Double imagerie de bioluminescence de la progression tumorale et de l'angiogenèse

Résumé

Ce protocole décrit l'établissement d'un modèle de souris tumeur-portant pour surveiller la progression de tumeur et l'angiogenèse en temps réel par la formation image double de bioluminescence.

Résumé

L'angiogenèse, comme un processus crucial de progression tumorale, est devenue un point chaud de recherche et la cible de la thérapie anti-tumorale. Cependant, il n'y a aucun modèle fiable pour tracer la progression et l'angiogenèse de tumeur simultanément d'une manière visuelle et sensible. L'imagerie par bioluminescence montre sa supériorité unique dans l'imagerie vivante en raison de ses avantages de sensibilité élevée, de forte spécificité et de mesure précise. Présenté ici est un protocole pour établir un modèle de souris tumeur-portant en injectant une renilla luciferase-étiquetée ligne de cellules de cancer du sein de monourine 4T1 dans la souris transgénique avec l'expression de luciferase de Firefly angiogenèse-induite. Ce modèle de souris fournit un outil valable pour surveiller simultanément la progression de tumeur et l'angiogenèse en temps réel par la double imagerie de bioluminescence dans une souris simple. Ce modèle peut être largement appliqué dans le criblage de drogue antitumoral et la recherche d'oncologie.

Introduction

L'angiogenèse est un processus essentiel dans la progression du cancer de petits néoplasmes localisés à de plus grandes tumeurs potentiellement métastatiques^1,2. La corrélation entre la croissance tumorale et l'angiogenèse devient l'un des points d'emphase dans le domaine de la recherche en oncologie. Cependant, les méthodes traditionnelles de mesure des changements morphologiques ne parviennent pas à surveiller la progression de tumeur et l'angiogenèse simultanément chez les animaux vivants en utilisant une approche visualisée.

L'imagerie de bioluminescence (BLI) des cellules de tumeur est une méthode expérimentale particulièrement appropriée pour surveiller la croissance de tumeur en raison de sa non-invasiveness, sensibilité, et spécificité^3,4,5^,6 . La technologie BLI est basée sur le principe que la luciferase peut catalyser l'oxydation d'un substrat spécifique tout en émettant la bioluminescence. La luciférase exprimée dans les cellules tumorales implantées réagit avec le substrat injecté, qui peut être détecté par un système d'imagerie vivant, et les signaux reflètent indirectement les changements dans le nombre de cellules ou la localisation cellulaire in vivo^6,7.

À l'exception de la croissance tumorale, l'angiogenèse tumorale (l'étape critique de la progression du cancer) peut également être visualisée par la technologie BLI à l'aide de souris transgéniques Vegfr2-Fluc-KI^8,9,10. Le facteur de croissance endothéliale vasculaire (Vegf) récepteur 2 (Vegfr2), un type de récepteur Vegf, est principalement exprimé dans les cellules endothéliales vasculaires des souris adultes¹¹. Chez les souris transgéniques Vegfr2-Fluc-KI, la séquence d'ADN de la luciferase Firefly (Fluc) est frappée dans le premier exon de la séquence endogène Vegfr2. En conséquence, le Fluc est exprimé (qui apparaît sous forme de signaux BLI) d'une manière identique au niveau d'angiogenèse chez la souris. Pour se développer au-delà de quelques millimètres de taille, la tumeur recrute de nouvelles vascularisations à partir de vaisseaux sanguins existants, qui expriment fortement le Vegfr2 déclenché par des facteurs de croissance des cellules tumorales¹. Ceci ouvre la possibilité d'utiliser des souris transgéniques vegfr2-Fluc-KI pour surveiller non-invasivement l'angiogenèse de tumeur par BLI.

Dans ce protocole, un modèle de souris tumeur-portant est établi pour surveiller la progression de tumeur et l'angiogenèse dans une souris simple par le luciferase de Luciferase de Feu (Fluc) et la luciferase de Renilla (Rluc) image, respectivement (figure 1). Une lignée cellulaire 4T1 (4T1-RR) est créée qui exprime de façon stable le Rluc et la protéine fluorescente rouge (RP) pour retracer la croissance cellulaire par imagerie Rluc. Pour étudier plus avant les changements dynamiques de l'angiogenèse dans la progression et la régression de la tumeur, une autre lignée cellulaire 4T1 (4T1-RRT) est créée qui exprime le virus de l'herpès simplex de gène de suicide tronqué thymidine kinase (HSV-ttk), Rluc, et RFP. Par administration de ganciclovir (GCV), les cellules exprimant hSV-ttk sont sélectivement ablated. Basé sur ces lignées cellulaires, un modèle tumoral-portant dans les souris de Vegfr2-Fluc-KI est construit qui sert de modèle expérimental reliant la progression de tumeur et l'angiogenèse de tumeur in vivo.

