Extracción de cortisol de las matrices de aleta de esturión y mandíbula

Resumen

En este estudio, presentamos un protocolo para la extracción de cortisol de la aleta y la mandíbula de las especies de esturión. Los niveles de cortisol de aleta y mandíbula se examinaron más adelante comparando dos disolventes de lavado seguidos de ensayos ELISA. Este estudio pilotó la viabilidad del cortisol maxilar como un indicador de estrés novedoso.

Resumen

Los objetivos de este estudio fueron desarrollar una técnica para la extracción de cortisol a partir de aletas de esturión utilizando dos disolventes de lavado (agua e isopropanol) y cuantificar cualquier diferencia en los niveles de cortisol de aleta entre tres especies principales de esturión. Las aletas fueron cosechadas de 19 esturiones sacrificados, incluyendo siete beluga(Huso huso),siete siberianos(Acipenser baerii)y cinco sevruga (A. stellatus). Los esturiones se criaron en granjas iraníes durante 2 años (2017-2018), y el análisis de extracción de cortisol se llevó a cabo en Corea del Sur (enero-febrero de 2019). Los jawbones de cinco H. huso también se utilizaron para la extracción de cortisol. Los datos se analizaron mediante el procedimiento de modelo lineal general (GLM) en el entorno SAS. Los coeficientes de variación intra y entre ensayos fueron de 14,15 y 7,70, respectivamente. Brevemente, la técnica de extracción de cortisol implicó el lavado de las muestras (300 x 10 mg) con 3 ml de disolvente (agua ultrapura e isopropanol) dos veces, rotación a 80 rpm durante 2,5 min, secado al aire de las muestras lavadas a temperatura ambiente (22-28 oC) durante 7 días, secado posterior las muestras que utilizan un batidor de perlas a 50 Hz durante 32 minutos y la molienda en polvo, aplicando metanol de 1,5 ml al polvo seco (75 x 5 mg), y rotación lenta (40 rpm) durante 18 horas a temperatura ambiente con mezcla continua. Después de la extracción, las muestras se centrifugaron (9.500 x g durante 10 min) y se transfirieron un sobrenadante de 1 ml a un nuevo tubo de microcentrífuga (1,5 ml), se incubaron a 38 oC para evaporar el metanol y se analizaron mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) . No se observaron diferencias en los niveles de cortisol de aleta entre las especies o en los niveles de cortisol de aleta y mandíbula entre los disolventes de lavado. Los resultados de este estudio demuestran que la matriz jawbone de esturión es un indicador de tensión alternativo prometedor a matrices sólidas.

Introducción

El cortisol es un indicador fiable del estrés animal. La extracción de cortisol proporciona un marco válido para que los investigadores supervisen los niveles de estrés y los patrones generales en los factores de estrés. Por ejemplo, estudios previos han llevado a cabo la validación metodológica de mediciones de cortisol capilar utilizando diversos métodos en humanos^1,2, monos^3,4, bovino⁵, ovejas⁶, y peces^{dorados 7,8}. En las especies de peces, se ha demostrado que las mediciones de cortisol en matrices como escamas, moco de la piel, heces y sangre⁹ proporcionan información sobre la salud de los peces. Cuando el muestreo de sangre es problemático o faltan escamas, se necesitan matrices alternativas para la extracción de cortisol. En los peces, matrices alternativas pueden incluir la mandíbula, un tejido duro similar al diente humano^10.

