armazene qualquer excesso a 4 ° c por 1 mês ou-20 ° c por até 1 ano.
9. Prepare uma solução de estoque de saponina a 1% misturando 0,5 g de saponina em 50 mL de PBS a 37 ° c até que a saponina tenha sido completamente dissolvida. Esterilize a solução para o armazenamento a longo prazo usando uma seringa de 50 mL equipada com um filtro do PES de 0,2 μm. A solução de estoque resultante de saponina pode ser mantida a 4 ° c por 1 mês.
10. Prepare 200 μL de 0,1% de solução de saponina por rato diluindo a solução de stock de saponina a 1% em PBS contendo 3% de albumina sérica bovina (BSA).
11. Prepare 1 mL de solução de viabilidade diluindo 1 μL de corante de viabilidade fixável em 1 mL de PBS.

2. isolamento de melanócitos e fibroblastos

1. Euthanize 0 a 4 filhotes masculinos e/ou fêmeas do C57Bl/6J do dia-velho pela decapitação e removem as extremidades dos ratos eutthanized usando tesouras cirúrgicas.
2. Em um armário do fluxo laminar, enrole momentaneamente o tronco de cada rato em um prato de Petri estéril que contem o etanol de 70%. Retire o tronco do etanol e coloque-o em um prato de Petri vazio e estéril.
3. Usando tesouras cirúrgicas, esterilizados em etanol a 70%, faça uma incisão na pele no lado ventral do tronco a partir do pescoço até a cauda. Descasque a pele do tronco do rato usando fórceps estéril.
4. Coloc o lado da derma da pele para baixo em um prato de 6 poços que contem 3 mL do antibiótico 1x/solução Antimycotic e incubar na temperatura ambiente por 2-3 minutos.
5. Gire sobre o interruptor inversor do tecido com as seguintes configurações no lugar: espessura da fatia: 1 μm; Força da lâmina: ~ 60% do máximo; Velocidade: ~ 50% do máximo.
6. Transfira a pele, o lado da derma para baixo, a um disco estéril do interruptor inversor do tecido e passe a pele completamente através do interruptor inversor ativado do tecido 3 vezes.
7. Transfira a pele homogeneizada para um tubo cônico estéril de 15 mL contendo 3 mL de tampão de digestão da pele. Misture a suspensão resultante pipetando para cima e para baixo 10-15 vezes com uma micropipeta P1000.
8. Tampe o tubo cônico e incubar a amostra em um banho de água de 37 ° c por 15 min, invertendo o tubo a cada 3-5 min.
9. Pellet as células na pele homogenear por centrifugação do tubo cônico em um rotor de balde balançando em 750 x g por 5 min à temperatura ambiente.
10. Usando uma micropipeta P1000, lentamente e remover completamente o tampão da digestão da pele que tem cuidado para não perturbar o pellet.
    Nota: Uma porção da pele inteira pode ser conservada nesta fase e usada como um controle para a etapa 3: confirmação da pureza celular. Coe essas células através de um filtro de células de 70 μm e, em seguida, comece na etapa 3,5 para processamento adicional.
11. Ressuspender completamente o pellet celular em 1 mL de melanocyte Media pipetando para cima e para baixo 15-20 vezes com uma micropipeta P1000. Adicione a solução de célula resultante gota gota a um poço não revestido de um prato de 6 poços contendo 1 ml de melanocyte Media.
12. Coloc o homogeneizado chapeado da pele em uma incubadora da cultura do tecido ajustada em 37 ° c e em 5% co_2. Permitir que as culturas para incubar por 40 min.
    Nota: Durante este tempo, alguns fibroblastos no homogeneate da pele aderirão ao prato não revestido quando os melanócitos e os queratinócitos permanecerem na suspensão.
13. Transfira o sobrenadante de cultura do prato não revestido para um poço de um prato de 6 poços pré-lavado e revestido com colágeno. Adicionar G418 à mídia de tal forma que a concentração final é 100 ng/mL.
14. Adicione 2 mL de Fibroblast Media a um poço do prato não revestido, agora contendo fibroblastos aderentes.
15. Incubar ambas as culturas durante a noite em uma incubadora da cultura do tecido ajustada em 37 ° c e em 5% CO₂.
16. Aspirar separadamente a mídia e todos os detritos de cada cultura, 16-24 h após o chapeamento. Lave cada prato duas vezes com 1 ml de PBS estéril e, em seguida, adicione 2 ml de melanócito Media fresco mais 100 ng/ml G418 à cultura de melanócitos e 2 ml de fibroblastos frescos para a cultura de fibroblastos.
17. Depois que as culturas do melanócito foram tratadas com o G418 para 48 h, lave as pilhas duas vezes com 1 ml do PBS estéril e adicione 2 ml de meios frescos do melanócito sem G418 à cultura.
    Nota: Porque os fibroblastos na cultura do melanócito continuam a morrer fora do tratamento borne-G418, lavam o prato com o PBS estéril para remover as pilhas inoperantes e adicionam meios frescos do melanócito. As culturas do melanocyte e do fibroblasto devem ser é quando alcangam 70-80% confluency.

