Trasplante subcapsular renal de timo embrionario murino tratado con 2'-desoxiguanosina en ratones desnudos

Resumen

Proporcionamos un método simple y eficiente para trasplantar 2'-deoxyguanosine tratado E18.5 timo en la cápsula renal de un ratón desnudo. Este método debe ser un iida en el estudio de la función de células epiteliales timmicas y la maduración de las células T.

Resumen

El timo es un importante órgano inmune central, que desempeña un papel esencial en el desarrollo y diferenciación de los células T. El trasplante de timo es un método importante para investigar la función de las células epiteliales timmicas y la maduración in vivo de las células T. Aquí describiremos los métodos experimentales utilizados dentro de nuestro laboratorio para trasplantar 2'-deoxyguanosina (para agotar los linfocitos del donante) timo embrionario tratado en la cápsula renal de un ratón desnudo atímico. Este método es simple y eficiente y no requiere habilidades o dispositivos especiales. Los resultados obtenidos a través de este sencillo método mostraron que el timo trasplantado puede apoyar eficazmente la producción de células T del receptor. Además, se aclararán varios puntos clave con respecto al protocolo.

Introducción

El timo es el órgano inmune central, dentro del timo timi citocitos se someten a una selección positiva y negativa, y se convierten en células T maduras^1,2. La selección positiva o negativa anormal da como resultado inmunodeficiencias o patologías autoinmunes respectivamente^3,4. Por lo tanto, el trasplante de órganos de timo es un enfoque importante para estudiar el proceso de selección de células T en el timo del donante. Este método es particularmente crucial cuando se analiza la función epitelial timmica mediada por mutaciones genéticas que causan fenotipo letal embrionario cuando se muta^5.

Para estudiar la maduración de las células T de un receptor en el timo trasplantado, es necesario agotar los linfocitos del donante dentro del timo. Para ello, el timo embrionario de 14, 15 o 16 días (E14, E15, E16) se selecciona generalmente^6,7. El timo de etapas más maduras también se puede agotar con éxito de los linfocitos del donante mediante el tratamiento con 2'-deoxyguanosina. Sin embargo, un protocolo detallado para agotar linfocitos y el uso del cultivo de timo más antiguo no se ha descrito previamente^8,9. Si bien los protocolos de trasplante han sido introducidos por varios estudios^10,11, es necesario modificar y mejorar aún más estos protocolos.

Nuestro protocolo se divide en dos partes: (i) Agotamiento de linfocitos T de la etapa de desarrollo tardío E18.5 timo por cultivo en medios que contienen 2'-deoxyguanosine. (ii) Trasplante del timo cultivado en recipientes. En este procedimiento, desarrollamos una manera sencilla de administrar el tejido grande (E18.5 timo) en la cápsula renal con menor probabilidad de lesión renal. Mientras se centra en el timo de etapa posterior, nuestro protocolo también se puede utilizar directamente o con modificaciones para el trasplante de timo en varias etapas del desarrollo u otros tejidos de tamaño similar.

Protocolo

El protocolo presentado se adhiere a las directrices del comité de ética de la Universidad de Jinan con respecto al cuidado de los animales.

NOTA: Los materiales utilizados se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Aislamiento del timo embrionario

1. Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos antes del experimento, y esterilizar el banco / campana con 70% etanol.
2. Usando dióxido de carbono, anestetiza y eutanasia al ratón hembra embarazada (18,5 días después del apareamiento exitoso). Luego limpie la región abdominal con 70% de etanol.
   NOTA: Aquí nos acoplamos a las hembras Insm1^+/lacZ e Insm1^+/lacZ.  La inyección intraplacentaria de pentobarbital se realizó antes del aislamiento de embriones del útero y se realizó la decapitación para cada embrión.
3. Usando tijeras, haz un corte en forma de "V" en el abdomen comenzando desde la vejiga y corriendo hasta cada cuerno del útero.
4. Con las tijeras, corta el mesometrium y el cuello uterino/vagina, y recoge el útero. Coloque el útero en una placa de Petri que contenga solución salina con fosfato frío (PBS) sobre hielo. A continuación, exponer los embriones que están en la decidua envuelta, cortando la pared uterina anterior de un cuerno uterino a la otra. Usando pinzas finas, retire los tejidos de la decidua envueltos y corte el cordón umbilical para liberar los embriones. Coloque todos los embriones en una nueva placa de Petri en hielo hasta el aislamiento del timo.
5. Limpie un embrión con un 70% de alcohol y colóquelo en un nuevo plato de Petri. A partir de este paso, asegúrese de que se mantengan las condiciones estériles.
6. Cortando cerca de la mandíbula inferior con tijeras, retire la cabeza del embrión y drene la sangre con una toalla de papel. A continuación, fije el embrión en la misma placa de Petri en posición supina.
   NOTA: Cortamos un pedazo de la cola de cada embrión para el genotipado Insm1 y lacZ.
7. Usando tijeras, corta la pared lateral del pecho horizontalmente a lo largo del frente axilar, y luego corta el diafragma para abrir el pecho. El timo ahora debe ser visible como dos lóbulos blancos situados delante de la tráquea y adyacentes al corazón.
8. Coloca los fórceps de punta doblada detrás del timo y luego tira del timo suavemente. Asegúrese de verificar la integridad del timo para confirmar que contiene dos lóbulos articulados.
9. Lavar el timo con 1 PBS y recortar los tejidos conectivos y vasos sanguíneos bajo un estereomicroscopio.

2. Cultivo del timo embrionario aislado

1. Añadir 500 l de medio de cultivo (RPMI1640 + 15% suero bovino fetal (FBS) + 100 U/ml de penicilina y 100 g/ml de estreptomicina) a cada pocal de una placa de 24 pocillos. Transfiere el timi limpio a los pozos con un timo por pozo. La Figura 1 muestra el timo aislado en los medios de cultivo.
2. A cada pozo que contiene timo añadir 2'-desoxigranosina a una concentración final de 1,25 mM.
3. Cultivar el timo aislado durante ocho días, refrescando los medios de cultivo y 2'-desoxigranosina cada dos días.

3. Establecer el espacio subcapsular en la cápsula renal

1. Para preparar la aguja y eltubo de perfusión recortado (Figura 2), corte la aguja de la vena del cuero cabelludo en la parte del tubo en un ángulo de 45o utilizando tijeras.
2. Pesar el ratón desnudo y luego anestesiarlo con un pentobarbital (1,5%) inyección (75 g/g de peso corporal).
3. Cuando no se observe ningún reflejo después del pellizco del dedo del ratón, coloque el ratón sobre la mesa de operación en una posición lateral derecha.
4. Con un hisopo de yodo de povidona al 0,5%, desinfecte la piel dos veces en el área quirúrgica desde el interior hasta el exterior del cuerpo.
5. Con tijeras, haga una incisión cutánea de 5-9 mm paralela a la columna vertebral en el área renal izquierda (entre la última costilla y la cresta ilíaca). A continuación, abra la cavidad abdominal cortando a través del tejido subcutáneo y el músculo y exponga el riñón.
6. Con el riñón expuesto, usa un par de pinzas en una mano para levantar el músculo y el tejido graso del borde de la incisión del lado de la columna vertebral. Con la otra mano, apriete suavemente el riñón (alternativamente, el riñón se puede exprimir con los dedos de ambas manos).
7. Para asegurarse de que la cápsula renal está húmeda durante la cirugía, humedezca la superficie del riñón con salina (0,9% NaCl).
8. Cree un nick en la cápsula renal y rasque suavemente la cápsula renal en la parte inferior derecha usando la punta de la aguja preparada en el paso 3.1. El tamaño de la nick debe ser 1/2–2/3 anchos del riñón; no rasquen el riñón.
9. Deslice el tubo de perfusión preparado en el paso 3.1 en la muesca de la cápsula renal. Disocia suavemente la cápsula renal con el riñón a lo largo del lado largo del riñón hasta llegar a 3-4 mm dentro de la cápsula renal. Retraiga el tubo de perfusión; se establece el espacio subcapsular renal.

