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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier stellen wir mehrere einfache Methoden zur Beurteilung der Lebensfähigkeit und des Todes in 3D-Krebszellsphäroiden vor, die die physikalisch-chemischen Gradienten von In-vivo-Tumoren viel besser imitieren als die 2D-Kultur. Das Sphäroid-Modell ermöglicht daher die Bewertung der Wirksamkeit des Krebsmedikaments mit verbesserter Übersetzung in In-vivo-Bedingungen.

Zusammenfassung

Dreidimensionale Sphäroide von Krebszellen sind wichtige Werkzeuge sowohl für Krebsmedikamenten-Screens als auch für den Gewinn mechanistischer Einblicke in die Krebszellbiologie. Die Kraft dieses Präparats liegt in seiner Fähigkeit, viele Aspekte der In-vivo-Bedingungen von Tumoren zu imitieren, während es schnell, billig und vielseitig genug ist, um ein relativ hohes Durchsatzscreening zu ermöglichen. Die Sphäroid-Kulturbedingungen können die physikalisch-chemischen Gradienten in einem Tumor rekapitulieren, einschließlich der zunehmenden extrazellulären Säure, erhöhtem Laktat und abnehmender Glukose- und Sauerstoffverfügbarkeit, von der Sphäroid-Peripherie bis zu ihrem Kern. Auch die mechanischen Eigenschaften und Zell-Zell-Wechselwirkungen von In-vivo-Tumoren werden teilweise von diesem Modell nachgeahmt. Die spezifischen Eigenschaften und damit die optimalen Wachstumsbedingungen von 3D-Sphäroiden unterscheiden sich stark zwischen den verschiedenen Arten von Krebszellen. Darüber hinaus erfordert die Beurteilung der Zelllebensfähigkeit und des Todes in 3D-Sphäroiden Methoden, die sich zum Teil von denen unterscheiden, die für 2D-Kulturen verwendet werden. Hier beschreiben wir mehrere Protokolle zur Herstellung von 3D-Sphäroiden von Krebszellen und für die Verwendung solcher Kulturen zur Bewertung der Zelllebensfähigkeit und des Todes im Zusammenhang mit der Bewertung der Wirksamkeit von Krebsmedikamenten.

Einleitung

Die Verwendung von mehrzelligen Sphäroid-Modellen in der Krebsbiologie ist mehrere Jahrzehnte alt1,2, hat aber in den letzten Jahren erhebliche Dynamik gewonnen. Dies spiegelt zum großen Teil das erhöhte Bewusstsein dafür wider, wie stark der Phänotyp von Krebszellen von ihrer Mikroumgebung und spezifischen Wachstumsbedingungen abhängig ist. Die Mikroumgebung bei soliden Tumoren unterscheidet sich grundlegend von der in entsprechenden normalen Geweben. Dazu gehören physikalisch-chemische Bedingungen wie pH, Sauerstoffspannung, sowie interstitielle Druck, Konzentrationsgradienten von löslichen Faktoren wie Nährstoffe, Abfallprodukte, und sezernierte Signalverbindungen (Wachstumsfaktoren, Zytokine). Darüber hinaus umfasst es die Organisation der extrazellulären Matrix (ECM), Zell-Zell-Wechselwirkungen und interzelluläre Signalisierung, und andere Aspekte der jeweiligen dreidimensionalen (3D) Architektur des Tumors3,4, 5,6. Die spezifischen mikroökologischen Bedingungen, in denen Krebszellen existieren, beeinflussen ihr Genexpressionsprofil und ihre funktionellen Eigenschaften tiefgreifend, und es ist klar, dass der Phänotyp von 3D-Sphäroiden im Vergleich zu den in 2D angebauten Zellen viel stärker imitiert. die von In-vivo-Tumoren7,8,9,10,11. 2D-Modelle, selbst wenn sie Hypoxie, sauren pH-Wert und hohe Laktatkonzentrationen verwenden, um bekannte Aspekte der Tumormikroumgebung zu imitieren, erfassen immer noch nicht die Gradienten physikalisch-chemischer Parameter, die in Tumoren entstehen, sowie deren 3D-Tumor architektur. Auf der anderen Seite sind Tiermodelle kostspielig, langsam und ethisch problematisch und haben im Allgemeinen auch Mängel in ihrer Fähigkeit, menschliche Tumorbedingungen zu rekapitulieren. Folglich wurden 3D-Sphäroide als Zwischenkomplexitätsmodell in Studien zu einer Vielzahl von Eigenschaften der meisten soliden Krebsartenangewendet 9,11,12,13, 14,15,16,17.

