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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Les ARN circulaires (circRNAs) sont des ARN non codants qui peuvent avoir des rôles dans la régulation transcriptionnelle et la médiation des interactions entre les protéines. Après l'évaluation de différents paramètres pour la construction des bibliothèques de séquençage circRNA, un protocole a été compilé utilisant la préparation totale échouée de bibliothèque d'ARN avec RNase R pré-traitement et est présenté ici.

Résumé

Les ARN circulaires (circRNAs) sont une classe d'ARN non codants impliqués dans des fonctions telles que la régulation des micro-ARN (miRNA), la médiation des interactions protéines-protéines et la régulation de la transcription des gènes parentaux. Dans le séquençage classique de l'ARN de prochaine génération (ARN-seq), les circARN sont généralement négligés en raison de la sélection poly-A lors de la construction des bibliothèques d'ARNm, ou se trouvent à très faible abondance, et sont donc difficiles à isoler et à détecter. Ici, un protocole de construction de la bibliothèque circRNA a été optimisé en comparant les trousses de préparation de la bibliothèque, les options de prétraitement et diverses quantités totales d'entrée d'ARN. Deux trousses de préparation de la bibliothèque de transcriptome entièrement disponibles dans le commerce, avec et sans prétraitement R, et utilisant des quantités variables d'entrée totale d'ARN (1 à 4 g), ont été testées. Enfin, plusieurs types de tissus; y compris le foie, les poumons, les ganglions lymphatiques et le pancréas; ainsi que de multiples régions du cerveau; y compris le cervelet, le lobe pariétal inférieur, le gyrus temporel moyen, le cortex occipital, et le gyrus frontal supérieur ; ont été comparés pour évaluer l'abondance de circRNA à travers des types de tissu. L'analyse des données ARN-seq générées à l'aide de six différents outils de détection de circRNA (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC et CIRCexplorer) a révélé qu'une trousse de préparation totale de la bibliothèque d'ARN échouée avec le prétraitement R r et l'entrée d'ARN de 4 g est l'entrée optimale de l'ARN pour identifier le plus grand nombre relatif de circRNAs. Conformément aux résultats précédents, l'enrichissement le plus élevé des circRNAs a été observé dans les tissus de cerveau comparés à d'autres types de tissu.

Introduction

Les ARN circulaires (CircRNAs) sont des ARN endogènes et non codants qui ont retenu l'attention compte tenu de leur expression omniprésente dans la transcriptome eucaryotique1,2,3. Ils sont formés lorsque les exons dos-épissage à l'autre et ont donc été initialement considérés comme des artefacts épissage4,5. Cependant, des études récentes ont démontré que les circRNAs présentent le type de cellule, le tissu, et l'expression spécifique de stade développemental3,6 et sont évolutivement conservés2,3. En outre, ils sont impliqués dans la médiation des interactions protéine-protéine7, micro-ARN (miRNA) liant3,8,9,10, et la régulation de la transcription des gènes parentaux11.

Dans le séquençage classique d'ARN (ARN-seq), les circRNAs peuvent être complètement perdus pendant la construction de bibliothèque en raison de la sélection de poly-A pour des ARNM ou peuvent être difficiles à isoler étant donné leur faible abondance. Cependant, des études récentes de caractérisation circRNA ont incorporé une étape de pré-traitement en utilisant RNase R afin d'enrichir pour les circRNAs2,12,13. RNase R est une exoribonucane qui digère les ARN linéaires, laissant derrière elle des structures circulaires d'ARN. Les protocoles d'enrichissement de CircRNA ont été optimisés en générant et en comparant les données de deux kits de construction de bibliothèques de transcriptome entièrement disponibles dans le commerce, avec et sans étape de prétraitement R R, et en utilisant des quantités variables d'entrée totale d'ARN (1 à 4 g). Le protocole optimisé a ensuite été utilisé pour évaluer l'abondance des circARN dans cinq régions différentes du cerveau (cerebellum [BC], lobe pariétal inférieur [IP], gyrus temporel moyen [MG], cortex occipital [OC] et gyrus frontal supérieur [SF]) et quatre autres types de tissus (foie [LV], poumon [LU], ganglion [LN] et pancréas[PA]). Les bibliothèques RNA-seq ont été appariées fin séquencée et les données ont été analysées à l'aide de six algorithmes de prédiction circRNA différents: find_circ3, CIRI14, Mapsplice15, KNIFE16, DCC17, et CIRCexplorer18. Sur la base de notre analyse, le plus grand nombre de circRNAs uniques a été détecté lors de l'utilisation d'une trousse de préparation totale échouée de bibliothèque d'ARN avec RNase R pré-traitement et 4 arn d'entrée total. Le protocole optimisé est décrit ici. Comme précédemment rapporté19,20, l'enrichissement le plus élevé des circRNAs a été observé dans le cerveau par rapport à d'autres types de tissus.