3. confirmação da pureza celular

1. Aspirar a mídia de cada cultura e Lave cuidadosamente cada prato com 1 mL de PBS estéril.
2. Adicionar 0,7 mL de 0,25% de tripsina a cada cultura e incubar as culturas em tripsina a 37 ° c e 5% CO₂ por 1 min.
3. Desalojar as células pipetando a tripsina contra a parte inferior do prato utilizando uma micropipeta P1000.
4. Adicione 0,7 ml dos meios apropriados a cada cultura tripsinizadas e transfira a solução da pilha em um tubo do microcentrifugador de 1,5 ml.
5. Pellet as células por centrifugação em 750 x g por 2 min à temperatura ambiente. Retire e elimine cuidadosamente o sobrenadante utilizando uma micropipeta P1000.
   Nota: As etapas 3.1-3.5 podem ser usadas para passar culturas do melanócito e do fibroblasto. A pelota resultante deve ser ressuscitada na mídia apropriada e colocada em um novo, não revestido (fibroblastos) ou pré-lavado, colágeno-revestido (melanócitos) prato.
6. Ressuscita a pelota da pilha em 0,5 mL de PBS Ice-Cold.
7. Enumerar e transferir 500.000 células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL pré-refrigerada.
8. Repita o passo 3,5 e, em seguida, Ressuspender as células em 100 μL de solução de viabilidade. Incubar a suspensão celular por 30 min a 4 ° c no escuro.
9. Repita os passos 3.5-3.6 duas vezes.
10. Repita o passo 3,5, em seguida, fixar as células por ressuscita a pelota em 100 μL de gelo frio 4% paraformaldeído solução. Incubar a suspensão durante 15 min à temperatura ambiente no escuro.
11. Repita o passo 3,5 duas vezes, cada vez ressuscitem a pelota em 0,5 mL de 3% BSA em 1X PBS.
12. Repita o passo 3,5 e, em seguida, Ressuspender o pellet de células em 100 μL de 0,1% de solução de saponina. Incubar a suspensão durante 15 min à temperatura ambiente no escuro.
13. Repita o passo 3,5, em seguida, Ressuspender o pellet celular em 100 μL de 0,1% solução de saponina contendo 0,5 μg de coelho anti-gp100 anticorpo, 0,5 μg de coelho anti-fibroblasto-específico proteína 1 (FSP1) anticorpo e 0, 25 μg de rato anti-Cytokeratin 14 (K14) anticorpo. Incubar a suspensão durante 1 h à temperatura ambiente no escuro.
    Nota: Enquanto o anticorpo K14 foi comprado pré-conjugado com Alexa fluor 647, os anticorpos gp100 e FSP1 foram conjugados para CF 555 e CF 488, respectivamente. A coloração das populações de controle também deve começar nesta etapa. As populações de células de controle devem ser isoladas da cultura e processadas conforme descrito nas etapas 3.5-3.12.
14. Repita o passo 3,11 duas vezes, para remover qualquer anticorpo não acoplado.
15. Repita o passo 3,5, em seguida, Ressuspender o pellet celular em 200-400 μL de 3% BSA em 1X PBS.
16. Passe a solução da pilha através de um filtro da pilha de 40 μm em um tubo redondo-inferior do poliestireno de 5 mL e analise as pilhas tensas pela citometria do fluxo.

