非还原 SDS-PAGE 分析与化学交联相结合, 检测培养基细胞中的多物质配合物, 以确认培养中的多物质配合

摘要

长期以来, 人们一直知道二硫化的联系可以稳定许多蛋白质的结构。通过非还原 SDS-PAGE 分析, 是分析通过这些联系稳定的多聚体复合物的一种简单方法。本文通过对人骨骨肉瘤细胞系 U-2 OS 的 dUTPase 核等形态的分析, 说明了该方法的应用。

摘要

许多蛋白质的结构是通过共价二硫连接稳定的。在最近的工作中, 这种债券也被归类为翻译后的修改。因此, 能够研究活细胞中的这种修饰是很重要的。通过两步法进行非还原 SDS-PAGE 分析和甲醛交联, 是分析这些半胱氨酸稳定多聚体复合物的一种简单方法。这种两步法由于技术简单、运行成本低, 有利于发现通过二硫化连接稳定的多质配合物的第一步。在这里, 通过对 utpase 核等形式的具体分析, 用人骨骨肉瘤细胞系 U-2 os 对该方法进行了说明。

引言

长期以来, 人们一直知道二硫化的联系可以稳定许多蛋白质的结构。在最近的工作中, 这种键也被归类为可逆的翻译后修饰, 作为一个基于 cystein 的 "氧化还原开关", 允许调节蛋白质功能, 位置和相互作用^{1,2, 3,4}。因此, 能够研究这种修改是很重要的。通过非还原 SDS-PAGE 分析 5, 是分析这些半胱氨酸稳定多聚类复合物的一种简单方法。SDS-PAGE 分析是许多实验室使用的一种技术, 在这种技术中, 可以快速、轻松、以最低的成本快速获得和解释结果, 并且比用于识别质谱等二硫联系的其他技术更有利. ^,7和圆形二色 8.

确定这种方法是否是有助于研究的适当技术的一个重要步骤是彻底检查感兴趣的蛋白质的主要序列, 以确保存在半胱氨酸残留物。另一个有用的步骤是研究任何以前发表的晶体结构或使用生物信息学应用来探索感兴趣的蛋白质的三维结构, 以可视化半胱氨酸残渣可能位于何处。如果残渣存在于外部表面, 它可能是一个更好的候选物, 以形成一个二硫化链接, 而不是半胱氨酸残留物埋在结构内部。然而, 重要的是要注意的是, 蛋白质可能会在底物相互作用或蛋白质-蛋白质相互作用时发生结构性变化, 从而使这些残留物也暴露在环境中。

然后, 可以用化学交联法使用甲醛来验证已鉴定的多聚体配合物。甲醛是这种验证技术的理想交联剂, 因为细胞渗透率高, 交联跨度短, 约 2-3, 确保检测特定的蛋白质-蛋白质相互作用^9,10。本文通过对人骨骨肉瘤细胞系 U-2 OS 11 的核异态分析, 说明了该方法的应用.然而, 该协议可适用于其他细胞系、组织和生物。

研究方案

1. 使用碘乙酰胺阻断游离半胱氨酸残留量

1. 在6厘米2盘中生长 u-2 os^细胞, 在 5% co2 中, 在含有10% 胎儿牛血清和1% 丙酮酸钠的最低必要培养基中生长 u-2 os 细胞, 达到 50%-60% 融合.
2. 在使用前, 制作 10 mM 碘乙酰胺的新鲜库存, 然后丢弃任何未使用的试剂。
3. 直接在细胞培养基中加入 0.1 mM 的最终浓度碘乙酰胺。在室温下轻轻摇晃两分钟。

2. 收集细胞

1. 从细胞中吸收培养基。
2. 用5毫升的冷磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 清洗细胞三次。吸收最终的 PBS 洗涤溶液, 然后添加1毫升的冷 PBS。
3. 用刮板刮碗把电池从盘子底部刮下来。使用1毫升移液器绘制 PBS 和细胞悬浮液, 并将所有液体放入 1.5 mL 微离心管中。
4. 在4°c 下, 以 7, 500 x克旋转细胞3分钟。吸收 PBS, 留下细胞颗粒。细胞颗粒可在-80°c 下储存, 直至加工