Eine weit verbreitete Verwendung von 3D-Sphäroide ist in Screening-Assays der Anti-Krebs-Therapie Wirksamkeit9,18,19,20. Behandlungsreaktionen sind besonders empfindlich auf die Tumormikroumgebung und spiegeln sowohl die Auswirkungen der Tortuosität, die eingeschränkte Diffusion, den hohen interstitiellen Druck und den sauren Umwelt-pH-Wert auf die Arzneimittelabgabe als auch die Auswirkungen von Hypoxie und anderen Aspekte der Mikroumgebung auf der Zelltodreaktion9,17. Da die Umgebung innerhalb von 3D-Sphäroiden von Natur aus alle diese Eigenschaften entwickelt7,8,9,10,11, mit 3D-Zellkulturen können die Übersetzung der Ergebnisse in in vivo-Bedingungen erheblich zu verbessern, ermöglichen jedoch ein effizientes und erschwingliches Hochdurchsatz-Screening des Nettowachstums. Die große Mehrheit der Studien über die medikamentöse Reaktion von Krebszellen wird jedoch immer noch unter 2D-Bedingungen durchgeführt. Dies spiegelt wahrscheinlich wider, dass, während einige Assays relativ leicht für 3D-Zellkulturen implementiert werden können, viele, wie Lebensfähigkeits-Assays, Western-Blotting und Immunfluoreszenz-Analyse, viel bequemer in 2D als in 3D durchgeführt werden.

Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, leicht zugängliche Assays und präzise Protokolle für Analysen der Wirkung der Behandlung mit Krebsmedikamenten auf die Lebensfähigkeit und das Überleben von Krebszellen in einem 3D-Tumor zu liefern, der eine Nachahmung simmiert. Insbesondere bieten und vergleichen wir drei verschiedene Methoden zur Sphäroidbildung, gefolgt von Methoden zur qualitativen und quantitativen Analyse von Wachstum, Lebensfähigkeit und Arzneimittelreaktion.