El desarrollo de nuevas matrices y técnicas validadas para determinar los niveles de estrés de los peces es de particular interés para la industria del caviar, donde el esturión puede experimentar una exposición prolongada a los factores de estrés ambiental¹¹. El sexo del esturión no se puede determinar antes de los 2 años de edad, y el esturión no tiene escamas. Debido a que el cortisol se acumula gradualmente en matrices sólidas durante la etapa de crecimiento^2,7,12, datos de acumulación de cortisol a largo plazo de matrices duras como aletas y mandíbulas podrían proporcionar información sobre el estrés niveles en diferentes etapas de crecimiento. Por el contrario, los niveles de cortisol en sangre proporcionan una instantánea de los niveles de estrés en el momento de la muerte y no pueden representar con precisión el estrés durante las condiciones de cría a largo plazo^13,14. Con la creciente competencia en el mercado del caviar, los nuevos enfoques para mejorar las condiciones de estrés para la producción de huevos más saludables entre las especies de esturión durante la cría a largo plazo (8-12 años o más) son un área de investigación cada vez más importante. Debido al alto costo del esturión, las muestras cosechadas son extremadamente costosas ($8,000-15,000 por peces maduros dependiendo de la especie y la etapa de crecimiento), un factor limitante para los proyectos de investigación. Sin embargo, el desarrollo de una técnica adecuada para la extracción de cortisol a partir de aletas de esturión y mandíbulas podría aplicarse útilmente tanto a los sistemas de piscicultura como a los peces silvestres para mejorar la calidad y la cosecha de huevos de esturión tanto para el consumo como para Conservación.

Además de proporcionar resultados fiables⁶, la selección de una técnica de extracción de cortisol adecuada es de importancia crítica para garantizar que otros compuestos presentes en la matriz durante la preparación de la muestra no confundan la producción, lo que podría resultados incoherentes. Es igualmente importante determinar si los niveles de cortisol de aleta y mandíbula están influenciados por los niveles hormonales en el agua circundante. 15 sugirieron que una serie de factores pueden influir en los niveles de cortisol, incluyendo la edad, el sexo, el embarazo, la temporada, el color¹²y la región corporal de la que se extrae el cortisol^16. Sin embargo, se dispone de poca información sobre los efectos de los disolventes de lavado en la extracción de cortisol en matrices de cuerpo de pescado⁸, y ninguno sobre estos efectos en el esturión, excepto para los huevos de esturión¹⁷.

Aunque el análisis de los niveles basales de cortisol a partir de las aletas y mandíbulas del esturión requiere que el pez sea eutanasiado, este enfoque no implica las técnicas invasivas necesarias para el muestreo de sangre en el esturión vivo. Las muestras de aleta y mandíbula se recogen fácilmente, y la extracción de estos tejidos se puede realizar rápidamente. Del mismo modo, la extracción y el análisis hormonales son sencillos y requieren poco equipo especializado.

En este estudio, presentamos una técnica nueva y fácil de aplicar para la extracción, lavado y determinación de cortisol a partir de aletas de pescado y mandíbulas, con el objetivo de determinar si los niveles de cortisol medidos a partir de estas matrices pueden utilizarse de forma fiable como estrés Indicadores. Las ventajas de esta técnica incluyen un enfoque⁸ fácil y no invasivo, menos variación de datos y una salida confiable^1,6,8,17; la técnica es aplicable a especies de peces sin escamas como el esturión. La técnica requiere el sacrificio del pescado, la selección de los disolventes de lavado adecuados^2,4, molienda adecuada de las muestras^3,5, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas profesionales (ELISA) aplicación^5,7, y un amplio conocimiento de la incorporación de fuentes de cortisol en matrices sólidas^6.

Aplicamos dos disolventes de lavado diferentes (agua ultrapura e isopropanol) para obtener niveles basales de cortisol en aletas de tres especies de esturión: beluga (Huso huso), siberiano (Acipenser baerii) y sevruga (A. stellatus ), en condiciones ambientales estándar para cada especie. Mandíbulas de H. huso también se utilizaron para evaluar el estrés en el esturión. Este es el primer estudio para medir los niveles de cortisol en los maxilares de esturión. Los resultados de este estudio proporcionarán datos comparativos de cortisol para las especies de esturión en la etapa de crecimiento temprano (1 año) antes de la determinación del sexo.

Protocolo

Los siguientes procedimientos y métodos experimentales fueron aprobados por la Autoridad de Bienestar Animal y Etica de la Universidad Nacional de Kangwon, Chuncheon, República de Corea.

