تنقية بروتين كتلة جزيئية عالية في موتان العقدية

Summary

وصف هنا هو طريقة بسيطة لتنقية منتج الجينات في موتان العقدية. قد تكون هذه التقنية مفيدة في تنقية البروتينات، وخاصة بروتينات الغشاء والبروتينات الكتلية الجزيئية العالية، ويمكن استخدامها مع مختلف الأنواع البكتيرية الأخرى.

Abstract

وينطوي توضيح وظيفة الجين عادة على مقارنة الصفات الفينوتية للسلالات والسلالات البرية التي تعطل فيها جين الفائدة. يتم استعادة فقدان الوظيفة بعد انقطاع الجينات في وقت لاحق عن طريق إضافة خارجية للمنتج من الجين المعطلة. وهذا يساعد على تحديد وظيفة الجين. وتنطوي الطريقة التي سبق وصفها على توليد سلالة موتان العقدية التي تعطلت في الجينات gt. هنا، يتم وصف طريقة لا تتطلب لتنقية المنتج الجيني gtfC من سلالة S. mutans التي تم إنشاؤها حديثا بعد اضطراب الجينات. هو يتضمّن الإضافة من [بولهيستيدين-كدينغ] تسلسل في ال 3′ نهاية من المورثة الفائدة, أيّ يسمح تنقية بسيطة من المورّة منتوج يستعمل محصّلة معدنة تقارب كروماتوغرافيا. لا توجد ردود فعل أنزيمية غير PCR مطلوبة للتعديل الجيني في هذه الطريقة. واستعادة المنتج الجيني عن طريق إضافة خارجية بعد تعطيل الجينات هي طريقة فعالة لتحديد وظيفة الجينات، والتي يمكن أيضا تكييفها مع الأنواع المختلفة.

Introduction

وعادة ما ينطوي تحليل وظيفة الجين على مقارنة الصفات الفينوتية للسلالات البرية بالسلالات التي تعطل فيها جين الفائدة. وبمجرد إنتاج السلالة التي تعطلت الجينات، فإن الإضافة الخارجية للمنتج الجيني تسمح باستعادة وظيفية.

الطريقة الأكثر شيوعا للحصول على منتجات الجينات النقية اللازمة لتجارب الترميم اللاحقة هي عن طريق أداء التعبير غير المتجانس في الإشريكية القولونية¹. ومع ذلك، فإن التعبير عن بروتينات الغشاء أو البروتينات الكتلية العالية غالبا ما يكون من الصعب استخدام هذا النظام¹. في هذه الحالات، عادة ما يتم عزل البروتين المستهدف من الخلايا التي تجمع البروتين أصلا من خلال سلسلة معقدة من الخطوات، والتي قد تؤدي إلى فقدان المنتج الجيني. للتغلب على هذه القضايا، تم تطوير إجراء بسيط لتنقية المنتجات الجينية بعد طريقة تعطيل الجينات^2،طريقة ربط الحمض النووي المستندة إلى PCR³ (المعينة ثنائي ونفي من خطوتين PCR)، والكهرباء للجينات التحول في موتات العقدية. إضافة علامة polyhistidine (له العلامة) إلى C-terminus من المنتج الجيني يسهل تنقية من قبل الكروماتوغرافيا المعدنية تقارب المعطلة (IMAC).

لعزل سلالة التعبير عن علاماته، يتم استبدال الحمض النووي الجينومي الكامل للجين موضع الاهتمام (في هذه السلالة التي تعبر عن الجينات التي تم التعبير عنها) بجين علامة مقاوم للمضادات الحيوية. إجراء لتوليد سلالة له العلامة التعبير عن متطابقة تقريبا لتلك التي لتوليد سلالة الجينات تعطل كما هو موضح سابقا^4,5. ولذلك، ينبغي تنفيذ أساليب تعطيل الجينات وعزل المنتجات الجينية كتجارب متسلسلة للتحليل الوظيفي.