Protokoll

1. Erzeugung von Sphäroiden

  1. Vorbereitung von Zellsuspensionen für die Sphäroidbildung
    HINWEIS:     Verschiedene Zelllinien haben sehr unterschiedliche Haftungseigenschaften und es muss jeweils das am besten geeignete Sphäroidbildungsprotokoll eingerichtet werden. Wir haben festgestellt, dass MCF-7 und BxPC-3 Zellen für die spontane Sphäroidbildung geeignet sind, während MDA-MB-231, SKBr-3, Panc-1 und MiaPaCa die Zugabe von rekonstituierten Kellermembranen erfordern, um erfolgreich Sphäroide zu bilden. Nur MDA-MB-231 und BxPC-3-Zellen wurden für das Hängende-Tropfen-Protokoll verwendet, aber andere Zelllinien sind sicherlich anwendbar.
    1. Wachsen Sie Zellen als Monolayer bis 70-80% Konfluenz.
    2. Waschzellen mit phosphatgepufferter Mittellinie (1x PBS, 5 ml für 25 cm2 oder 10 ml für einen 75 cm2 Kolben), das Zelldissoziationsenzym (0,5 ml für 25 cm2 oder 1 ml für einen 75 cm2 Kolben) hinzufügen und die Zellen für 2-5 min bei 37 °C inkubieren in 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit.
    3. Überprüfen Sie die Zellablösung unter dem Mikroskop und neutralisieren Sie das Zelldissoziationsenzym, indem Sie einem Gesamtvolumen von 5 ml in einem 25 cm2 oder 10 ml für einen 75 cm2 Kolben ein Wachstumsmedium (6-10% Serum je nach Zelllinie) hinzufügen.
    4. Verwenden Sie eine Bürker-Kammer, um Zellen zu zählen und 8 Quadrate in der Kammer pro Zellpräparat zu zählen, um eine hohe Reproduzierbarkeit der Größe der Sphäroide zu erhalten.
      HINWEIS: Im Folgenden werden jeweils drei Protokolle vorgestellt, die eine andere Methode zur Sphäroidbildung beschreiben. Protokoll 1.2 und 1.3 können für alle nachfolgenden Analyseprotokolle verwendet werden, während Protokoll 1.4 am besten zum Einbetten und Lysatieren von Zubereitungen geeignet ist. Je nach Zelllinie dauert die Sphäroidbildung 2-4 Tage, unabhängig von der verwendeten Methode.
  2. Spontane Sphäroidbildung
    1. Führen Sie die Schritte 1.1.1-1.1.4 aus.
    2. Verdünnen Sie die Zellsuspension in einem 15 ml-Rohr, um 0,5-2 x 104 Zellen/ml zu erhalten (für jede Zelllinie muss eine optimale Zelldichte bestimmt werden) (Abbildung 1A (ii)).
    3. Füllen Sie den äußeren Ring von Brunnen mit 1x PBS oder Wachstumsmedium, um die Verdunstung von den verbleibenden Brunnen zu reduzieren. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein steriles Reservoir und geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 200 l/well in ultraniedrige Befestigung96-gut runde Bodenplatten (Abbildung 1A (iii)).
    4. Inkubieren Sie die Platte in einem Inkubator bei37 °C mit 5% CO2, 95% Luftfeuchtigkeit.
    5. Alle 2-3 Tage erfassen sie lichtmikroskopische Bilder der Sphäroide.
      HINWEIS: Die Bilder in diesem Papier werden mit 11,5-facher Vergrößerung aufgenommen, was für die meisten Sphäroide geeignet ist, die mit diesen Protokollen hergestellt werden.
    6. Alle 2-3 Tage (nach dem Erfassen von Bildern) ersetzen Sie 100 l Medium (entfernen Sie 100 l des verbrauchten Mediums und ersetzen Sie durch 100 l frisches Medium.
      HINWEIS: Um das Entfernen von Sphäroiden beim Austausch von Medium zu vermeiden, ist es ratsam, die Platte ein wenig zu kippen, während langsam das Medium entfernt und das angesaugte Medium in den Spitzen auf sichtbare Sphäroide untersucht wird, bevor sie verworfen wird.
  3. Rekonstituierte Kellermembran-vermittelte Sphäroidbildung.
    HINWEIS:     Lactose Dehydrogenase Elevating Virus (LDEV)-freie reduzierte Wachstumsfaktor rekonstituierte Kellermembran (rBM) wurde verwendet. rBM ist temperaturempfindlich und sollte immer auf Eis gehalten werden, da es gerinnt, wenn es 15 °C erreicht. Die rBM entweder über Nacht bei 4 °C oder 2-4 h bei Raumtemperatur (RT) vor der Beschichtung auf Eis auftauen.
    1. Tauen rBM auf Eis (siehe Tabelle der Materialien).
