Expresión, purificación, cristalización y ensayos enzimáticos de proteínas que contienen el dominio de la hidrolasa fumarilacetoacetato

Las proteínas que contienen el dominio de Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) (FAHD) son miembros identificados de la superfamilia FAH en eucariotas. Las enzimas de esta superfamilia generalmente muestran multifuncionalidad, involucrando principalmente mecanismos de hidrolasa y decarboxilasa. Este artículo presenta una serie de métodos consecutivos para la expresión y purificación de proteínas FAHD, principalmente ortologos de proteína FAHD 1 (FAHD1) entre especies (humanos, ratón, nematodos, plantas, etc.). Los métodos cubiertos son la expresión de proteínas en E.coli, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, filtración de gel preparativo y analítico, cristalización, difracción de rayos X y ensayos fotométricos. Proteína concentrada de altos niveles de pureza (>98%) pueden emplearse para la cristalización o la producción de anticuerpos. Las proteínas de calidad similar o inferior pueden emplearse en ensayos enzimáticos o utilizarse como antígenos en sistemas de detección (Western-Blot, ELISA). En la discusión de este trabajo, los mecanismos enzimáticos identificados de FAHD1 se describen para describir su bifuncionalidad hidrolasa y decarboxilasa con más detalle.