Resultados

Camundongos machos e fêmeas C57Bl/6J foram eutanasiados em dias pós-natal 0-4 e a pele truncal foi submetida à dissociação mecânica como descrito acima. Após o corte, a pele formou uma lama viscosa sem qualquer sinal de tecido estrutural. A centrifugação deste chorume conduziu à formação de uma grande pelota da pilha na parte inferior do tubo cônico e de uma camada de adiposo que flutua sobre o sobrenadante. Esta camada adiposa foi descartada com o sobrenadante, enquanto a pelota restante da célula foi ress...

Discussão

A cultura in vitro de melanócitos primários e fibroblastos levou a avanços significativos na nossa compreensão da biologia da pele e da doença. Este protocolo melhora em cima dos métodos anteriores da isolação do melanócito reduzindo o tempo e o savvy técnico necessários para gerar culturas consistentes do melanócito ao permitir o isolamento simultâneo de fibroblastos da pele. Um romance, elemento de economia de tempo deste procedimento é que a derme e epiderme não precisam ser separadas. Em vez disso, as ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm PES sterile syringe filter	VWR	28145-501
10 cm cell culture dish	Corning	430167
40 µm cell strainer	Fisher Scientific	22363547
5 mL polystyrene round-bottom tubes	Fisher Scientific	352008
6-well cell culture dish	Sigma-Aldrich	SIAL0516
70 µm cell strainer	Fisher Scientific	22363548
Antibiotic Antimycotic Solution (100x)	Sigma-Aldrich	A5955
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP9706-100
CF 488A Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit	Biotium	92273
CF 555 Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit	Biotium	92274
Cholera Toxin	Sigma-Aldrich	C8052
Collagen from rat tail	Sigma-Aldrich	C7661
Collagenase Type I	Worthington Biochemicals	LS004156
Corning Penicillin/Streptomycin Solution	Fisher Scientific	30-002-CL
Cytokeratin 14 Antibody Alexa Fluor 647	Novus Biologicals	NBP2-34403AF647
Deoxyribonuclease I	Worthington Biochemicals	LS002058
Di-butyryl cyclic AMP	Sigma-Aldrich	D0627
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	12800-082
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780	Thermo Fisher	65-0865-14
Ethanol, 200 proof	Fisher Scientific	22032601
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	12306C
FSP1/S100A4 antibody	Millipore Sigma	07-2274
G418 Disulfide	P212121	LGB-418-1
Glacial Acetic Acid	VWR	VWRV0714
Horse Serum	Fisher Scientific	26050088
HyClone L-Glutamine	Fisher Scientific	SH3003402
McIlwain Tissue Chopper	Ted Pella	10180
Melanoma gp100 antibody	Abcam	ab137078
Nutrient Mix F-12 Ham's Media	Sigma-Aldrich	N6760
Phorbol 12-Myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P8139
Pierce 16% Formaldehyde	Thermo Fisher	28908
Porcine Trypsin	Sigma-Aldrich	85450C
RPMI 1640 media	Sigma-Aldrich	R8758
Saponin	Sigma-Aldrich	S-7900
Tissue Chopper Blade	Ted Pella	121-6
Tissue Chopper Plastic Disk	Ted Pella	10180-01
Trypsin	VWR	VWRL0154-0100