Protocole

Cette recherche a été effectuée conformément à toutes les lignes directrices institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain. Des tissus cérébraux ont été obtenus à partir du programme de don de cerveau et de corps du Banner Sun Health Research Institute à Sun City, AZ. Les activités du Programme de dons de cerveauets et de corps sont approuvées par la Western Institutional Review Board (wirB protocol #20120821). Tous les sujets ou leurs représentants légaux ont signé le consentement éclairé. Des biospécimens commerciaux (non cérébraux) ont été achetés chez Proteogenex.

1. Traitement R R R R

REMARQUE: Dans les étapes suivantes, le volume de réaction est ajusté à un volume total de 50 L. Il s'agit du volume d'échantillon minimum à utiliser dans le kit de nettoyage et de concentrateur d'ARN (voir Tableau des matériaux). En outre, le protocole optimisé décrit ici est pour une quantité d'entrée de 4 g d'ARN total. Un temps d'incubation plus long pour le traitement R R R est recommandé pour une quantité d'entrée de 4 g.

  1. Diluer l'ARN total à 4 g dans 39 eau sans RNase ll dans un tube de microcentrifuge et bien mélanger par pipetting.
  2. Dans un tube séparé, diluer le RNase R à une concentration de travail de 2 U/L avec 1x RNase R Reaction Buffer. Ne faire que suffisamment pour une utilisation immédiate.
  3. Pipette 39 'L d'ARN total et 5 'L de 10x RNase R Reaction Buffer dans un tube de réaction de 1,5 ml et bien mélanger par pipetting (50 'L sera le volume de réaction total). Ensuite, ajoutez 6 l de RNase R (2 U/L).
  4. Ajustez la pipette au volume de réaction complet (50 l) et mélangez bien en faisant monter et descendre 10 fois.
  5. Placez le tube dans un bain d'eau de 37 oC pendant 10 min. Assurez-vous que le volume de réaction complet est immergé dans le bain d'eau.
  6. Placez le tube sur la glace et procédez immédiatement au nettoyage et à la concentration de l'ARN (section 2).

2. Purifier l'ARN à l'aide d'un kit de nettoyage et de concentrateur d'ARN

REMARQUE: Lors de l'utilisation de l'ARN de haute qualité (RIN -gt;8, DV200-gt;80%), rNase R traitement peut entraîner une perte d'environ 60% de l'ARN. À l'aide d'une entrée de 4 g, on estime qu'il reste de 2 à 2,5 g d'ARN traité après la section 1.