    2. Platten und Reservoirs (falls einzeln verpackt) vor Gebrauch auf Eis aufbewahren.
    3. Führen Sie die Schritte 1.1.1-1.1.4 aus.
    4. Füllen Sie den äußeren Ring von Brunnen mit 1x PBS oder Wachstumsmedium, um die Verdunstung von den verbleibenden Brunnen zu reduzieren. Verdünnen Sie die Zellsuspension in einem 15 ml-Rohr, um 0,5-2 x 104 Zellen/ml zu erhalten (für jede Zelllinie muss eine optimale Zelldichte bestimmt werden) (Abbildung 1A (ii)).
    5. Legen Sie das 15 ml-Rohr mit der verdünnten Zellsuspension auf Eis (z. B. in Glasbecher) (Abbildung 1A (iia)).
    6. Die gekühlten Platten und Reservoirs auf die Haube übertragen. Kunststoffbehälter spülen, mit Eis füllen und in die Haube geben, damit die Platten und Reservoirs während des gesamten Vorgangs auf Eis gelegt werden können.
    7. Resuspend rBM sanft, um ein homogenes Gel zu gewährleisten.
    8. Fügen Sie 1-2% rBM (optimale Konzentration muss für jede Zelllinie bestimmt werden) zu den gekühlten Zellsuspensionen hinzu (Abbildung 1A (iib)).
    9. Invertieren Sie das 15 ml-Rohr, um das richtige Mischen von rBM und Zellsuspension zu gewährleisten, bevor die Suspension in die Platte gegeben wird.
    10. Übertragen Sie die rBM-haltige Zellsuspension in ein steriles Reservoir und geben Sie 200 l/well in gekühlte ultra-niedrige Befestigungsplatten 96-Well-Platten mit einer Mehrkanalpipette ab (Abbildung 1A (iii)).
      HINWEIS: Bei der Arbeit mit mehreren Zellsuspensionen (z. B. mehr als einer Zelllinie) ist es wichtig, jede Zellsuspension unmittelbar nach rBM-Zugabe zu verteilen, um eine vorzeitige Gelierung zu verhindern.
    11. Zentrifugieren Sie die Platte für 15 min bei 750 x g mit 'soft decent'/no braking (wenn möglich, Zentrifuge bei 4 °C, um die rBM-Flüssigkeit länger zu halten, aber keine Voraussetzung für eine erfolgreiche Sphäroidbildung), um sicherzustellen, dass die Zellen zusammengepfert werden, wenn die rBM verhärtet, was die Bildung eines einzigen Sphäroids erleichtert.
    12. Inkubieren Sie die Platte in einem Inkubator (37 °C, 5% CO2, 95% Luftfeuchtigkeit).
    13. Alle 2-3 Tage erhalten sie leichte mikroskopische Bilder zur Bewertung des Sphäroidwachstums.
    14. Alle 2-3 Tage 100 l Medium ersetzen (100 l entfernen und durch 100 l frisches Medium ersetzen).
  4. Hängende Tropfensphäroide.
    1. Führen Sie Schritt 1.1.1-1.1.4 aus.
    2. Verdünnung der Zellen, um eine geeignete Verdünnung zu erhalten. Eine praktische Verdünnung beträgt 50.000 Zellen/ml.
    3. Entfernen Sie den Deckel einer 10 cm2 Zellkulturschale und legen Sie ihn so aufwärts. Fügen Sie 6 ml 1x PBS in die Schale ein (Abbildung 1B (i)).
    4. Gießen Sie die Zellsuspension in ein steriles Reservoir und legen Sie mit einer Mehrkanalpipette (Abbildung1B (ii), was zu einer Konzentration von 2.000 Zellen/Tropfen führt, vorsichtig bis zu 30 Tropfen von 40 l Zellsuspension auf den Deckel der Zellkulturschale. Vermeiden Sie es, die Tropfen zu nah an den Rand des Deckels zu legen, da diese Tropfen eher Oberflächenspannung verlieren, wenn sie den Deckel im folgenden Schritt umkehren.
    5. Invertieren Sie den Deckel in einer schnellen, aber kontrollierten Bewegung und legen Sie ihn auf die 1x PBS-haltige Zellkulturschale (Abbildung 1B (iii)).
    6. Legen Sie die Schale in einen Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit, ohne die Tropfen zu stören und lassen Sie sie für 4-6 Tage wachsen.
    7. Wenn für Proteinlysate oder Einbettung verwendet werden soll, Pool Spheroide durch Entfernen des Deckels und kippen Sie ihn, um die Tropfen mit 1 ml beheiztem Medium zu waschen. Übertragen Sie das resultierende Medium, das Sphäroide enthält, auf ein 1,5 ml-Rohr und lassen Sie es sich an der Unterseite des Rohres absetzen. Gehen Sie wie in 4.4 bzw. 6.2.2 für Proteinlysate bzw. Einbettungen beschrieben vor.