Protocole

Les expériences doivent être conformes aux réglementations nationales et institutionnelles concernant l'utilisation des animaux à des fins de recherche. Les autorisations pour réaliser des expériences doivent être obtenues. Le traitement des animaux et les procédures expérimentales de l'étude adhèrent aux lignes directrices du Comité des soins et de l'utilisation des animaux de l'Université de Nankai qui sont conformes aux Lignes directrices pour les soins aux animaux approuvées par les National Institutes of Health (NIH).

1. LV-Rluc-RFP (RR) et LV-Rluc-RFP-HSV-ttk (RRT) emballage et production lentivirale

REMARQUE : Le pLV-RR porte les séquences génétiques de renilla luciferase (Rluc) et de protéine fluorescente rouge (RFP) sous le promoteur EF1MD, tandis que le pLV-RRT porte les séquences génétiques codant Rluc, RFP, et le virus de l'herpès simplex tronqué thymidine kinase (HSV-ttk) ( Figure 2).

1. Seed 1 x 10⁶ de 293T cellules par puits dans une plaque de 6 puits et la culture pendant la nuit dans un incubateur humidifié avec 5% CO₂ à 37 oC avec le milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS).
2. Préparer la suspension liposome : mélanger 7,5 ll de liposome et 0,25 ml de milieu essentiel minimal (MEM) dans un tube de 1,5 ml après l'incubation pendant 5 min à température ambiante (RT) pour disperser les liposomes également.
3. Préparer la solution DesNAs (DNAs-RR) : séparément, ajouter le vecteur pLV-RR et les plasmides d'aide à 0,25 ml de MEM dans un tube de 1,5 ml tel que décrit dans le tableau 1.
4. Obtenir le composé liposome/DNAs-RR : ajoutez doucement la solution DNAs-RR dans la suspension liposome préparée goutte à goutte et incubez pendant 20 min à RT ainsi les liaisons d'ADN à la membrane lipidique.
5. Remplacer le milieu des cellules 293T par 1 ml de DMEM contenant 10% de FBS et ajouter le composé liposome/DNAs-RR au milieu des cellules 293T doucement.
6. Après avoir couve dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂ à 37 oC pendant 12 à 16 h, remplacez le composé liposome/DNAs-RR contenant le milieu des cellules 293T par 1 mL de DMEM contenant 10 % de FBS et 100 u/mL de pénicilline-streptomycine.
7. Continuer à cultiver les cellules 293T dans l'incubateur humidifié pendant 48 h après la transfection. Ensuite, recueillir le supernatant des cellules 293T et centrifuger le milieu à 300 x g pendant 5 min pour granuler les cellules 293T. Transférer le supernatant contenant du lentivirus-RR (LV-RR) dans des tubes de stockage stériles de 1,5 ml de polypropylène et entreposer à -80 oC.
   REMARQUE : Une installation de niveau de biosécurité 2 (BSL-2) est nécessaire pour travailler avec le lentivirus recombinant.
8. Répétez les étapes 1.1-1.7 et utilisez le vecteur pLV-RRT au lieu du vecteur pLV-RR à l'étape 1.3 pour obtenir le lentivirus-RRT (LV-RRT). Entreposer le LV-RRT à -80 oC.
   REMARQUE : Le stock lentiviral non purifié peut inhiber la croissance cellulaire dans certains cas. Le stock lentiviral peut avoir besoin d'être purifié. Les stocks de lentiviraux contenant des particules LV-RR ou LV-RRT doivent être divisés en tubes de 1,5 ml (1 ml par tube) pour le stockage afin d'éviter de multiples cycles de dégel libre.