  1. Avant de commencer, préparer le tampon de lavage à ARN en ajoutant 48 ml d'éthanol à 100 % au concentré tampon et bien mélanger par pipetting. Placer les colonnes de purification dans des tubes de collecte (voir Tableau des matériaux) et placer dans un support à tubes.
    REMARQUE: Utilisez les paramètres de centrifugation suivants pour toutes les étapes suivantes : 10 000 à 16 000 x g. Si le traitement DNase I a déjà été effectué, sautez le traitement DNase I à ce stade.
  2. Ajouter 2 volumes de tampon de liaison d'ARN à l'échantillon traité RNase R, et bien mélanger par pipetting (volume total : 150 l).
  3. Ajouter 1 volume d'éthanol à 100 % au mélange d'échantillons traités par ARN Binding Buffer et RNase R, et bien mélanger par pipetting (volume total : 300 l).
  4. Transférer le volume entier à la colonne et centrifuger la colonne pendant 30 s. Jeter le flux à travers.
  5. Ajouter 400 L de tampon de préparation à l'ARN directement à la colonne, centrifuger la colonne pendant 30 s, et jeter le flux à travers.
  6. Ajouter 700 l de tampon de lavage d'ARN directement à la colonne, centrifuger la colonne pendant 30 s, et jeter le flux à travers.
  7. Ajouter 400 l de tampon de lavage d'ARN directement à la colonne, centrifuger la colonne pendant 2 min, et transférer la colonne à un tube frais de 1,5 ml sans RNase.
  8. Ajoutez 11 l'eau sans RNase directement à la colonne en maintenant la pointe de pipette juste au-dessus du filtre de colonne et en veillant à ce que l'eau atterrisse seulement sur le filtre de colonne.
  9. Incuber la colonne pendant 1 min à température ambiante et la centrifugeuse pendant 1 min.
  10. Avant de jeter la colonne, vérifiez s'il y a un débit dans le tube sans NNase. En cas de succès de l'élution, entreposez l'échantillon à -80 oC ou procédez immédiatement à la préparation de la bibliothèque. Le volume total final d'élution d'environ 10 L est utilisé pour la construction de la bibliothèque.
    REMARQUE: Point d'arrêt : Laissez l'ARN à -80 oC jusqu'à 7 jours avant de poursuivre la préparation de la bibliothèque.

3. Préparation de la bibliothèque circRNA

REMARQUE: Voir Tableau des matériaux pour le kit, qui contient la plupart des réactifs utilisés dans cette section.

