Identification des ARN circulaires à l'aide du séquençage de l'ARN

Summary

Les ARN circulaires (circRNAs) sont des ARN non codants qui peuvent avoir des rôles dans la régulation transcriptionnelle et la médiation des interactions entre les protéines. Après l'évaluation de différents paramètres pour la construction des bibliothèques de séquençage circRNA, un protocole a été compilé utilisant la préparation totale échouée de bibliothèque d'ARN avec RNase R pré-traitement et est présenté ici.

Abstract

Les ARN circulaires (circRNAs) sont une classe d'ARN non codants impliqués dans des fonctions telles que la régulation des micro-ARN (miRNA), la médiation des interactions protéines-protéines et la régulation de la transcription des gènes parentaux. Dans le séquençage classique de l'ARN de prochaine génération (ARN-seq), les circARN sont généralement négligés en raison de la sélection poly-A lors de la construction des bibliothèques d'ARNm, ou se trouvent à très faible abondance, et sont donc difficiles à isoler et à détecter. Ici, un protocole de construction de la bibliothèque circRNA a été optimisé en comparant les trousses de préparation de la bibliothèque, les options de prétraitement et diverses quantités totales d'entrée d'ARN. Deux trousses de préparation de la bibliothèque de transcriptome entièrement disponibles dans le commerce, avec et sans prétraitement R, et utilisant des quantités variables d'entrée totale d'ARN (1 à 4 g), ont été testées. Enfin, plusieurs types de tissus; y compris le foie, les poumons, les ganglions lymphatiques et le pancréas; ainsi que de multiples régions du cerveau; y compris le cervelet, le lobe pariétal inférieur, le gyrus temporel moyen, le cortex occipital, et le gyrus frontal supérieur ; ont été comparés pour évaluer l'abondance de circRNA à travers des types de tissu. L'analyse des données ARN-seq générées à l'aide de six différents outils de détection de circRNA (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC et CIRCexplorer) a révélé qu'une trousse de préparation totale de la bibliothèque d'ARN échouée avec le prétraitement R r et l'entrée d'ARN de 4 g est l'entrée optimale de l'ARN pour identifier le plus grand nombre relatif de circRNAs. Conformément aux résultats précédents, l'enrichissement le plus élevé des circRNAs a été observé dans les tissus de cerveau comparés à d'autres types de tissu.

Introduction

Les ARN circulaires (CircRNAs) sont des ARN endogènes et non codants qui ont retenu l'attention compte tenu de leur expression omniprésente dans la transcriptome eucaryotique^1,2,3. Ils sont formés lorsque les exons dos-épissage à l'autre et ont donc été initialement considérés comme des artefacts épissage^4,5. Cependant, des études récentes ont démontré que les circRNAs présentent le type de cellule, le tissu, et l'expression spécifique de stade développemental^3,6

Protocol

Cette recherche a été effectuée conformément à toutes les lignes directrices institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain. Des tissus cérébraux ont été obtenus à partir du programme de don de cerveau et de corps du Banner Sun Health Research Institute à Sun City, AZ. Les activités du Programme de dons de cerveauets et de corps sont approuvées par la Western Institutional Review Board (wirB protocol #20120821). Tous les sujets ou leurs représentants légaux ont signé le consentement éclairé. Des biospécimens commerciaux (non cérébraux) ont été achetés chez Proteogenex.

1. Traitement R R R R

Discussion

Dans le cadre de cette étude, deux trousses de préparation de bibliothèques disponibles dans le commerce, des options de prétraitement et des quantités d'ARN d'entrée ont été testées afin d'optimiser un protocole d'enrichissement de l'ARNrc pour la construction de bibliothèques de séquençage circRNA. D'après les évaluations de cette étude, un certain nombre d'aspects clés et d'étapes critiques dans la création de bibliothèques de séquençage circRNA sont apparents. Notre évaluation confirme l'utilit?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µL pipette tips	Rainin	GP-L1000F
20 µL pipette tips	Rainin	SR L 10F
200 µL pipette tips	Rainin	SR L 200F
2200 TapeStation Accessories (foil covers)	Agilent Technologies	5067-5154
2200 TapeStation Accessories (tips)	Agilent Technologies	5067-5153
Adhesive Film for Microplates	VWR	60941-064
AMPure XP Beads 450 mL	Beckman Coulter	A63882	PCR purification
Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates	VWR	951020401
High Sensitivity D1000 reagents	Agilent Technologies	5067-5585
High Sensitivity D1000 ScreenTape	Agilent Technologies	5067-5584
HiSeq 2500 Sequencing System	Illumina	SY-401-2501
HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit	Illumina	PE-410-1001
HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles)	Illumina	FC-410-1002
HiSeq 4000 Sequencing System	Illumina	SY-401-4001
HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2	Illumina	PE-402-4002
HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle)	Illumina	FC-402-4022
Kapa Total RNA Kit	Roche	KK8400
Molecular biology grade ethanol	Fisher Scientific	BP28184
Qubit Assay Tubes	Supply Center by Thermo Fischer	Q32856
Qubit dsDNA High Sense Assay Kit	Supply Center by Thermo Fischer	Q32854
RNA cleanup and concentrator - 5	Zymo	RCC-100	Contains purification columns, collection tubes
RNAClean XP beads	Beckman Coulter Genomics		RNA Cleanup beads
Rnase R	Lucigen	RNR07250
SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units	ThermoFisher (LifeTech)	18064014
TapeStation 2200	Agilent Technologies		Nucleic Acid analyzer
TElowE	VWR	10128-588
TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit	Illumina	20020596	Kit used in section 3
Two-Compartment Divided Tray	VWR	3054-1004
UltraPure Water	Supply Center by Thermo Fischer	10977-015
Universal control RNA	Agilent	740000