في العمل الحالي، يتم إرفاق تسلسل الترميز polyhistidine إلى نهاية 3′ من gtfC (GenBank locus tag SMU_1005) الجينات، ترميز غلوكوزيلترانسفيراز-SI (GTF-SI) في S. mutans⁶. ثم أجريت دراسات التعبير في الأنواع العقدية. تحقيق التعبير gt fC غير متجانسة من قبل E. القولونية من الصعب، على الأرجح بسبب الكتلة الجزيئية العالية من GTF-SI. هذه السلالة تدعى س. موتانس له-gtfC. رسم تخطيطي يصور تنظيم GTFC وspectinomycin كاسيت الجينات المقاومة(sPC^r)7 loci في البرية من نوع S. mutans (S. mutans WT) وتظهر مشتقاته في الشكل 1 وGTF-SI هو بروتين إفرازي الذي يساهم في تطوير biofilm الأسنان المسببة للسرطان⁶. تحت وجود السكروز، لوحظ biofilm الملتصق على سطح زجاجي أملس في سلالة WT S. mutans ولكن ليس في سلالة S. mutans gtfC-disrupted(S. mutans ΔgtfC)^2،5 . يتم استعادة تشكيل Biofilm في S. mutans ΔgtfC على إضافة خارجية من GTF-SI المؤتلف. سلالة، S. mutans له-gtfC، ثم يستخدم لإنتاج المؤتلف GTF-SI.

Protocol

ملاحظة: يجب إكمال توليد S. mutans ‹gtfC، الذي يتم استبدال منطقة الترميز بأكملها من الجين gt fC مع sPC^r، قبل تنفيذ هذه البروتوكولات. راجع المقالة المنشورة للحصول على تفاصيل حول الجيل⁵.

1. تصميم التمهيدي 2.

1. إعداد التمهيديات لبناء S. mutans له-gtfC.
   ملاحظة: وترد في الجدول 1التسلسلات التمهيدية المستخدمة في هذا البروتوكول. طريقة PCR الانصهار خطوتين لتوليد S. mutans له-gtfC هو موضح تخطيطيا في الشكل 2.
   1. تصميم التمهيديات(gtfC-عكس وSPC^صإلى الأمام) للملحق من له العلامة الترميز تسلسل، والتدخل بين الجينات GTFC وSPC^ص (الشكل 2A).
      1. وتشمل GS linker وله علامة الترميز تسلسل في كل من gtfC-عكس وSPC^r-إلىالأمام التمهيديات، والتي 24 قواعد في المناطق 5 'هي مكملة لبعضها البعض.
         ملاحظة: يتم إرفاق تسلسل الأحماض الأمينية من الرابط GS وعلامته (غلي-غلي-غلي-سير-له-له-له-له-له) إلى C-terminus من GTF-SI من خلال ترجمة الجينات.
      2. تصميم التمهيدي gtfCإلى الأمام لاستهداف الجين gt fC في الجينوم Wt S. mutans WT >1 كيلو بايت المصب من الجين وSPC^r-عكسالتمهيدي لاستهداف المنطقة المحيطة المصب من sPC^r في S. mutans -gtfC. تعيين درجة حرارة ذوبان⁸ (T_م)من gtfC-إلى الأمام وSPC^r-عكسالتمهيديات لتتناسب مع درجات حرارة ذوبان gtfC-عكس وSPC^ص- التمهيديات إلى الأمام، على التوالي.
   2. تصميم التمهيديات المتداخلة (متداخلة إلى الأمام ومتداخلة عكس) لPCR الثاني(الشكل 2B).
   3. تصميم التمهيديات(gtfC- إلى الأمام ومستعمرة عكس) محددة للحمض النووي الجيني للتحويل(الشكل 2C؛ وتستخدم التمهيديات لPCR مستعمرة).
      ملاحظة: وamplicons تمتد على الحدود بين gtfC وsPC^ص. ويمكن تطبيق التمهيدي gtfCإلى الأمام كما التمهيدي إلى الأمام.
   4. تصميم التمهيديات (صعودا إلى الأمام وإلى أسفل إلى أسفل إلى الوراء) للتأكيد النهائي لتوليد S. mutans له-gtfC (الشكل 2C؛ يتم استخدام المنتج PCR تضخيمها من قبل التمهيديات لتسلسل الحمض النووي).

2. استخراج الحمض النووي الجينومي من S. mutans

ملاحظة: يجب أن يتم زراعة كل سلالة S. mutans في ضخ قلب الدماغ (BHI) المتوسطة في 37 درجة مئوية في ظل الظروف اللاهوائية. يتم زراعة سلالات متحولة من S. mutans -gtfC وS. mutans له-gtfC في BHI تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل spectinomycin.