1. Colección de aletas

1. Captura el esturión suavemente usando una red para minimizar las lesiones y el estrés.
2. Enjuague el pescado cuidadosamente con agua dulce y luego limpie la superficie del cuerpo con una toalla absorbente antes de la eutanasia.
3. Golpea la cabeza del pez usando un martillo de plástico de tal forma que el pez se aturda o pierde el conocimiento. Retire la cabeza con un cuchillo.
4. Mida el peso corporal (g) y la longitud (cm).
5. Después de la eutanasia, recoger muestras de aleta cortando lo más cerca posible del cuerpo utilizando tijeras quirúrgicas esterilizadas.
   NOTA: Se deben utilizar toallas absorbentes individuales y no recicladas para cada pescado. Las estadísticas descriptivas de las especies utilizadas en este estudio fueron las siguientes: esturión de beluga (H. huso): edad de 18 a 2,1 meses, peso corporal a 2.700 x 300 g, y longitud del cuerpo a 55 x 5 cm; Esturión siberiano (A. baerii): edad a 9,6 a 2,4 meses, peso corporal a 1,750 a 250 g, y longitud de la carrocería a 45 x 5 cm; esturión sevruga (A. stellatus): edad de 14 x 1,3 meses, peso corporal a 1.000 a 100 g, y longitud del cuerpo a 65 x 5 cm.

2. Preparación de aletas para la extracción de cortisol

1. Colocar las muestras de aleta (una muestra por tejido: 3 g) en papel de pesaje de laboratorio (107 mm x 210 mm) y secar a temperatura ambiente durante unos días hasta que se seque.
2. Envuelva las muestras en láminas de papel de aluminio, colóquelas en bolsas de plástico etiquetadas y transfiera las muestras al laboratorio.
3. Almacene las muestras en un refrigerador para su uso posterior, incluyendo lavado, extracción de cortisol, secado y análisis ELISA(Figura 2).

3. Análisis de cortisol de aleta

1. Calibre la báscula analítica digital (precisión: 0.0001) y pese 300 muestras de 10 mg con papel de pesaje en la bandeja de la báscula.
2. Lave las muestras.
   1. Transfiera cada muestra a un tubo de polipropileno cónico de 15 L. Añadir 3 ml de isopropanol a cada tubo utilizando una pipeta monocanal de 5.000 ml.
   2. Gire los tubos a 80 rpm durante 2,5 minutos para lavar el cortisol y eliminar cualquier posible contaminación externa. Repita este procedimiento dos veces.
   3. Seque al aire las muestras lavadas a temperatura ambiente (22-28 oC) durante 7 días.
   4. Repita el procedimiento de lavado con agua ultrapura como agente de lavado.
3. Extraiga la mandíbula del tejido corporal utilizando fórceps de corte óseo. Aplique los pasos 1.5-3.2.4 a las muestras de la mandíbula.
4. Pesar (75 x 5 mg) muestras de aleta seca o mandíbula y moler con un batidor de cuentas a 50 Hz durante 32 min.
   1. Entregar 1,5 ml de metanol en cada tubo que contenga aleta o mandíbula en polvo utilizando una pipeta de 1000 ml. Coloque las muestras en un rotador de tubo a rotación lenta (40 rpm) durante 18 horas a temperatura ambiente para extraer el cortisol con mezcla continua.
5. Después de la extracción de cortisol, centrifugar las muestras a 9.500 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, recoja la capa orgánica superior que contiene cortisol (1 ml) de cada muestra y colóquela en un tubo de microcentrífuga separado de 1,5 ml.
   1. Secar las muestras por incubación a 38oC para evaporar el metanol. Conservar las muestras de cortisol extraídas bajo una campana de humo durante la noche para permitir que el metanol se disipe.
      NOTA: La capa que contiene cortisol suele ser de color amarillento.

4. Detección de cortisol de aleta

1. Descongelar las muestras de aleta seca o mandíbula a temperatura ambiente durante 1,5 h antes de utilizar el kit ELISA.
2. Añadir 400 l de tampón de fosfato, vórtice y centrífuga a 1.500 x g durante 15 min.
3. Ejecute cada muestra (25 l) por duplicado para mejorar la precisión y fiabilidad del ensayo. Elimine los datos fuera de la curva estándar como valores atípicos.
4. Establezca un lector de microplacas en 450 nm, luego ajuste a ág dL^-1 y lea la densidad óptica de la placa.
   1. Utilice el software de microplaca con un ajuste de curva de regresión no lineal de cuatro parámetros. Convierta los niveles de cortisol de las muestras obtenidas del software en pg mg^-1 utilizando la siguiente ecuación:
      F a 10.000E (A/B) (C/D),
      donde F - el valor final del nivel de cortisol de la aleta en (pg mg^-1), E - el volumen (ml) del tampón de ensayo utilizado para reconstituir el extracto seco, A - la concentración (g dL^-1) proporcionada por la salida del ensayo, B - el peso (mg) de la aleta sometida a ction, C - el volumen (mL) de metanol añadido a la aleta en polvo, y D - el volumen (ml) de metanol recuperado del extracto y posteriormente secado hacia abajo³.