4. Trasplantar el timo murino embrionario

1. Lave el timo cultivado en el paso 2.3 dos veces en salina para agotar los medios de cultivo.
2. Conecte el tubo de perfusión recortado preparado en el paso 3.1 a una jeringa en su interfaz de conexión de jeringa. Aspirar el timo preparado en el tubo de perfusión lentamente.
3. Inserte suavemente el tubo de perfusión recortado en la cápsula renal y alcance el polo superior. Entregar el timo en la cápsula renal; retraer el tubo lentamente mientras empuja suavemente el émbolo de la jeringa.
4. Con una lámpara de alcohol, caliente ligeramente la aguja preparada en el paso 3.1. Después de asegurarse de que todo el timo está dentro del espacio subcapsular, utilice la aguja calentada para cauterizar la muesca.
5. Después de la cauterización, restaurar el riñón en la cavidad abdominal. Suturar el peritoneo y el músculo.
6. Con una sutura de colchón vertical interrumpida modificada, cierre la incisión de la piel (ate al menos tres nudos y corte cualquier exceso de hilo).
7. Con un hisopo de yodo povidona, desinfecte la incisión. Para aliviar el dolor, se realizó una inyección subcutánea de flunixina (2 g/g de peso corporal) durante la cirugía y luego durante 3 días después de la cirugía.
8. Hasta que esté completamente recuperado de la anestesia, mantenga el ratón caliente debajo de la lámpara infrarroja.
9. Conservar el timo en la cápsula renal del receptor durante 8 semanas antes de disepartir el timo trasplantado y realizar análisis fenotípicos como se describió anteriormente^5,8,9.

Resultados

Aquí mostramos el timo aislado E18.5 que contiene dos lóbulos completos (Figura1). Además, mostramos la aguja de la vena del cuero cabelludo que fue recortada para formar un bisel en el tubo de perfusión (Figura2). A continuación, también mostramos una imagen representativa de la posición del timo que se trasplantó en la cápsula renal (Figura3A)y el timo después de 8 semanas de crecimiento dentro de los ratones receptores ...

Discusión

El trasplante subcapsular renal del timo embrionario es un método importante para estudiar la función de las células epiteliales timmicas y el proceso de maduración de las células T in vivo. Aunque existen varios estudios experimentales sobre cultivo deórganos de timo embrionario y trasplante 6,⁷, nuestro protocolo proporciona un procedimiento alternativo simple sobre el cultivo del timo embrionario murino y subcapsular renal trasplante para tejido timo má...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Povidone iodine	Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd	20171113
0.9% Sodium Chloride Injection	Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd	2C17112101
1 mL Sterile syringe	Solarbio	YA1090
2’-Deoxyguanosine	MEC	HY-17563	1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM)
24 Well Plate	Corning Incorporated	Costar 3524
4-0 Surgical suture needles with thread	NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China	YY0166-2002
60mm Cell Culture Dish	Corning Incorporated	430166
70% ETOH	LIRCON	20181221
APC anti-mouse CD8a antibodies	Biolegend	100711	1:100
Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	JD1060	To sterilize before use
Cefmetazole Sodium for Injection	Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd	17062111 079	6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight
Dissecting scissors, JZ 10 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	JC2303	To sterilize before use
Fetal bovine serum (FBS?	GIBCO	10270-106
Fine forceps, JZ 10 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	JD1050	To sterilize before use
Flow cytometry	BD	FACSCanto II
Flunixin meglumine	MACLIN	F810147	1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight
Forceps, Dumont#5	World Precision Instruments	14098	To sterilize before use
Infrared lamp	OTLAN	MT-810
Needle holder, JZ 14 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	J32010	To sterilize before use
PE anti-mouse CD4	Biolegend	100511	1:100
Penicillin-Streptomycin mixture	GIBCO	15140122	1:100
Pentobarbital sodium salt	Sigma	P3761	1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight
RPMI1640 Medium	GIBCO	C14-11875-093
Scalp vein needle	Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd	XC001
Spring scissors	VANNAS	S11014-12	To sterilize before use
stereomicroscope	OLYMPUS	SZ61
Sterile 15cm cotton swab	Guangzhou Haozheng	20150014
Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P	Guangzhou Haozheng	20172640868
Sterile PBS (1x)	GENOM	GNM20012
Tissue forceps, JZ 12.5 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	J41010	To sterilize before use