  1. épuisement et fragmentation de l'ARNr
    1. Transférer 10 l d'ARN purifié de l'étape 2.10 à un puits propre dans une nouvelle plaque PCR de 96 puits de 0,3 ml. Au puits, ajouter 5 l de tampon de liaison rRNA suivi de 5 L rRNA Removal Mix. Doucement pipette de haut en bas 10 fois pour mélanger.
    2. Plaque de scellant et incuber pendant 5 min à 68 oC sur un bloc thermocycler préprogrammé et préchauffé. Après l'achèvement de l'incubation de 5 min, déposer la plaque sur le banc et incuber à température ambiante pendant 1 min.
    3. Retirer le joint de l'assiette. Ajouter 35 l l de perles d'ARNr de température ambiante vortexées à l'échantillon. Ajuster la pipette à 45 l et pipette de haut en bas 10-20x pour bien mélanger. Incuber la plaque pendant 1 min à température ambiante.
    4. Transférer la plaque sur un support magnétique et incuber sur le support pendant 1 min ou jusqu'à ce que la solution se dégage. Transférer tout le supernatant (45 euros) dans un nouveau puits sur la même assiette, ou dans une nouvelle assiette (selon le nombre d'échantillons avec lequel vous travaillez).
    5. Vortex les perles de nettoyage de l'ARN (voir Tableau des matériaux) jusqu'à ce qu'elles soient bien dispersées, et ajouter 99 l de perles à chaque échantillon. Pipette de haut en bas 10x à mélanger. Incuber l'assiette à température ambiante pendant 10 min.
    6. Transférer la plaque sur le support magnétique et incuber 5 min supplémentaires ou jusqu'à ce que la solution se dégage. Retirer et jeter tout le supernatant du puits.
    7. Avec la plaque encore sur le support magnétique, ajouter 200 l de 80% EtOH fraîchement préparé au puits sans perturber les perles. Incuber pendant 30 s, puis retirer et jeter l'éthanol. Répéter l'opération pour un total de 2 lavages.
    8. Ajouter 11 ll de tampon d'élution à chaque puits et pipette de haut en bas 10 fois pour mélanger. Incuber à température ambiante pendant 2 min, puis transférer sur le support magnétique jusqu'à ce que la solution s'éclaircisse (1 à 5 min).
    9. Transférer 8,5 L du supernatant du puits à un nouveau puits sur la même plaque ou à une nouvelle assiette. Ajouter 8,5 l de mélange Elute, Primer, Fragment High à chaque échantillon contenant des puits. Pipette de haut en bas 10 fois pour bien mélanger.
    10. Plaque de scellant et incuber pendant 8 min à 94 oC sur un bloc thermocycler préprogrammé et préchauffé. Retirer du thermocycleur lorsqu'il atteint 4 oC et la centrifugeuse brièvement.
      REMARQUE: Procédez immédiatement au protocole d'ADNc De synthèse First Strand.
  2. Synthétiser l'ADNc
    1. Pour chaque échantillon en cours de préparation, mélanger 9 'L First Strand Synthesis Mix avec 1 'L de transcriptase inversée (voir Tableau des matériaux). Ajouter 8 ll du mélange à l'échantillon. Pipette de haut en bas 6 fois pour mélanger.
      1. Plaque de scellement et incuber sur un bloc thermocycler préprogrammé et préchauffé en utilisant les paramètres suivants : 25 oC pendant 10 min, 42 oC pendant 15 min, 70 oC pendant 15 min, 4 oC de prise. Procéder immédiatement à la synthèse du deuxième brin.
    2. Ajouter 5 ll de tampon de suspension à chaque échantillon suivi de 20 l de mix principal de deuxième brin de marquage. Pipette le volume entier de haut en bas 6 fois.
    3. Plaque de scellement et incuber sur un bloc thermocycler préprogrammé et préchauffé réglé à 16 oC pendant 1 h. Après l'incubation, retirer la plaque du thermocycler et la laisser équilibrer à température ambiante.
    4. Perles de purification De Vortex PCR (voir Tableau des matériaux)et ajouter 90 perles ll à chaque puits d'échantillon. Pipette de haut en bas 10 fois pour bien mélanger. Incuber à température ambiante pendant 10 min.
    5. Transférer le mélange perle/échantillon sur le support magnétique et incuber pendant 5 min ou jusqu'à ce que le liquide se dégage. Retirer et jeter le supernatant.
    6. Ajouter 200 'L de 80% EtOH à chaque échantillon. Incuber des échantillons sur le support magnétique à température ambiante pendant 30 s. Jeter le supernatant. Répéter 1x.
    7. Laisser sécher les perles à température ambiante pendant 6 min, puis retirer du support magnétique.
    8. Resuspendre les perles dans 19,5 l de tampon de résuspension. Pipette de haut en bas 10 fois pour bien mélanger. Incuber à température ambiante pendant 2 min, puis transférer sur le support magnétique et couver pendant 1 min supplémentaire ou jusqu'à ce que le liquide se dégage.
    9. Transférer 17,5 L de supernatant vers une nouvelle plaque bien/nouvelle.
      REMARQUE: Si les échantillons ne se déroulent pas immédiatement, les échantillons peuvent être conservés à -20 oC pendant une durée pouvant aller jusqu'à 7 jours.
  3. Préparation de la bibliothèque
    1. Ajouter 12,5 L de mélange A-Tailing à chaque puits contenant supernatant. Pipette le volume entier de haut en bas 10 fois pour mélanger.
    2. Incuber la réaction sur un bloc thermocycler préprogrammé et préchauffé réglé à 37 oC en utilisant les paramètres suivants : 37 oC pendant 30 min, 70 oC pendant 5 min, 4 oC de prise. Lorsque les échantillons atteignent 4 oC, passez immédiatement à la ligature de l'adaptateur.
    3. À chaque échantillon, ajoutez 2,5 l de tampon de suspension, 2,5 l d'un adaptateur d'ARN unique et 2,5 l de mélange de ligation. Pipette de haut en bas 10x à mélanger.
    4. Incuber des échantillons sur un bloc thermocycler préprogrammé et préchauffé à 30 oC pendant 10 min.
    5. Ajouter 5 ll de tampon Stop Ligation à chaque échantillon et pipette de haut en bas pour mélanger.
    6. Ajouter 42 L de perles de purification PCR mélangées à chaque échantillon et bien mélanger. Suivez les étapes 3.2.6 à 3.2.10, mais changez le volume de résuspension à 52 L et le volume final d'élution à 50 'L.
    7. Répétez à nouveau le protocole de perles de purification PCR avec l'élution de 50 L à partir de l'étape 3.3.6, mais changez le volume de résuspension à 22 L et le volume d'élution finale à 20 l.
      REMARQUE: Si les échantillons ne se déroulent pas immédiatement, les échantillons peuvent être conservés à -20 oC pendant une durée pouvant aller jusqu'à 7 jours.
    8. Ajouter 5 L de PCR Primer Cocktail et 25 'L de PCR Master Mix à chaque échantillon. Mélanger en pipetting de haut en bas 10 fois. Incuber la réaction sur un bloc thermocycler préprogrammé et préchauffé en utilisant les paramètres suivants : 98 oC pour 30 s; puis 8 cycles de 98 oC pour 10 s, 60 oC pour 30 s et 72 oC pour 30 s; puis 72 oC pendant 5 min, puis 4 oC de prise.
      REMARQUE: L'optimisation du nombre total de cycles PCR peut être nécessaire pour générer des quantités suffisantes de bibliothèque pour le séquençage.
    9. Suivez le protocole de purification des perles PCR (étapes 3.2.4 à 3.2.9), sauf ajouter 50 L de perles de purification PCR bien mélangées et changer le volume de suspension à 32,5 L avec un volume d'élution final de 30 L.
      REMARQUE: Les échantillons doivent être entreposés à -20 oC.
  4. Quantification et contrôle de la qualité à l'aide d'un analyseur d'acide nucléique
    1. Laisser les rubans et les réactifs récaler pour l'équilibre à température ambiante pendant 30 min.
    2. Mélanger 2 ll de bibliothèque avec 2 'L de tampon HS D1000, et ajouter à une plaque de puits compatible.
    3. Sceller fermement avec le joint de papier d'aluminium compatible, et le vortex pendant 1 min à 2.000 tr/min.
    4. Faites tourner et chargez la plaque sur l'analyseur suivant les invites logicielles.
      REMARQUE: Les bibliothèques devraient avoir une superficie approximative de 260 pb.

