小型RNA-seqの改善:バイアスの減少と2'-O-メチルRNAの検出の改善

要約

我々は、標準的な方法よりもバイアスが少ない詳細な小さなRNAライブラリー修復プロトコルと2'-O-メチルRNAの感度の増加を提示する。このプロトコルは、コストを節約するために自家製試薬を使用するか、便宜上キットを使用して従うことができます。

要約

次世代シーケンシング(NGS)による小型RNA(sRNA)の研究は、図書館準備中のバイアス問題に挑戦しています。植物マイクロRNA(miRNA)のようないくつかのタイプのsRNAは、3'末端ヌクレオチドで2'-O-メチル(2'-OMe)修飾を運ぶ。この変更は、3' アダプターのライゲーションを阻害するので、別の難しさを追加します。以前に、'TruSeq(TS)プロトコルの変更バージョンはバイアスが少なく、2'-OMe RNAの検出が改善されたことを実証しました。ここでは、最高の全体的なパフォーマンスを示したプロトコル'TS5'を詳細に説明します。TS5は、同等の性能を持つTSキットの自家製試薬または試薬を使用して従うことができます。

概要

小さなRNA(sRNA)は、生物学的^{プロセス1}の多様性の制御に関与している。真核生物調節sRNAは、通常、サイズが20〜30 ntの間です。主な3つのタイプは、マイクロRNA(miRNA)、ピウィ相互作用RNA(piRNA)、小干渉RNA(siRNA)です。異常なmiRNA発現レベルは、様々な^疾患2に関与している。これは、健康と病気におけるmiRNAの重要性と、sRNA全般を検出するための正確で定量的な研究ツールの要件を強調しています。

次世代シーケンシング(NGS)は、sRNAを研究するために広く使用されている方法です。定量的PCRやマイクロアレイ技術(qPCR)などの他のアプローチと比較したNGSの主な利点は、sRNA配列の事前知識を必要としないため、新しいRNAを発見するために使用できることであり、さらに、より少ないバックグラウンド信号と彩度効果。さらに、単一ヌクレオチドの違いを検出でき、マイクロアレイよりも高いスループットを有する。ただし、NGS にはいくつかの欠点もあります。シーケンス実行のコストは比較的高く、サンプルをシーケンス用ライブラリに変換するために必要なマルチステップ プロセスによってバイアスが発生する可能性があります。典型的なsRNAライブラリー調製プロセスでは、3'アダプターは、ATPが存在しない場合に、RNAリガーゼ2(RNL2)の切り捨てられたバージョンと予備の3'アダプター(図1)を使用してsRNA(多くの場合、全RNAからゲル精製)にライゲーションされます。これにより、sRNAアダプタライゲーションの効率が向上し、sRNAの循環化や連結などの副反応の形成が減少します。続いて、5'アダプターをRNAリガーゼ1(RNL1)によってライゲーションし、続いて逆転転写(RT)およびPCR増幅を行う。これらのステップはすべて、バイアス^3,4を導入する可能性があります。したがって、読み取り数は、人工的な、方法依存性発現パターンにつながる実際のsRNA発現レベルを反映しない場合があります。特定の sRNA は、ライブラリ内で過剰または過小表現され、厳密に表現されていない sRNA が検出を逃れる可能性があります。この状況は、特に植物miRNA、昆虫および植物のsiRNA、および昆虫、線虫および哺乳動物におけるpiRNAで、3'末端ヌクレオチドが2'-O-メチル(2'-OMe)^修飾1を有する。この修飾は、3'アダプタライ^{ゲーション5}を強く阻害し、これらのタイプのRNAに対するライブラリー調製を困難な作業にする。

以前の研究は、アダプタライゲーションがRNA配列/構造効果6、7、8、9、10、11に起因する深刻なバイアスを導入することを実証しました。逆転写やPCRなどのアダプタライゲーションの下流のステップ^{は、バイアス6、11、12}に有意に寄与しない。ライゲーションバイアスは、特定の配列を有するアダプタ分子が反応混合物中のsRNA分子と相互作用して共折を形成し、ライゲーションに有利または好ましくない構成を引き起こす可能性があるという事実に起因する可能性が高い(図2)。Sorefan et al⁷のデータは、RNL1 が単一の孤立したコンテキストを好む一方、RNL2 がライゲーション用の二本鎖を好むことを示唆しています。アダプター/sRNA 共折構造が特定のアダプターと sRNA シーケンスによって決定されるという事実は、特定の sRNA が特定のアダプター・セットで過剰または過小表現される理由を説明します。また、一連の sRNA ライブラリー内で比較する場合は、同じアダプタシーケンスを使用する必要があることも重要です。実際、異なるバーコードシーケンスの導入によってアダプタを変更すると、シーケンス^{ライブラリ9、13}のmiRNAプロファイルが変更されることが以前に観察されています。