5.Análisis estadístico

1. Divida cada muestra en dos submuestras antes del procedimiento de lavado y, a continuación, ejecute por duplicado durante el ensayo del kit ELISA (2 x 2 x 4 observaciones por muestra) para mejorar la potencia de la prueba y la fiabilidad de los resultados.
2. Compare los efectos de los dos disolventes de lavado y sus interacciones aplicando el procedimiento de modelo lineal general (GLM) en el entorno de software SAS a los datos de medición¹⁸.
3. Pruebe las diferencias entre los medios que utilizan la prueba de Tukey en un nivel de significancia de p < 0.05. Acepte 0.05 < p < 0.10 como evidencia de una tendencia en lugar de como una diferencia significativa.

Resultados

La técnica de extracción de cortisol de aleta presentada fue desarrollada y confirmada en este estudio utilizando tres especies de esturión. Se compararon los niveles de cortisol obtenidos con agua ultrapura e isopropanol como disolventes de lavado(Figura 2). Se examinó el cortisol de H. huso jawbones para determinar si los maxilares de esturión podrían utilizarse como una matriz alternativa a las aletas. Los efectos del disolvente de lavado, l...

Discusión

El esturión a veces se llama un "fósil viviente" porque ha exhibido pocas adaptaciones a lo largo de los últimos milenios. El género de esturiones Acipenser contiene 27 especies que producen caviar; sin embargo, tres especies (beluga, baerii y sevruga) producen la mayor parte del suministro mundial de caviar. El esturión es vulnerable a la sobrepesca y a la interferencia en su hábitat natural y, por lo tanto, está en peligro de extinción más crítico que cualquier otro grupo de especies. El esturión pe...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disposal latex surgical gloves	Ansell	63754090
Platform scale-electronic weighing 100kg	Baskoolnikoo	101 EM
Serological pipette to deliver up to 24 mL	Becton Dickinson Falcon	35-7550
Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters	BioTek	8041000
Reagent reservoirs	BrandTech	703459
Zipper storage plastic bag	Cleanwrap	30cm x100m
Isopropyl alcohol	Daejung chemicals & Metals	5035-4400
Methyl alcohol	Daejung chemicals & Metals	5558-4100
Tube rotator- MX-RL-Pro	DLAB Scientific	824-222217777
Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL	Eppendorf Research Plus	M21518D
Precision pipette to deliver 15 and 25 μL	Eppendorf Research Plus	R25623C
Weighing paper (107 x 210 mm)	Fisherbrand	09-898-12B
Bead beater, 50/60 Hz 2A	GeneReach Biotechnology Corp	tp0088
Plate rotator with orbit capable of 500 rpm	Hangzhou Miu Instrument	MU-E30-1044
Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL	Hyundai Micro	H20050
Fume hood	Kwang Dong Industrial	KD 901-22128175
Micro-centrifuge capable of 1500 x g	Labo Gene	9.900.900.729
Mini vortex mixer	LMS	VTX-3000L
Lotte aluminum foil roll	Lotte Aluminum	B0722X5FK5
Digital scale	Mettler Toledo	ME204
Ultrapure water	MDM	MDM-0110
Pipette tips	Neptune Scientific	REF 2100.N
Large fish net	Pond H2O	Hoz135
Salivary cortisol kit	Salimetrics	1-3002-4
Bone cutting forceps	Sankyo	26-188A
Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL	VITLAB	18A68756
Towel	Yuhan Kimberly	1707921546
Tissue paper (107 × 210)	Yuhan Kimberly	41117