2. Medikamentöse Behandlung von Sphäriden

HINWEIS: Langfristige medikamentöse Behandlung kann auf die Sphäroide angewendet werden, um auf Die Wirkung eines Medikaments von Interesse zu überprüfen. Vor Beginn der medikamentösen Behandlung ist es ratsam, ein Dosis-Reaktions-Experiment des Medikaments durchzuführen, um eine geeignete Dosis für die experimentelle Behandlung zu finden. Die Dosen sollten auf dem ermittelten IC50/Ki des Arzneimittels basieren und von etwa 0,2x-10x dieses Wertes reichen.

  1. Richten Sie 6-12 Sphäroide gemäß dem gewünschten Zustand ein, wie in 1.2 oder 1.3 beschrieben, und legen Sie sie 2 Tage lang im Inkubator (37 °C, 5%CO2, 95% Luftfeuchtigkeit) auf.
  2. Nehmen Sie am 2. Tag lichtmikroskopische Bilder der Sphäroide auf.
  3. Bereiten Sie die ersten Behandlungsdosen vor (nach dem Erfassen von Bildern).
    HINWEIS: Die erste Behandlungskonzentration muss doppelt so hoch sein wie die gewünschte Endkonzentration, da die Lösung nach Zugabe des 100-L-Mediums 1:2 verdünnt wird. Empfohlene Behandlungsintervalle für Medikamente (hängt von der Halbwertszeit des Arzneimittels ab): Tag 2, 4 und 7.
  4. Mit einer Mehrkanalpipette, entfernen Sie vorsichtig 100 l Medium und ersetzen Sie es durch 100 l Medikament enthaltendes Medium.
  5. Legen Sie die 96-Well-Platte wieder in den Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit und wiederholen Sie 2,3 und 2,4 an den gewählten Behandlungstagen, aber jetzt ohne die Dosis zu verdoppeln, um die richtige Enddosis zu erhalten.
  6. Am letzten Tag des Protokolls/Behandlungsplans können eine oder mehrere der folgenden Tests durchgeführt werden.

3. Zellviabilityntest für Sphäroide

  1. Richten Sie 4-6 Sphäroide nach dem gewünschten Zustand ein, wie in 1.2 oder 1.3 beschrieben, und legen Sie sie bei 37 °C bei 37 °C mit 5%CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit in den Inkubator.
    HINWEIS: In diesem Fall wurde der Zelllebensfähigkeitstest am Tag 7 oder 9 durchgeführt, nachdem das Sphäroidwachstum alle 2-3 Tage durch Lichtmikroskopie wie oben beschrieben überwacht wurde (Punkt 1.2.5 und 1.3.13).
  2. Tauen Sie das Lebensfähigkeits-Assay-Reagenz (siehe Materialtabelle) und lassen Sie es vor der Verwendung mit RT ausdemieren.
  3. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie sich umkehren, um eine homogene Lösung zu erhalten.
  4. Entfernen Sie vor der Durchführung des Assays 50 % des Kulturmediums aus den Sphäroiden (100 l).
  5. Fügen Sie jedem Bohrkörper ein Zelllebenswiederaufnahmereagenz in einem Verhältnis von 1:3 zu der im Brunnen vorhandenen Mediummenge hinzu (Abbildung 2A (i)) Für eine 96-Well-Platte 50 l Reagenz auf 100 l Medium hinzufügen.
  6. Mischen Sie den Inhalt kräftig für 5 min, um Zelllyse zu induzieren (Abbildung 2A (ii)).
  7. 25 min bei RT inkubieren, um das Leuchtsignal zu stabilisieren (Abbildung 2A (iii)).
  8. Zeichnen Sie das Leuchtsignal auf (Abbildung 2A (iv)).

4. Herstellung von Proteinlysaten für Western Blotting aus 3D Sphäroidkulturen

HINWEIS: Beim Sammeln der Sphäroide ist es ratsam, eine P200 Pipette zu verwenden und das Ende der Spitze zu schneiden, um eine größere Öffnung und damit eine einfachere Erfassung der Sphäroide zu ermöglichen, ohne ihre Struktur zu stören.

  1. Für jede Bedingung, Pool ein Minimum von 12, idealerweise 18-24 Sphäroide (abhängig von Sphäroidgröße) in einem 1,5 ml Rohr (vermeiden Sie 2 ml Rohre, da die nächsten Schritte werden schwieriger aufgrund ihrer weniger spitzen Boden).
    HINWEIS: Wenn die Menge des Mediums 1,5 ml übersteigt, bevor alle Sphäroide gesammelt wurden, lassen Sie die gesammelten Sphäroide am Boden absetzen (passiert sehr schnell, Zentrifugation nicht notwendig) und entsorgen Sie die Hälfte des Volumens des Rohres, bevor Sie die verbleibenden Sphäroiden.
  2. Rohre auf Eis legen und die Sphäroide am Boden des 1,5 ml-Rohres absetzen lassen.
  3. Wechseln Sie vom sterilen Zelllabor in das reguläre Labor.
  4. Sphäroide zweimal in 1 ml eiskaltem 1x PBS waschen. Lassen Sie Sphäroide sich absetzen, bevor Sie 1x PBS zwischen jedem Waschschritt entfernen.
  5. Aspirieren Sie so viel 1x PBS wie möglich, ohne die Sphäroide zu stören oder zu entfernen.
  6. Fügen Sie 5 l erhitzten Lysepuffer (LB) mit Phosphatase- und Proteaseinhibitoren pro Sphäroid hinzu (z. B. 10 Sphäroide = 50 l LB).
  7. Wiederholen Sie die Wirbelintervalle, gefolgt von einer Drehung, bis Sphäroide aufgelöst sind. Führen Sie einen Wirbelzyklus für 30 s durch, gefolgt von zentrifugieren (ein schnelles Spinnen mit einer Tischzentrifuge ist ausreichend) für 10 s für ca. 5-10 min je nach Größe und Kompaktheit der Sphäroide.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Halten Sie die Lysate bei -20 °C, bis sie mit der Beschallung, Homogenisierung und Proteinbestimmung wie in einem Standard-2D-Proteinlysatprotokoll fortfahren, gefolgt von Western Blotting mit Standardprotokollen.