1. خط S. موتانق WT و S. mutans ‹gtfC بشكل منفصل على كل من لوحات أجار BHI. احتضانهم بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
2. اختيار مستعمرات واحدة من S. موتانق WT أو S. mutans -gtfC باستخدام مسواك معقمة وتلقيح في 1.5 مل من مرق BHI. احتضانهم بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: ويمكن استخدام المستعمرات كمصدر لقالب الحمض النووي للحمض النووي الريبي الأول (الخطوة 3-1).
3. نقل 1 مل من كل ثقافة بكتيرية إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 مل. الطرد المركزي الثقافة لمدة دقيقة واحدة في 15،000 × ز.
4. قم بإزالة supernatant وإضافة 1 مل من المخزن المؤقت Tris-EDTA (pH 8.0) لإعادة تعليق بيليه الخلية.
5. الطرد المركزي التعليق لمدة 1 دقيقة في 15،000 × ز. إزالة supernatant. إعادة تعليق بيليه الخلية في 50 درجة مئوية من العازلة Tris-EDTA (درجة الحموضة 8.0).
6. سخني التعليق باستخدام حاضنة كتلة لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية. الطرد المركزي تعليق لمدة 5 دقائق في 15،000 × ز.
7. نقل supernatant إلى أنبوب جديد 1.5 مل أجهزة الطرد المركزي الدقيقة (سوف تكون بمثابة الحمض النووي قالب لPCR الأولى).

3. تضخيم PCR

ملاحظة: ويلخص الجدول 1 والجدول 2 والجدول 3 دورات الـ PCR التمهيدية والكواشف والتضخيم، على التوالي.

1. إجراء أول PCR باستخدام S. mutans WT و S. mutans ‹gtfC الجينوم كقوالب PCR. تضخيم المناطق التي تأوي الجزء المصب من جين gtfC وتلك التي تأوي sPC^r باستخدام التمهيديات الموصوفة في الخطوة 1.1.1.2(الشكل 2A).
2. الكهربائي كل منتج PCR على هلام أغاروز 1٪. استئصال شظايا الحمض النووي المطلوب من حوالي 1000 نقطة أساس و 2000 نقطة أساس.
   ملاحظة: الإجراءات الأساسية لPCR⁹، هلام الحمض النووي الكهربائي¹⁰، وتنقية الحمض النووي¹¹ مفصلة في مكان آخر.
3. إجراء PCR ثاني باستخدام منتجات PCR الأولى (متساوي ة تقريبًا) كقوالب PCR مع التمهيديات المتداخلة إلى الأمام والمتداخلة العكسية(الشكل 2B).
4. الكهربائي عشر خليط PCR على هلام أغاروز. تأكيد توليد amplicon المناسبة من حوالي 3000 نقطة أساس.
5. تسريع المنتج PCR المتبقية.
   ملاحظة: تنقية المنتج PCR غير ضروري، لأن amplicons غير محددة التي تم إنشاؤها بواسطة PCR الثاني لا تتداخل مع إعادة تركيب متجانسة.
   1. إضافة المياه الخالية من النوكل إلى خليط PCR وجلب الحجم الإجمالي إلى 100 درجة مئوية، تليها 0.1 حجم (10 درجة مئوية) من خلات الصوديوم 3 M (درجة الحموضة 5.2) و 2.5 وحدات (250 ميكرولتر) من الإيثانول المطلق. يُخلط المزيج ويُخزّن لمدّة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
   2. الطرد المركزي العينة لمدة 20 دقيقة في 15،000 × ز في 4 درجة مئوية. تجاهل الـ supernatant. إضافة 1 مل من الإيثانول 70٪ لغسل بيليه الحمض النووي.
   3. الطرد المركزي العينة لمدة 5 دقائق في 15،000 × ز في 4 درجة مئوية. تجاهل الـ supernatant. الهواء الجاف وحل بيليه الحمض النووي مع 10 ميكرولتر من المياه الخالية من nuclease.