ライゲーションジャンクション付近のアダプタシーケンスのランダム化は、これらのバイアスを減らす可能性が高いです。Sorefan^{たちは、4}つのランダムなヌクレオチドを持つアダプターを四肢に使用し、「高精細」(HD)アダプターと指定し、これらのアダプターを使用すると、真のsRNA発現レベルをよりよく反映するライブラリにつながることを示した。より最近の研究は、これらの観察を確認し、無作為化領域がライゲーション接合^部11に隣接する必要がならないことを明らかにした。この新しいタイプのアダプターは"MidRand"アダプターと名付けられました。これらの結果を組み合わせることで、アダプターの設計が改善され、バイアスが軽減される可能性が示されています。

アダプターを変更する代わりに、反応条件の最適化によってバイアスを抑制できます。ポリエチレングリコール(PEG)は、ライゲーション^効率14を高くすることが知られている高分子群集剤であり、^{バイアス15、16}を有意に減少させることが示されている。これらの結果に基づいて、いくつかの「低バイアス」キットが市場に登場しました。これには、古典的なアダプターまたは HD アダプターと組み合わせて、ライゲーション反応に PEG を使用するキットが含まれます。他のキットは、ライゲーションを完全に回避し、^{それぞれ12'}と5'アダプタの追加のための3'ポリアデニル化とテンプレート切り替えを使用します。さらに別の戦略では、3' アダプターライゲーションに続いて循環ステップが続き、5' アダプターライゲーション¹⁷を省略します。

前回の研究では、バイアスの可能な限り低いレベルと2'-OMe RNA¹²の最良の検出を持つsRNAライブラリー調製プロトコルを検索しました。上記の「低バイアス」キットのいくつかをテストし、標準プロトコル(TS)よりも2'-OMe RNAの検出が優れています。しかし、驚くべきことに、修正時(無作為化アダプターの使用、ライゲーション反応におけるPEG、精製による余分な3'アダプタの除去)は、後者が2'-OMe RNAの検出のための他のプロトコルを上回った。ここでは、2'-OMe RNA の全体的な検出が最も優れた TS プロトコル 'TS5' に基づくプロトコルについて詳しく説明します。プロトコルは、TSキットの試薬と'Nf'キットの試薬1つを使用して、または同等の性能を持つ自家製試薬を使用して、お金を節約することができます。また、総RNAからのsRNAの精製と、3'アダプターの準備のための詳細なプロトコルを提供します。