3. 蛋白质的提取

1. 准备在 ddH_{2o 中}稀释的1x 裂解缓冲液 100Μl (见材料表)。在使用前立即将苯甲基磺酰氟 (PMSF) 添加到 1 mM 的最终浓度中。
2. 将1x 裂解缓冲液直接添加 50Μl, 直接加入细胞颗粒并悬浮。在冰上加用5分钟。
3. 在40% 时使用恒定脉冲模式为8秒的索比 (见声纳材料表; 根据需要为不同的声纳调整), 将提取物保持在冰上。
4. 在4°c 下旋转提取物 5分钟, 16, 000 x g。上清液是可溶性蛋白质的组分。如果需要, 可以进行布拉德福德分析来确定蛋白质浓度。

4. 样品制备

1. 取10Μl 的可溶性蛋白提取物, 加入 1x Laemli sds 样品缓冲液 10μl (4% SDS、20% 甘油、0.004% 溴酚蓝和 0.125 m Tris-HCl, pH 6.8)。不要添加任何还原试剂。
2. 如果当天将进行 SDS PAGE 分析, 则将样品放在冰上;对于长期储存,-20°c 是适当的。在运行凝胶之前, 请在85°c 下加热样品5分钟。

5. U-2 OS 细胞内源蛋白的体内甲醛交联

1. 将 U-2 OS 细胞生长在175厘米²瓶中, 使其达到 70%-80% 的融合 (见第1节)。
2. 进行甲醛交联反应
   1. 在通风罩中, 从商业来源购买的37% 的甲醛溶液。将甲醛固定剂直接添加到培养基中, 最终浓度为 1%, 并在室温下温和搅拌15分钟。
   2. 为了淬火反应, 在 0.125 M 的最终浓度中加入 1.25 M 甘氨酸, 并在室温下在摇杆上轻轻搅拌5分钟。
3. 用5毫升的冷 PBS 清洗细胞三次。吸收最终的 PBS 洗涤解决方案, 并添加10毫升的 PBS。用刮板将烧瓶底部的细胞刮掉。
4. 使用10毫升移液器, 绘制 PBS 和细胞悬浮液, 并将所有液体分配到一个15毫升锥形离心管。在4°C 下, 以 500 x g旋转细胞2分钟。吸收 PBS, 留下细胞颗粒。

6. 核的分馏

1. 制备 10 mL 均质缓冲液: 0.25 M 蔗糖、1 mM EDTA、10 mM HEPES 和 0.5% BSA, pH 7.4。在使用前立即将 PMSF 添加到 1 mM 最终浓度和 3 Ml 的核子悬浮液 (PBS 中为 0.1% Triton X-100) 中。
2. 将5毫升均质化缓冲液直接添加到细胞颗粒中, 并完全悬浮。在4°C 条件下, 以 500 x g离心悬浮液 2分钟, 然后丢弃上清液。
3. 将颗粒悬浮在均质缓冲液的5毫升中。使用紧身玻璃-聚四氟乙烯均质机, 以 10 strokleks/500 rpm 的速度搅拌均质细胞。
4. 在4°C 下, 以 1, 500 x克离心悬浮液 10分钟, 然后丢弃上清液。
   请注意:使用上清液在 10, 000 x g的离心下分离线粒体10分钟。
5. 悬浮在1毫升细胞核悬浮液中的颗粒, 在冰上孵育10分钟。
6. 以 600 x g 离心 10分钟 , 丢弃上清液。
7. 再次将颗粒悬浮在 1 mL 核子悬浮液和离心机中。放弃上清液。最后的颗粒将是孤立的细胞核。

7. 蛋白质的提取

1. 重复第4节, 除了将1x 裂解缓冲液的25Μl 直接添加到细胞颗粒中, 然后悬浮。

8. 样品制备

1. 通过每个可溶性蛋白质提取物 10Μl, 为 SDS-PAGE 准备两个样品, 并加入 2x Laemmli sds 样品缓冲液10Μl 和 2-硫醇 (BME) 1Μl。
2. 在37°c 下加热一个样品 5分钟, 在98°c 下加热第二个样品 15分钟, 以反转甲醛交联。