4. تحويل الخلايا

1. إعداد S. mutans WT المختصة لإدخال المنتج PCR الثاني باتباع الخطوات الموضحة في المنشور السابق⁵. تخزين الخلايا في -80 درجة مئوية.
   ملاحظة: لهذه التجربة، تم بالفعل الحفاظ على خلايا S. mutans WT المختصة في -80 درجة مئوية لتوليد S. mutans -gtfC.
2. مزيج 5 ميكرولتر من المنتج PCR الثاني المركز إلى aliquot 50 ميكرولتر من الخلايا المختصة الجليد الباردة المجمدة سابقا. يُضاف المزيج إلى كفيت الكهربائي. إعطاء نبضة كهربائية واحدة (1.8 كيلو فولت، 2.5 مللي ثانية، 600 Ω، 10 μF) للخلايا باستخدام جهاز الكهربائي.
3. إعادة تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من مرق BHI. على الفور، تنتشر 10-100 درجة مئوية من التعليق على لوحات أجار BHI التي تحتوي على الأطياف. احتضان لوحات لمدة 2-6 أيام في 37 درجة مئوية حتى نمت المستعمرات بما فيه الكفاية ليتم التقاطها.

5. التحقق منG enome إعادة التركيب والتخزين

1. قم بإجراء PCR للمستعمرة، باستخدام التمهيديات الأمامية للمستعمرة والأمامية العكسية للمستعمرة لفحص هالاً لإعادة التركيب. الكهربائي كل منتج PCR مستعمرة على هلام أغاروز. تأكيد جزء الحمض النووي من حوالي 1500 نقطة أساس.
2. اختيار واحدة من المستعمرات الإيجابية باستخدام مسواك معقمة والثقافة الفرعية الخلايا بين عشية وضحاها في 2 مل من مرق BHI التي تحتوي على spectinomycin.
3. مزيج 0.8 مل من الثقافة البكتيرية مع 0.8 مل من الجلسرين المعقم 50٪ والأوراق المالية في -80 درجة مئوية أو -20 درجة مئوية.
4. نقل ما تبقى 1 مل من تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 مل. كرر الخطوات 2.3-2.7 لاستخراج الحمض النووي الجينومي من الخلايا.
5. قم بإجراء PCR باستخدام التمهيديات الأمامية والعكسية والحمض النووي الجيني كقالب. كرر الخطوة 3.2 لتنقية منتج الحمض النووي المتضخم من المواد الهلامية.
6. تحديد تسلسل الحمض النووي للأملييكون النقي عن طريق تسلسل الحمض النووي.
   ملاحظة: تأكد من تأكيد جيل S. mutans له-gtfC عن طريق تسلسل الحمض النووي.