2. Transduction lentivirale LV-RR et LV-RRT pour l'expression génique dans les cellules 4T1

1. Seed 4T1 cellules dans une plaque de 6 puits (5 x 10⁵ cellules / puits) et la culture avec Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 milieu contenant 10% FBS nuit dans un incubateur humidifié avec 5% CO₂ à 37 oC.
2. Retirez le milieu de la plaque de culture et remplacez-le par un RPMI 1640 moyen frais de 1 ml ainsi que 1 ml de bouillon lentiviral (LV-RR ou LV-RRT) à chaque puits. Ajouter 8 polybrenes g/mL et mélanger délicatement le milieu contenant des particules lentivirales en faisant monter et descendre.
   REMARQUE : Sachez que le milieu contient des particules lentivirales, qui pourraient transduire les cellules humaines.
3. Solution de transduction de spin dans une centrifugeuse à 1 000 g pour 60 min à RT pour aider à augmenter l'efficacité de la transduction. Après centrifugation, la culture des cellules 4T1 pendant 4 à 12 h et la maintenance dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂ à 37 oC.
   REMARQUE : Pour certaines lignées cellulaires, le polybrene peut être toxique pour la culture à long terme. Par conséquent, le temps d'incubation pour transduire différentes cellules peut être modifiable. Vérifiez l'état de la cellule plusieurs fois pour trouver le temps d'incubation approprié.
4. Rafraîchissez le milieu des cellules 4T1 transducées avec 2 mL de rpMI 1640 milieu contenant 10% FBS et 100 U/mL pénicilline-streptomycine pour enlever les particules lentivirales et le polybrene.

3. Dépistage et identification des cellules 4T1 transduiseurs 4T1 par drogue

1. Sélectionnez les cellules cédées avec le moyen contenant le blasticidin (BSD) selon le gène de résistance BSD porté par LV-RR ou LV-RRT comme étapes suivantes décrites.
   REMARQUE : Alternativement, les cellules transductées qui sont RFP-positives pourraient être choisies par cytométrie de flux selon le gène de RP porté par LV-RR ou LV-RRT.
2. 48 h après transduction, passage des cellules 4T1 au rapport de 1:3 à 1:4 avec le milieu de sélection (RPMI 1640 milieu contenant 10% FBS, 100 U/mL pénicilline-streptomycine, et 5 'g/mL BSD). Changer de moyen tous les 2 ou 3 jours.
   REMARQUE : La concentration optimale de BSD peut varier d'une lignée cellulaire à l'autre. Par conséquent, une expérience pilote de la courbe de mise à mort devrait être effectuée pour déterminer la concentration optimale de BSD avant l'expérience initiale.
3. 7 jours de dépistage post-drogue, observez les cellules 4T1 transducées LV-RR (4T1-RR) et les cellules 4T1 transduisantes lvà-RRT (4T1-RRT) sous le microscope à contraste de phase inversé de fluorescence. Comptez le nombre de cellules DeP 4T1 et de toutes les cellules 4T1 dans trois champs de vision pour estimer le rapport RFP-positif, respectivement (figure 2).
   REMARQUE : Alternativement, le rapport RP-positif des cellules 4T1 transducées pourrait être identifié par cytométrie d'écoulement.
4. Mesurer les signaux renilla des cellules 4T1-RR et 4T1-RRT en utilisant un système d'imagerie vivante pour détecter la relation linéaire entre les nombres cellulaires et les signaux de renilla (figure 3).
5. Élargir les cellules 4T1-RR et 4T1-RRT d'alendur le BSD avec un milieu de sélection à des rapports fractionnés entre 1:3 et 1:4 et entreposez les stocks de lignée cellulaire dans de l'azote liquide.

4. Souris Vegfr2-Fluc-KI et modèle de souris tumeur-portant

REMARQUE : Les souris transgéniques Vegfr2-Fluc-KI, âgées de 6 à 8 semaines et femelles, sont utilisées dans cette expérience pour surveiller l'angiogenèse in vivo non invasive par BLI.