9. SDS-PAGE 分析

1. 准备 1x 1x 的 Tris-glycine 运行缓冲液 (25 mM Tris, 192 mm 甘氨酸, 0.1% (w/v) SDS)。
2. 设置 SDS-PAGE 运行设备。
   注:此协议使用16% 的预制 TGX sds 页。值得注意的是, 任何百分比的凝胶都可以使用。
   1. 根据制造商协议, 打开存储在其中的包装, 然后取出盒式磁带。
   2. 从盒式磁带底部取下井内衬的梳子和胶带。
   3. 将凝胶放入运行装置中。
   4. 用1x 的运行缓冲液填充室内, 直到井被浸入液体中。使用塑料管道, 用运行的缓冲器冲洗出井。
3. 将样品与10μl 预染色标准标记一起装上凝胶。
4. 运行凝胶在 200 V, 直到染料前部是大约1厘米从底部的凝胶。

10. 西部布洛

1. 准备1升的1x 转移缓冲液 (25 mM Tris, 192 mM 甘氨酸, 20% 甲醇), 并在4°c 下储存, 直到使用。
2. 小心取下凝胶, 打开盒式磁带。使用剃须刀, 小心地切割并丢弃堆叠凝胶。拿起凝胶使用一个角落, 并将其放入托盘与转移缓冲器, 让它轻轻摇晃5分钟。
3. 当凝胶摇晃时, 将一个冰块 (储存在-20°c) 放入转移槽中, 并将转移缓冲液添加到 "满"。
4. 将聚偏氟乙烯 (PVDF) 膜浸泡在100% 甲醇中30秒。
5. 一旦5分钟过去了, 准备在带有传输缓冲区的托盘中设置传输。传输缓冲区应足以完全淹没印迹。设置印迹转移如下: 底部, 盒式磁带支架底部 (黑色);然后是厚海绵、超厚吸墨纸、聚丙烯酰胺凝胶、PVDF 膜、超厚吸墨纸、厚海绵;然后最后在上面的盒式磁带持有人 (白色) 的顶部。
6. 将盒式磁带锁定, 并将设备放入转移槽中, 将 PVDF 膜朝向正极阳极, 将凝胶朝向负极。顶部关闭的单位与转移缓冲区, 直到您的转移完全淹没。
7. 将设备放在搅拌板的顶部。在设备上加入搅拌杆, 并在125转/分开始搅拌。
8. 以 100 V 的速度运行60分钟。
9. 在转移过程中, 用 Tween-20, ph 7.5 (TBST), 准备5% 的奶粉溶液。
10. 拆卸该装置并取出膜, 注意到哪一侧与凝胶接触;确保这一侧在剩余步骤中保持在纸盒中。
11. 将膜浸泡 2分钟, 在三管盐水 (TBS) 中浸泡 2分钟, 然后在室温下孵育5毫升 tbst 溶液中, 在5毫升中堵塞膜, 时间为30分钟。
12. 将牛奶替换为新鲜的4毫升5% 牛奶-tbst 溶液, 并在适当稀释时添加初级抗体 (在这种情况下, 我们的 Utpase 抗体稀释为 1:2000), 并在4°c 下温和摇晃孵育一夜。
13. 第二天, 将印迹从4°c 摇杆移到室温摇杆上, 丢弃主要抗体溶液。
14. 用 TBST 快速清洗三次, 用足够的液体完全淹没印迹, 然后用3次清洗, 每次 5分钟, 慢慢摇晃。
15. 最后清洗后, 加入5% 牛奶 tbst 溶液中的5毫升, 摇摇印迹 15分钟, 然后丢弃。
16. 加入在5% 牛奶 tbst 中稀释的二级抗体, 达到所需的浓度。(在这种情况下, 1:5000 稀释山羊抗兔稀释在5毫升 tbst 溶液5毫升)
17. 在室温下孵化, 摇晃 1小时, 然后丢弃溶液。
18. 用 TBST 快速洗三次, 然后再洗 3次, 每次洗 5分钟, 慢慢摇晃, 然后丢弃最后的清洗, 加入5毫升的 TBS。
19. 准备 ECL 化学发光检测溶液的1:1 混合物 (每个试剂为1毫升, 最终体积为2毫升), 并将其直接添加到印迹孵育1分钟。
20. 使用推拿器取下膜, 用实验室擦拭轻拍眼角, 去除多余的溶液。将膜放入收缩包装中, 并将蛋白质侧放在 x 射线盒式磁带中。
21. 将膜暴露在 x 射线胶片上。接触时间会有所不同。