6. تنقية بوليهيستيدين الموسومة GTF-SI

1. خط S. mutans له-gtfC على لوحة أجار بي إتش آي التي تحتوي على سبيتينومايسين. احتضانهم بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
2. التقاط مستعمرة واحدة باستخدام مسواك معقمة وخلايا subculture في 3 مل من مرق BHI. الحضانة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
3. إعداد اثنين من قوارير مخروطية مع 1 لتر من مرق BHI دون spectinomycin. تلقيح 1 مل من تعليق الثقافة بين عشية وضحاها في 1 لتر من مرق BHI. الحضانة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
4. تركيز البروتينات من ثقافة supernatant من قبل هطول الأمطار كبريتات الأمونيوم.
   ملاحظة: استخراج من أجسام الخلايا إذا كان البروتين المستهدف داخل الخلايا. وترد تفاصيل الإجراءات الأساسية لهطول الأمطار كبريتات الأمونيوم في مكان آخر¹².
   1. الطرد المركزي تعليق الثقافة البكتيرية لمدة 20 دقيقة في 10،000 × ز في 4 درجة مئوية. استعادة ثقافة supernatant في كوب من الزجاج 3 L.
   2. أضف 1,122 غرام من كبريتات الأمونيوم إلى 2 لتر من التشبع الفائق (80% مع التحريك القوي باستخدام النمام المغناطيسي. السماح للعجل لتشكيل لمدة 4 ساعة أو أكثر في 4 درجة مئوية مع التحريك.
      ملاحظة: يمكن أن يستمر تشكيل التعجيل بين عشية وضحاها.
   3. الطرد المركزي الحل المعجّل لكبريتات الأمونيوم عند 15,000 × ز لمدة 20 دقيقة عند 4 درجة مئوية. لقد أُذيب الـ(سوبرناينت)
   4. جمع عجل مع ملعقة ونقل إلى كوب زجاجي 200 مل. إعادة تعليق الكريات في 35 مل من العازلة ملزمة (50 M NaH₂PO_4،300 مل NaCl، 5 mm imidazole، الحموضة 8.0).
   5. Dialyze تعليق ضد 2500 مل من العازلة ملزمة باستخدام أنابيب غسيل الكلى السليلوز مجددة، في 4 درجة مئوية، مع التحريك. استبدل محلول غسيل الكلى بعد 2 ساعة واستمر في غسيل الكلى بين عشية وضحاها.
   6. استبدال حل غسيل الكلى مرة أخرى. استمر في الدياليس لمدة 2 ساعة إضافية.
5. الطرد المركزي تعليق dialyzed في 20،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. تصفية supernatant من خلال مرشح غشاء باستخدام معدات الترشيح شفط. نقل فيلترات إلى قارورة 75 سم^2.
6. كسر متعدد الهيستيدين الموسومة GTF-SI من تعليق مفلطح عن طريق الكروماتوغرافيا المعدنية تقارب المعطلة (IMAC).
   1. نقل 2 مل من الطين الراتنج IMAC مشحونة ني (ما يقرب من 1 مل من الراتنج) إلى عمود لوني الذي يتم تركيب منفذ لأنبوب السيليكون. إزالة حل التخزين عن طريق تدفق الجاذبية.
      تحذير: لا تسمح للراتنج أن يجف في جميع أنحاء IMAC.
   2. إضافة 3 مل من الماء المقطر في العمود لغسل الراتنج. إضافة 5 مل من المخزن المؤقت ملزمة لمعادلة الراتنج.
   3. أغلق التدفق مع قضيب قرصة هوفمان. إضافة 5 مل من تعليق تصفيتها من الخطوة 6.5 لجعل الطين.
   4. إضافة كل الطين إلى تعليق المصفاة المتبقية. يُلف ّ المزيج برفق لمدّة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
   5. قم بتحميل الخليط مرة أخرى على العمود. إزالة التعليق عن طريق تدفق الجاذبية. اغسل راتنج IMAC بسعة 20 مل من المخزن المؤقت الملزم.
      ملاحظة: ضبط معدل التدفق إلى ما يقرب من 2 مل / دقيقة مع الديك قرصة هوفمان في جميع أنحاء IMAC اللاحقة.
   6. Elute المؤتلف GTF-SI مع 20 مل من العازلة elution (50 M NaH₂PO_4،300 MM NaCl، 500 mM imidazole، درجة الحموضة 8.0).
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا. وينبغي تخزين eluate في 4 درجة مئوية. يمكن إعادة استخدام راتنج IMAC. الرجوع إلى التعليمات الخاصة براتنج IMAC.
7. استبدل المخزن المؤقت elution بالمخزن المؤقت للتخزين (المخزن المؤقت للفوسفات بسعة 50 مل، ودرجة الحموضة 6.5) وركّز حل GTF-SI المؤتلف على ما يقرب من 1 مل باستخدام وحدة الترشيح الفائق الطرد المركزي. تخزين الحل المؤتلف GTF-SI في 4 درجة مئوية.
   ملاحظة: تأكيد تنقية GTF-SI ذات العلامات المتعددة باستخدام SDS-PAGE¹³ والنشاف الغربي¹⁴ عن طريق استخدام الجسم المضاد للبولهيستيدين أحادي النسيلة من قبل الفجل. إضافة CHAPS (التركيز النهائي، 0.1٪) قد تكون هناك حاجة إلى eluent لتجنب الامتزاز غير محددة إلى وحدة، اعتمادا على البروتين المستهدف.

7. استعادة وظيفية من قبل المؤتلف GTF-SI

1. خط كل S. موتانق سلالة على لوحة أجار BHI على حدة. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
2. باستخدام مسواك معقمة، التقاط مستعمرة واحدة لتلقيح في 2 مل من مرق BHI. الحضانة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
3. استخدام 20 درجة مئوية من ثقافة بين عشية وضحاها من S. mutans -gtfC لتلقيح 2 مل من مرق BHI تحتوي على 1٪ السكروز دون المضادات الحيوية في أنبوب اختبار الزجاج. إضافة GTF-SI أو حجم مماثل من السيارة إلى ثقافة S. mutans -gtfC، وثقافة الخلايا مع أنبوب وضعت في موقف يميل بين عشية وضحاها.
   ملاحظة: تعقيم الحل GTF-SI مع مرشح حقنة معقمة وتحديد تركيز البروتين باستخدام اختبار بروتين حمض bicinchoninic¹⁵ قبل الاستخدام.
4. تحريك تعليق الثقافة مع خلاط دوامة لمدة 10 s. Decant تعليق. غسل أنابيب الاختبار مع كمية كافية من الماء المقطر.
5. وصمة عار biofilms على جدار أنبوب مع 1 مل من 0.25٪ Coomassie الأزرق اللامع (CBB).
6. Decant حل تلطيخ بعد 1 دقيقة. اغسل أنابيب الاختبار مع كمية كافية من الماء المقطر. الهواء الجاف ة أنابيب الاختبار.