5. Propidium Iodid (PI) Färbung von Sphäroiden

  1. Richten Sie 3-6 Sphäroide pro gewünschtem Zustand ein, wie in 1.2 oder 1.3 beschrieben, und legen Sie sie bei 37 °C bei 37 °C mit 5%CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit in den Inkubator.
  2. In einem sterilen Zellkulturlabor 1x PBS auf 37 °C erhitzen.
  3. Machen Sie eine PI-Lösung von 4 M durch Verdünnen der Lagerlösung in 1x PBS: Verdünnen Sie einen 1 mg/ml wässrigen Bestand an PI 1:350 in 1x PBS.
    HINWEIS: Diese Konzentration wird nach Zugabe der Lösung zu den Brunnen weiter halbiert, was eine Endkonzentration von 2 m ergibt. 100 l dieser Lösung werden für jeden Brunnen benötigt, der ein Sphäroid enthält.
    ACHTUNG: Propidiumiodid (PI) muss mit einer Dunstabzugshaube und Handschuhen behandelt werden. PI ist lichtempfindlich. Schützen Sie sich vor Licht bei der Handhabung.
  4. Entfernen Sie 100 l des Mediums aus jedem Brunnen in der 96-Well-Platte, ohne die Sphäroide zu entfernen.
  5. Waschen Sie das restliche Medium aus, indem Sie 100 l erhitzten 1x PBS zu allen Brunnen hinzufügen, gefolgt von der Entfernung von 100 l der Flüssigkeit in den Brunnen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt 3 Mal.
  6. Fügen Sie jedem Brunnen 100 l der PI-Lösung hinzu, bedecken Sie die Platte in Aluminiumfolie und legen Sie sie in einen Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit für 10-15 min.
  7. Wiederholen Sie die 3 in 4.5 beschriebenen Waschschritte, um die PI-Lösung auszuwaschen, um das Hintergrundsignal bei der Bildgebung zu verringern.
  8. Verwenden Sie ein Epifluoreszenzmikroskop, um die Sphäroide abzubilden. Um die Lebensfähigkeit von Zellen im Sphäroidkern zu bewerten, nehmen Sie Z-Stacks, um Bilder mit unterschiedlichen Tiefen des Sphäroids zu erhalten.
    HINWEIS: Je nach Sphäroidgröße ist eine Schrittgröße von etwa 18-35 m zwischen jeder Scheibe ratsam, was etwa 11-18 Stapel pro Sphäroid ergibt. Z-Stacks können in ImageJ mit der Z-Projektionsfunktion verarbeitet werden, die alle Z-Stacks zu einem fertigen Bild kombinieren kann, was einen Überblick über die Färbung im gesamten Sphäroid gibt (weitere Richtlinien zur Verwendung von ImageJ zu diesem Zweck finden Sie unter (https://imagej.net/Z-functions).