プロトコル

1. 小型RNAの分離

1. フェノール系試薬またはその他の方法を用いて総RNAを抽出する。RNA の品質が良好かどうかを確認します。
2. 200Vで15%のTBE-ureaゲル(材料の表を参照)を15分間事前に実行します。
3. ゲルがプレランニングされている間、5-15 μLの総RNAを5-20 μLの総体積に混合し、同量のホルムアミドローディング色素を含む(材料表、95%脱イオン化されたホルムアミド、0.025%ブロムフェノールブルー、0.025%キシレンシアン、5mM EDTA pH)を20μHの管に混ぜる。同様に、10 μL(200 ng)の小型RNAラダー(材料の表を参照)を同量のホルムアミドローディング色素と混合します。加熱された蓋を持つサーモサイクラーで65°Cで5分間インキュベートし、その後、すぐに氷の上にチューブを置きます。
4. はしごとサンプルを少なくとも1つのレーンで同じゲルに積み込み、ブロモフェノールブルー(ダークブルー)がゲル長の約3分の2(約40分)に移行するまで200Vで走ります。
5. 次のようにゲルからRNAを溶出させるシステムを準備する:21ゲージの針でヌクレアーゼフリー0.5 mLマイクロ遠心管の底部を穿刺する。パンクした0.5 mLチューブをヌクレアーゼフリーのラウンドボトム2mLマイクロ遠心分離管に入れます。
6. ゲルを取り出し、3μL核酸ゲル染色(10,000 x 濃縮物、材料の表を参照)で室温で10〜15分間インキュベートします。
7. 「ダークリーダー」トランスイルミネータでゲルを表示し(これはRNAを損傷する可能性があるため、UVを避けることを強くお勧めします)、17 ntと29 ntのはしごバンドの間のサンプルRNAを切り取ります。ゲル片をステップ1.5から0.5 mLチューブに移します。
8. 2 mLチューブ内の0.5mLチューブをマイクロ遠心分離機で2分間最大速度で遠心分離します 0.5 mL チューブを取り外します。
9. 破砕ゲルを含む2mLチューブにヌクレアーゼフリー0.3M NaClを300μL加え、室温または一晩4°C(16時間)で少なくとも2時間回転させます。
10. 砕いたゲル片の懸濁液をスピンカラム(材料表参照)に移し、マイクロ遠心分離機で最高速度で2分間遠心分離機を使用します。
11. グリコーゲンの1 μL(20 μg/μL)と室温100%エタノールの950 μLを加えます。-80 °Cで少なくとも30分間インキュベートします。
12. 4 °Cのマイクロ遠心分離機の最高速度で20分の遠心分離機。上清を取り出し、800μLの冷たい80%エタノールでペレットを洗浄する。4°Cで5分間再度遠心分離機を、慎重にすべての上清を除去します。ヌクレアーゼフリー水の15 μLでRNAペレットを再中断します。典型的には、入力総RNAの量に応じて、小さなRNAの〜5〜20 ngを回収する必要があります(入力総RNAの1μg当たり小さなRNAの〜1 ng)。
13. 推奨される追加手順:回収されたsRNAの量と質を確認してください(例えば、小さなRNAキットを使用して毛細血管ゲル電気泳動によって、材料の表を参照してください)。

2. 予備3'HDアダプターの準備

注:3'HDアダプタのプリアデニル化は、Chen^ら18によって記述されたプロトコルと同様の方法で行われました。事前に識別可能なアダプターは直接注文できますが(/5rApp/変更)、これは非常に高価です。

1. 注文5'リン酸化、3'ブロック3'HDアダプタオリゴヌクレオチド。シーケンスと変更については、表 1を参照してください。なお、「3AmMO」は3'アミノ修飾群であり、ほとんどのサプライヤーは、この修飾でオリゴヌクレオチドを産生することができる。ヌクレアーゼフリー水を100μMに希釈します。
2. 以下の試薬を含む10μLのオリゴ(100μM)、T4 RNAリゲスバッファーの10μL(10倍)、ATPの10μL(10mM)、50%PEG8000の40μL、T4 RNAリゲス1(50単位)の5μL、25μLの水を含む100μL反応を設定します。20°Cで一晩インキュベートします。
3. 前に行われたオリゴヌクレオチドの古典的なフェノールクロロホルム抽出を行い、続いてエタノール沈殿を行う。100 μL の酸 (pH 4.5) フェノール:クロロホルムおよび渦を加えます。室温、最高速度で5分間スピンします。慎重に新しいチューブに上相の90 μLを転送します。3M酢酸ナトリウムpH 5.2の10 μL、超純血性グリコーゲンの1μL、冷たい100%エタノールの250 μLを加えます。
4. -20 °Cで、最高速度4°Cで30分間、少なくとも30分間-20°Cに保ちます。上清を取り出し、500μL冷たい80%エタノールでペレットを1回洗います。フェノール-クロロホルム抽出およびエタノール沈殿の代替として、ヌクレオチド除去キットを使用することができる(材料の表を参照)。25 μLの水で再中断します。
5. 一本鎖DNAの特定の検出のためのキットを使用してアダプターの濃度を測定します(材料の表を参照)。80 ng/μL (10 μM) に希釈します。
6. 推奨される追加手順:未処理のオリゴヌクレオチドと共に15%TBE-ureaゲル(材料の表)に10 μMアダプターの1μLを移行することにより、前アデニル化の有効性を確認します。前に出されたアダプターは、未処理のオリゴヌクレオチドよりもわずかに遅く移行する必要があります。必要に応じて、予備アダプターはゲル精製することができます。上記のように進みます(手順 1.2-1.12)。