4. Flux de travail d'analyse de données

  1. Séquencer les bibliothèques RNA-seq (voir Tableau des matériaux) pour générer 82 bp de lectures appariées. Convertir les données de séquençage brute sous forme de fichiers d'appels de base (.bcl) en FASTQs à l'aide de l'outil bcl2fastq (v0.2.19).
  2. Détecter les circRNAs.
    REMARQUE: Sur la base des preuves précédemment rapportées qu'une approche de détection de circRNA d'ensemble exécute mieux comparée à l'utilisation d'un outil simple de détection21,22,nous suggérons d'utiliser plusieurs outils pour la détection de circRNA. Ici, les circRNAs ont été identifiés à l'aide de six algorithmes de prédiction circRNA existants : find_circ, CIRI, CIRCexplorer, Mapsplice, KNIFE et DCC, appliquant les paramètres recommandés pour chaque algorithme.
    1. Téléchargez et installez chaque algorithme de détection circRNA sur un cluster informatique haute performance Linux en utilisant les instructions fournies par les développeurs.
    2. Aligner les FORSEq ARN-seq par rapport au génome de référence (GRCh37), en utilisant l'aligneur recommandé pour chaque outil.
    3. Après l'alignement, exécutez des algorithmes de détection circRNA en appliquant les paramètres recommandés respectifs.
    4. Chaque outil produira un fichier de résultats multi-colonnes avec la liste des circRNAs détectés, extraira les coordonnées circRNA et le nombre de lectures à l'appui de ce afin de quantifier le nombre de candidats détectés dans chaque état d'échantillon /test.
  3. Convertir les coordonnées circRNA par CIRI, Mapsplice et DCC en coordonnées basées sur 0 pour être compatibles avec les trois autres algorithmes.
  4. Sélectionnez les circRNAs avec deux lectures ou plus ou des analyses et comparaisons en aval. Le tableau 1 résume tous les paramètres évalués dans notre étude ainsi que le nombre total de lectures de séquençage générées pour chaque échantillon.
  5. Pour chaque état d'échantillon/test, comptez le nombre de circARN détectés normalisés au nombre de lectures cartographiées générées pour cette bibliothèque, par million. Résumez les résultats à travers les différents outils/échantillons dans les parcelles de boîte, comme détaillé dans les résultats représentatifs.