6. Einbetten von 3D-Sphäroiden

  1. Bereiten Sie das Agarose-Gel vor, in das die Sphäroide eingebettet sind (nur zum ersten Mal beim Ausführen des Protokolls erforderlich).
    1. 1 g Bactoagar in 50 ml ddH2O mischen.
    2. Im Mikrowellenherd langsam erhitzen, bis sich der Bactoagar aufgelöst hat und sich ein homogenes Gel gebildet hat. Lassen Sie das Gel nicht kochen.
    3. Den Bactoagar in einem Wasserbad bei 60 °C warm halten.
    4. Zwischen den Experimenten bei 4 °C aufbewahren.
  2. Einbettung von Sphäroiden.
    1. Am ersten Tag, für jede Bedingung, Pool ein Minimum von 12 Sphäroide in einem 1,5 ml Rohr.
    2. Einmal mit 1 ml eiskaltem 1x PBS waschen.
    3. Um die Sphäroide zu fixieren, fügen Sie 1 ml 4% Paraformaldehyd hinzu.
      HINWEIS: Die Handhabung von Paraformaldehyd sollte in einer Dunstabzugshaube erfolgen.
    4. Lassen Sie sie für 24 h bei RT brüten.
    5. Am 2. Tag erhitzen Sie das Agarose-Gel sorgfältig, indem Sie es in einen wassergefüllten Becher in einen Mikrowellenherd stellen. Stellen Sie sicher, dass das Gel nicht kocht! Warm halten in einer Tischheizungsplatte, bei 60 °C bis zum Gebrauch.
    6. Sphäroide zweimal mit 1 ml eiskaltem 1x PBS waschen.
    7. Aspirieren Sie die meisten der 1x PBS (lassen Sie an dieser Stelle ca. 100 l übrig, ist praktisch für den Umgang mit den Sphäroiden).
    8. Bereiten Sie eine 20-L-Pipette vor, indem Sie die Pipettenspitze an einer Steigung schneiden, um eine Spitze mit einem größeren Loch zu erhalten (siehe Abbildung).
      HINWEIS: Der nächste Teil muss schnell durchgeführt werden, um eine optimale Sphäroidübertragung zu gewährleisten und eine Erstarrung des Geltropfens zu vermeiden. Wenn kein Heizblock verfügbar ist, wird empfohlen, zuerst die Sphäroide zu fangen und dann die Agarose fallen zu lassen (d. h. die Reihenfolge der Punkte 6.2.9 und 6.2.10 zu wechseln).
    9. Machen Sie einen Agarose-Gel-Tropfen auf einem Mikroskop-Dia. Legen Sie die Rutsche auf einen warmen Heizblock, um eine Erstarrung der Agarose zu verhindern.
    10. Fangen Sie mit der modifizierten Pipettenspitze (siehe 6.2.8) so viele Sphäroide wie möglich in einem Volumen von 15-20 l.
    11. Injizieren Sie den 15-20 L Sphäroid-haltigen 1x PBS vorsichtig in die Mitte des Agarose-Geltropfens, ohne das Mikroskop-Dia zu berühren.
      HINWEIS: Das ist ein etwas schwieriger Punkt. Die Sphäroide gehen verloren, wenn die Pipettenspitze das Mikroskop-Dia berührt, wenn die Sphäroide in den Geltropfen injiziert werden. Es ist ratsam, den gesamten Prozess der Herstellung der Agarose Tropfen und Injektion der Sphäroide durch Injektion einer farbigen Flüssigkeit in den Tropfen zu üben. Dies ermöglicht die Visualisierung einer möglichen Penetration durch den Tropfen, da die farbige Flüssigkeit auf die Folie austritt.
    12. Lassen Sie das Agarose-Gel durch Inkubieren für 5-10 min bei RT oder bei 4 °C aushärten. Sobald sich der Geltropfen etwas verfestigt hat (aber immer noch ziemlich weich ist), schieben Sie den Geltropfen vorsichtig aus dem Mikroskop in eine Kunststoff-Gewebekassette mit einem Skalpell.
    13. Bedecken Sie die Kunststoff-Gewebekassetten mit 70% Ethanol.
      HINWEIS: An dieser Stelle können die Sphäroide direkt verwendet oder monatelang gelagert werden.
    14. Einbetten Sie das agarose-eingebettete Sphäroid in Paraffin, abschnittin 2-3 m dicke Schichtrutschen und färben Sie mit Hämatoxylin und Eosin oder unterliegen sie einer immunhistologischen Färbung.