1. Culture 4T1-RR cellules et 4T1-RRT cellules dans des plats Petri 60 mm dans un incubateur humidifié avec 5% co₂ à 37 oC, respectivement. Lorsque les cellules sont à 80% de confluence, retirer le milieu et rincer avec du phosphate tamponné saline (PBS).
2. Retirez le PBS et ajoutez 2 ml supplémentaires de 0,25 % trypsine-0,53 mM edTA solution respectivement. Conserver le plat à RT (ou à 37 oC) jusqu'à ce que les cellules se détachent.
3. Ajouter 5 à 10 ml de milieu frais contenant 10 % de FBS, puis aspirer et distribuer des cellules pour resuspendre les cellules 4T1-RR et 4T1-RRT dans des tubes centrifugeurs de 15 ml, respectivement. Comptez deux types de cellules 4T1 à l'aide d'une chambre de comptage et préparez les suspensions cellulaires à une concentration de 1 x 10⁶ pour 100 L dans le milieu RPMI 1640.
4. Anesthésiez les souris Vegfr2-Fluc-KI avec 1% à 3% d'isoflurane en oxygène à 100% à la chambre d'induction d'anesthésie avec un débit de 1 L/min. Surveillez la réponse de pincement des orteils de la souris pour confirmer l'état de l'anesthésie. Ensuite, appliquez l'onudation ophtalmique sur les yeux de la souris pour prévenir la déshydratation.
5. Retirer la souris de la chambre et la placer dans le cône de nez. Enlevez entièrement les cheveux de l'épaule de la souris en utilisant le shaver électrique et la crème d'épilation, qui pourrait fournir une bonne vue du champ chirurgical et éviter de bloquer les signaux BLI dans les expériences de suivi.
6. Injecter sous-cutanée les cellules 4T1-RR (1 x 10⁶ cellules à un volume total de 100 l) et les cellules 4T1-RRT (1 x 10⁶ cellules à un volume total de 100 l) dans les épaules gauches et droites de chaque souris, respectivement (enregistrement comme jour 0). Placez les souris dans la zone de récupération avec un support thermique jusqu'à ce qu'elles soient complètement récupérées.
7. Après l'implantation des cellules 4T1-RR et 4T1-RRT, touchez les masses tumorales pour vérifier que les souris portent une tumeur tous les jours (Figure S1). Au jour 7 post-implantation, l'intrapéritoronnel injecte 50 mg/kg de ganciclovir (GCV) aux souris porteuses de tumeurs deux fois par jour jusqu'à la fin de l'expérience.
   REMARQUE : Avant cette expérience, le cytotoxique de GCV sur les cellules 4T1-RRT doit être détecté. L'efficacité de mise à mort de GCV pourrait être évaluée par l'évaluation de comptage cellulaire avec une concentration différente de GCV (Figure S2).
8. Le jour 0, 3, 7, 14 et 21 après l'implantation 4T1, surveillez la croissance tumorale et l'angiogenèse des souris porteuses de tumeurs et évaluez par l'imagerie de Rluc et de Fluc (figure4).

5. Imagerie double bioluminescence de la tumeur (Rluc) et de l'angiogenèse (Fluc)

1. Ouvrez le système d'imagerie vivante, initialisez le logiciel d'imagerie vivante, puis initialisez le système.
   REMARQUE : L'initialisation du système prendra quelques minutes pour refroidir la caméra couplée à la charge (CCD) à -90 oC avant de pouvoir commencer l'imagerie. La température deviendra verte lorsque la caméra CCD sera refroidie.
2. Utilisez les paramètres de la caméra suivants :
   Vérifiez la Luminescence et la Photographie.
   Vérifiez la pose.
   Paramètres de luminescence:
   Temps d'exposition définit AUTO dans des conditions normales.
   Binning ensembles 8.
   F/Stop s'installe à 1.
   Filtre d'émission ouvre.
   Paramètres de la photographie:
   Binning ensembles à moyen.
   F/Stop s'installe 8.
   Paramètres du système IVIS :
   Champ de vision : vue de souris C-1, vue de souris D-5.
   La hauteur du sujet fixe 1,5 cm.
3. Peser et enregistrer les souris et calculer le volume de coelenterazine (CTZ; 2,5 mg/kg) et De-luciferin (150 mg/kg) nécessaire.
4. Anesthésiez la souris tumorale de 1% à 3% d'isoflurane dans 100% d'oxygène à la chambre d'induction d'anesthésie avec un débit de 1 L/min. Surveillez la réponse de pincement d'orteil de la souris pour confirmer l'état de l'anesthésie. Ensuite, distribuez une goutte d'onduleur lubrifiant sur les deux yeux pour éviter les dommages cornéens.
5. Injecter 2,5 mg de CTZ (3,33 mg/mL) par kilogramme de poids corporel dans le rétrobulbar de la souris (p. ex., pour une souris de 20 g, injecter 15 oL pour délivrer 50 g de CTZ) à l'aide d'une aiguille à seringue sinistique.
6. Déplacez la souris porteuse de tumeurs dans la chambre de la caméra avec son nez dans le cône d'anesthésie doucement et acquérir plusieurs photos de la souris dorsal immédiatement pour obtenir les signaux Rluc de cellules 4T1 jusqu'à ce que les signaux BLI s'estompent.
   REMARQUE: La demi-vie de CTZ est très courte et les signaux de Rluc chutent précipitamment de 30 s. Pour s'assurer que tout signal résiduel de Rluc s'est dissipé et que l'intervalle entre l'imagerie Rluc et Fluc devrait être supérieur à 10 min.
7. Injecter par voie intrapéritone 150 mg/kg de D-luciferin (30 mg/mL) à l'aide d'une aiguille à seringues à insuline (p. ex., pour une souris de 20 g, injectez 100 l pour délivrer 3 mg de D-luciferin). Gardez la souris à RT pendant 10 minutes avant l'imagerie Fluc.
8. Déplacez cette souris dans la chambre de caméra avec son nez dans le cône d'anesthésie à nouveau et acquérir plusieurs photos de la souris dorsal pour obtenir les signaux Fluc de l'angiogenèse.
   REMARQUE : Le moniteur cinétique Fluc doit être effectué pour chaque souris jusqu'à ce que les signaux atteignent le maximum, puis s'estompent.
9. Répétez les étapes des procédures 5.4-5.8 pour chaque souris.
10. Après l'imagerie, maintenir les souris dans un environnement chaud jusqu'à ce que les animaux se réveillent.
11. Au moment désiré (jour 3, 7, 14 et 21), répétez au-dessus des procédures (étape 5.3-5.10) pour détecter la progression de tumeur et l'angiogenèse de tumeur au fil du temps.
12. Analyser les données de signaux De Rluc et Fluc pour étudier la relation entre la croissance tumorale et l'angiogenèse dans la progression de tumeur.
    REMARQUE : Les régions d'intérêt (ROI) qui couvrent le site de signal BLI sont utilisées pour analyser les données. Mesurer l'éclat total (Photons) du retour sur investissement dans l'unité de Photons/secondes/cm²/steradian (p/s/cm 2/sr) pour chaque point de temps.
13. Analyser les signaux Rluc et Fluc du retour sur investissement à l'aide d'un logiciel graphique (Figure 4).