Résultats

Les données générées à l'aide d'un ARN de contrôle universel (UC) disponible dans le commerce et à l'aide de deux trousses de préparation de la bibliothèque, qui comprennent toutes deux une étape d'épuisement des ribo dans leurs protocoles, ont d'abord été évaluées. À l'aide d'un flux de travail analytique (flux de travail d'analyse de données, section 4), dans l'ensemble, un plus grand nombre de circRNAs a été détecté dans les ensembles de données TruSeq par rapport à ceux de Kapa (

Discussion

Dans le cadre de cette étude, deux trousses de préparation de bibliothèques disponibles dans le commerce, des options de prétraitement et des quantités d'ARN d'entrée ont été testées afin d'optimiser un protocole d'enrichissement de l'ARNrc pour la construction de bibliothèques de séquençage circRNA. D'après les évaluations de cette étude, un certain nombre d'aspects clés et d'étapes critiques dans la création de bibliothèques de séquençage circRNA sont apparents. Notre évaluation confirme l'utilit?...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Nous sommes reconnaissants au Banner Sun Health Research Institute Brain and Body Donation Program (BBDP) de Sun City, arizona pour la fourniture de tissus cérébraux humains. Le BBDP a été soutenu par le National Institute of Neurological Disorders and Stroke (U24 NS072026 National Brain and Tissue Resource for Parkinson's Disease and Related Disorders), le National Institute on Aging (P30AG19610 Arizona Alzheimer's Disease Core Center), l'Arizona Department of Health Services (contrat 211002, Arizona Alzheimer's Research Center), l'Arizona Biomedical Research Commission (contrats 4001, 0011, 05-901 et 1001 au Arizona Parkinson's Disease Consortium) et le Michael J. Fox Foundation for Parkinson's Research27. Cette étude a également été soutenue par le DHS et l'État de l'Arizona (subvention adhS14-052688). Nous remercions également Andrea Schmitt (Banner Research) et Cynthia Lechuga (TGen) pour leur soutien administratif.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
1000 µL pipette tipsRaininGP-L1000F
20 µL pipette tipsRaininSR L 10F
200 µL pipette tipsRaininSR L 200F
2200 TapeStation Accessories (foil covers)Agilent Technologies5067-5154
2200 TapeStation Accessories (tips)Agilent Technologies5067-5153
Adhesive Film for MicroplatesVWR60941-064
AMPure XP Beads 450 mLBeckman CoulterA63882PCR purification
Eppendorf twin.tec 96-Well PCR PlatesVWR951020401
High Sensitivity D1000 reagentsAgilent Technologies5067-5585
High Sensitivity D1000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5584
HiSeq 2500 Sequencing SystemIlluminaSY-401-2501
HiSeq 3000/4000 PE Cluster KitIlluminaPE-410-1001
HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles)IlluminaFC-410-1002
HiSeq 4000 Sequencing SystemIlluminaSY-401-4001
HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2IlluminaPE-402-4002
HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle)IlluminaFC-402-4022
Kapa Total RNA KitRocheKK8400
Molecular biology grade ethanolFisher ScientificBP28184
Qubit Assay TubesSupply Center by Thermo FischerQ32856
Qubit dsDNA High Sense Assay KitSupply Center by Thermo FischerQ32854
RNA cleanup and concentrator - 5ZymoRCC-100Contains purification columns, collection tubes
RNAClean XP beadsBeckman Coulter GenomicsRNA Cleanup beads
Rnase RLucigenRNR07250
SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 unitsThermoFisher (LifeTech)18064014
TapeStation 2200Agilent TechnologiesNucleic Acid analyzer
TElowEVWR10128-588
TruSeq Stranded Total RNA Library Prep KitIllumina20020596Kit used in section 3
Two-Compartment Divided TrayVWR3054-1004
UltraPure WaterSupply Center by Thermo Fischer10977-015
Universal control RNAAgilent740000

Références

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