Ergebnisse

Sphäroide Wachstumsassays auf Basis des sphäroiden Bildungsprotokolls, das in Abbildung 1A und Abbildung 1Bschematisch dargestellt ist, wurden als Ausgangspunkt für die Analyse der Auswirkungen von Anti-Krebs-Medikamentenbehandlungen in einem 3D-Tumor verwendet. Imitieren Einstellung. Die Leichtigkeit, mit der Sphäroide gebildet werden, ist Zelllinienspezifisch, und einige Zelllinien erfordern eine Supplementierung mit rBM, ...

Diskussion

Die Verwendung von 3D-Krebszellsphäroiden hat sich als wertvolles und vielseitiges Werkzeug nicht nur für das Screening von Krebsmedikamenten erwiesen, sondern auch für den Gewinn mechanistischer Einblicke in die Regulierung des Krebszellsterbens und der Lebensfähigkeit unter Bedingungen, die diejenigen im Tumor imitieren. Mikroumgebung. Dies ist besonders wichtig, da die Zugänglichkeit, zelluläre Aufnahme und intrazelluläre Wirkung von Chemotherapeutika durch die physikalisch-chemischen Bedingungen im Tumor, eins...

Offenlegungen

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

Wir danken Katrine Franklin Mark und Annette Bartels für die hervorragende technische Unterstützung und Asbjarn N'hr-Nielsen für die Durchführung der Experimente in Figur 1D. Diese Arbeit wurde von der Einar Willumsen Foundation, der Novo Nordisk Foundation und der Fondation Juchum (alle an SFP) finanziert.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI)Invitrogen# C10595 For staining nuclei
5-Fluorouracil (5-FU)Sigma-Aldrich#F6627Component in chemotherapeutic treatment
5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA)Life Technologies#E3111Inhibitor of NHE1
Antibody against PARP and cPARPCell signaling#9542Used in western blotting
Antibody against Ki-67Cell signaling#9449Used for IHC
Antibody against p53Cell Signaling #2524 Used for IHC
Antibody against β-actinSigma A5441Used in western blotting
BactoagarBD Bioscience#214010Used for agarose gel preparation
Benchmark protein ladderInvitrogen#10747-012Used for SDS-PAGE
Bio-Rad DC Protein Assay kitBio-Rad Laboratories#500-0113, #500-0114, #500-0115  Used for protein determination from lysates
Bürker chamberMarienfeld610311For cell counting 
BX63 epifluoresence microscopeOlympusUsed for fluorescent imaging
CellTiter-Glo 3D Cell Viability AssayPromega#G9681Used for the cell viability assay
CisplatinSigma-Aldrich#P4394 Component in chemotherapeutic treatment
Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom,  Ultra-low attachment, With lid, SterileCorning#4520Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point
Corning 96 well, clear round bottom,  Ultra-low attachment microplate, With lid, SterileCorning#7007Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point
Criterion TGX Precast GelsBio-Rad5671025Used for SDS-PAGE
DoxorubicinAbcam#120629Component in chemotherapeutic treatment
FLUOStar Optima Microplate readerBMG LabtechUsed for recording luminescence 
Formaldehyde VWR Chemicals #9713.1000 Used for cell fixation
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane MatrixGibco#A1413202Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol.
Heat-inactivated FBSSigma#F9665Serum for growth media
ImageJNIHScientific Image analysis
Medim Uni-safe casetteMedim Histotechnologie10-0114Used for storage of embedded spheroids
Mini protease inhibitor cocktail tabletsRoche Diagnostics GmBH # 11836153001Used for lysis buffer preparation
MZ16 microscopeLeicaUsed for light microscopic images
NuPAGE LDS 4x Sample Buffer Invitrogen#NP0007Used for western blotting
Pierce ECL Western blotting substrateThermo scientific#32106Used for western blotting
Ponceau SSigma-Aldrich#P7170-1LUsed for protein band staining
Prism 6.0GraphpadScientific graphing and statistical software
Propidium iodide (1mg/ml solution in water)Invitrogen P3566Light sensitive 
Sterile reservoirs, multichannelSPL lifesciences21002Used for seeding cells for spheroid formation
Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide Menzel-Gläser#J3800AMNZMicroscope glass slide used for embedding
TamoxifenSigma-Aldrich#T5648Used as chemotherapeutic treatment
Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranesBio-Rad#170-4159Used for western blotting
Tris/Glycine/SDS running buffer Bio-Rad #161 0732Used for SDS-PAGE
Trypsin-EDTA solutionSigma#T4174 Cell dissociation enzyme

Referenzen

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