结果

核 Utpase 通过位于每个单体蛋白11的第三氨基酸上的两个半胱氨酸残基的相互作用, 形成分子间二硫醚链状, 形成稳定的二聚体结构^.图 1a, b对此进行了演示。为了确保这种二价联系不是由于不减少环境中的移徙异常而产生的非特异性相互作用, 必须纳入适当的控制。值得注意的是, 核 dUTPase 是人类中存在的四种异形之一。?...

讨论

本文概述的方法为通过二硫连接稳定的多聚体配合物的分析提供了一种直接的协议。该协议可以很容易地适应其他细胞培养系、组织和生物, 允许广泛的应用。

这一过程中的一个重要步骤是确保二硫连接不是提取过程的结果。任何游离半胱氨酸残留物都可以使用碘乙酰胺¹³阻止。这种烷基化剂通过其硫醇基团与半胱氨酸残基共价结合, 阻止新二硫醚键的形成?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% precast TGX gels	ThermoFisher	Xp00160
175 cm2 Flask	Cell star	658175
18CO	ATCC	CRL-1459
6 cm2 dish	VWR	10861-588
A549	ATCC	CCL-185
Amersham ECL detection kit	GE	16817200
Blot transfer apparatus	Biorad	153BR76789
BME	Sigma Aldrich	M3148
Bradford protein reagent	Biorad	5000006
Bromophenol Blue
BSA	Cell signaling	99985
Cell lysis buffer	Cell signaling	9803
Centrifuge	Eppendor	5415D
DMEM	Gibco	11330-032
Drill
EDTA	Sigma Aldrich	M101
Electrophoresis apparatus	Invitrogen	A25977
Extra thick western blotting paper	ThermoFisher	88610
Fetal bovine serum	Gibco	1932693
Formaldehyde	ThermoFisher	28908
Glass-teflon homogenizer
Glycerol	Sigma Aldrich	65516
Glycine	RPI	636050
Heat block	Denville	10285-D
Hepes	Sigma Aldrich	H0527
Hydrochloric acid	VWR	2018010431
Iodoacetamide	ThermoFisher	90034
Kimwipe	Kimtech	34155
Methanol	Pharmco	339000000
Non-fat dry milk	Cell signaling	99995
PBS	Sigma Aldrich	P3813
PMSF	Sigma Aldrich	329-98-6
Posi-click tube	Denville	C2170
Power supply	Biorad	200120
Prestained marker	ThermoFisher	26619
PVDF membrane	Biorad	162-0177
Rocker	Reliable Scientific	55
Saos2	ATCC	HTB-85
SDS	Biorad	161-0302
Secondary antibody	Cell signaling	70748
Small cell scraper	Tygon	S-50HL class VI
Sodium chloride	RPI	S23020
Sodium pyruvate	Gibco
Sonicator	Branson	450
Sponge pad for blotting	Invitrogen	E19051
Stir plate	Corning	PC353
Sucrose	Sigma Aldrich	S-1888
Tris Base	RPI	T60040
Tris Buffered Saline, with Tween 20, pH 7.5	Sigma Aldrich	SRE0031
Tris-Glycine running buffer	VWR	J61006
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
U-2 OS	ATCC	HTB-96
X-ray film	ThermoFisher	34090