Résultats

Dans cette expérience, un modèle de souris de cancer du sein a été établi utilisant des cellules 4T1 pour étudier la relation entre la croissance de tumeur et l'angiogenèse de tumeur (figure 1). Tout d'abord, deux lentivirus ont été emballés, qui portaient des séquences génétiques exprimant Rluc/RFP (LV-RR) et Rluc/RFP/HSV-ttk (LV-RRT), respectivement, comme indiqué précédemment⁷. Ensuite, deux lignées cellulaires 4T1 ...

Discussion

Dans ce protocole, une approche double BLI non-invasive est décrite pour surveiller le développement de tumeur et l'angiogenèse. Le système de journaliste BLI est d'abord développé, contenant le gène de suicide DeSV-ttk/GCV pour suivre la progression et la régression de tumeur in vivo par l'imagerie de Rluc. Pendant ce temps, l'angiogenèse tumorale est évaluée à l'aide de souris Vegfr2-Fluc-KI via l'imagerie Fluc. Ce modèle de souris tumeur-portant est capable de fournir une plate-forme pratique pour le dév...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA	Gibco	25200072
1.5 mL Tubes	Axygen Scientific	MCT-105-C-S
15 mL Tubes	Corning Glass Works	601052-50
293T	ATCC	CRL-3216
4T1	ATCC	CRL-2539
60 mm Dish	Corning Glass Works	430166
6-well Plate	Corning Glass Works	3516
Biosafety Cabinet	Shanghai Lishen Scientific	Hfsafe-900LC
Blasticidine S Hydrochloride (BSD)	Sigma-Aldrich	15205
Cell Counting Kit-8	MedChem Express	HY-K0301
CO2 Tegulated Incubator	Thermo Fisher Scientific	4111
Coelenterazine (CTZ)	NanoLight Technology	479474
D-luciferin Potassium Salt	Caliper Life Sciences	119222
DMEM Medium	Gibco	C11995500BT
Fetal Bovine Serum (FBS)	BIOIND	04-001-1A
Fluorescence Microscope	Nikon	Ti-E/U/S
Ganciclovir (GCV)	Sigma-Aldrich	Y0001129
Graphics Software	GraphPad Software	Graphpad Prism 6
Insulin Syringe Needles	Becton Dickinson	328421
Isoflurane	Baxter	691477H
Lentiviral Packaging System	Biosettia	cDNA-pLV03
Liposome	Invitrogen	11668019
Living Imaging Software	Caliper Life Sciences	Living Imaging Software 4.2
Living Imaging System	Caliper Life Sciences	IVIS Lumina II
MEM Medium	Invitrogen	31985-070
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning Glass Works	R21031399
Polybrene	Sigma-Aldrich	H9268-1G
RPMI1640 Medium	Gibco	C11875500BT
SORVALL ST 16R Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	Thermo Sorvall ST 16 ST16R
Ultra-low Temperature Refrigerator	Haier	DW-86L338
XGI-8 Gas Anesthesia System	XENOGEN Corporation	7293