النتائج

ويبين الشكل 3 حجم كل أمبير يكون من ثاني PCR(الشكل 3ألف)وPCR الثاني(الشكل 3B). ويتوافق حجم كل أمبير مع الحجم المتوقع، على النحو المبين في الجدول 1. ويبين الشكل 4A مستعمرات S. mutans التي تحولت مع المنتج PCR ا...

Discussion

تصميم التمهيديات هو الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول. تم تحديد تسلسل gtfC-عكس وSPC^R-إلى الأمام التمهيديات تلقائيا على أساس تسلسل كل من منطقة نهاية 3′ من GTFC والمنطقة نهاية 5′ من sPC^r. كل التمهيدي يتضمن 24 قواعد تكميلية التي ترميز رابط GS وتسلسل له العلامة الترميز في ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Nippon Genetics	NE-AG02	For agarose gel electrophoresis
Anaeropack	Mitsubishi Gas Chemical	A-03	Anaerobic culture system
Anti-His-Tag monoclonal antibody	MBL	D291-7	HRP-conjugated
BCA protein assay kit	Thermo Fisher Scientific	23227	Measurement of protein concentration
Brain heart infusion broth	Becton, Dickinson	237500	Bacterial culture medium
CBB R-250	Wako	031-17922	For biofilm staining
Centrifugal ultrafiltration unit	Sartorius	VS2032	Buffer replacement and protein concentration
Centrifuge	Kubota	7780II
Chromatographic column	Bio-Rad	7321010	For IMAC
Dialysis membrane clamp	Fisher brand	21-153-100
Dialysis tubing	As One	2-316-06
DNA polymerase	Takara	R045A	High-fidelity DNA polymerase
DNA sequencing	Eurofins Genomics
ECL substrate	Bio-Rad	170-5060	For western blotting
EDTA (0.5 M pH 8.0)	Wako	311-90075	Tris-EDTA buffer preparation
Electroporation cuvette	Bio-Rad	1652086	0.2 cm gap
Electroporator	Bio-Rad	1652100
EtBr solution	Nippon Gene	315-90051	For agarose gel electrophoresis
Gel band cutter	Nippon Genetics	FG-830
Gel extraction kit	Nippon Genetics	FG-91202	DNA extraction from agarose gel
Imager	GE Healthcare	29083461	For SDS-PAGE and western blotting
Imidazole	Wako	095-00015	Binding buffer and elution buffer preparation
Incubator	Nippon Medical & Chemical Instruments	EZ-022	Temperature setting: 4 °C
Incubator	Nippon Medical & Chemical Instruments	LH-100-RDS	Temperature setting: 37 °C
Membrane filter	Merck Millipore	JGWP04700	0.2 µm diameter
Microcentrifuge	Kubota	3740
NaCl	Wako	191-01665	Preparation of binding buffer and elution buffer
NaH2PO4·2H2O	Wako	192-02815	Preparation of binding buffer and elution buffer
NaOH	Wako	198-13765	Preparation of binding buffer and elution buffer
(NH4)2SO4	Wako	015-06737	Ammonium sulfate precipitation
Ni-charged resin	Bio-Rad	1560133	For IMAC
PCR primers	Eurofins Genomics	Custom-ordered
Protein standard	Bio-Rad	161-0381	For SDS-PAGE and western blotting
Solvent filtration apparatus	As One	FH-1G
Spectinomycin	Wako	195-11531	Antibiotics; use at 100 μg/mL
Sterile syringe filter	Merckmillipore	SLGV004SL	0.22 µm diameter
Streptococus mutans ΔgtfC	Stock strain in the lab.		gtfC replaced with spcr
Streptococus mutans UA159	Stock strain in the lab.		S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain
Sucrose	Wako	196-00015	For biofilm development
TAE (50 × )	Nippon Gene	313-90035	For agarose gel electrophoresis
Thermal cycler	Bio-Rad	PTC-200
Tris-HCl (1 M, pH 8.0)	Wako	314-90065	Tris-EDTA buffer preparation