3. ライブラリの準備 - プロトコル TS5

注:我々は、前述^の12を変更したTSプロトコル'TS5'をここに提示し、キットからの試薬または自己提供試薬のいずれかで行うことができる。異なるプロトコル'TS7'で同様またはわずかに良い結果を得たことに留意すべきです。ただし、TS7 では、アダプターダイマーを除去することはより困難です。したがって、TS5 を詳細に記述することをお勧めしますが、TS7 の後にアダプターを交換するだけでよいでしょう。TS7 の場合は、'MidRand-Like (MRL)' アダプター シーケンスを使用します (表 1)。ここでは、ランダム化された領域がアダプターの中央にあることに注意してください。逆転写とPCRのプライマーは、3'アダプターのランダム化領域の下流のシーケンスと、5'アダプター内のランダム化領域のアップストリームにハイブリダイズされます。シーケンスは、5' アダプターの最初のランダム化ヌクレオチドから開始されます。

1. 3'アダプタライゲーション。
   1. 0.2 mLマイクロ遠心管に精製された小型RNA(〜0.1-1 μM)の1 μLと1 μLの予備3'HDアダプタ(10 μM)を組み合わせます。サーモサイクラーで72°Cで2分間インキュベートし、氷の上に直接置きます。
   2. 50%PEG 8000(粘性溶液;ピペット)の4μL(粘性溶液、ピペト)、RNAリガーゼバッファーの1μL(10x)、H2Oの1μL、T4 RNA ligae2切り捨ての1μL、およびRNase阻害剤の1μLを添加する。16 °Cで一晩インキュベートします。
2. 非リガデッド3'アダプターの除去
   1. ヌクレアーゼフリー水を10μL加え、よく混ぜます。Nfキット(材料の表)から3 M NaOAc pH 5.2または「アダプタ枯渇溶液」の6 μLを追加し、よく混ぜます。40 μLの磁気精製ビーズ(材料表)と60μLのイソプロパノールを加え、よく混ぜます。室温で5分間インキュベートします。
   2. 溶液が明確になるまで、サンプルを磁気ラックに入れます。上清を取り除いて捨てます。
   3. 新たに調製した80%エタノールの180μLを加えます。約30sのためにインキュベートし、その後、除去します。新たに調製した80%エタノールを使用し、80%エタノールで長期間インキュベートしないでください。
   4. チューブを簡単に回転させ、井戸の底部に集めた可能性のある残留液を除去します。ビーズを2分間乾燥させ、10 mMトリスpH 8の22 μLまたはNfキットからの再懸濁バッファーで再懸濁させます。2分間インキュベートし、溶液が明確になるまでサンプルを磁化します。
   5. Nfキット(材料の表)から3 M NaOAc pH 5.2または「アダプタ枯渇溶液」の6 μLを新しいチューブに追加します。この新しいチューブに前のステップから上清の20 μLを転送し、ピペッティングによって混合します。40 μLの磁気ビーズと100%イソプロパノールの60μLを加え、ピペッティングでよく混ぜます。5分間インキュベートします。
   6. 溶液が明確になるまでサンプルを磁化し、上清を取り除いて廃棄します。
   7. 新たに調製した80%エタノールの180μLを加えます。約30sのためにインキュベートし、その後、除去します。T akeケアは、新たに調製された80%エタノールを使用し、長期間80%エタノールでインキュベートしないでください。
   8. チューブを簡単に回転させ、井戸の底部に集めた可能性のある残留液を除去します。ビーズを2分間乾燥させ、ヌクレルトフリー水を10μLで再濁させます。2分間インキュベートし、溶液が明確になるまでサンプルを磁化します。
   9. 上清の9 μLを新しいチューブに移します。T4 RNA リゲスバッファー (10x) と 1 μL の水を 1 μL を追加します。または、TS キットから 2 μL のリゲス バッファーを追加します。
3. 5'アダプターのライゲーション。
   1. 5' HD アダプターの 1 μL を追加します (10 μM;表 1)加熱されたふたが付いている熱サイクラーの200 μL PCR管に。70°Cで2分間インキュベートし、その後、氷の上に直接チューブを置きます。
   2. 10 mM ATP の 1 μL と T4 RNA リゲス 1 の 1 μL を追加します。ゆっくりとピペッティングでよく混ぜます。このミックスの3 μLをステップ3.2.9から3'ライゲーションRNAに加え、ピペッティングで混ぜます。28 °Cで1時間インキュベートします。
4. 逆転写 (RT)
   1. 3'および5'アダプターの6 μLを新しい200 μL PCRチューブに移す(必要に応じて後で使用するために-8μLの残りの〜8 μLを保つ)。RTプライマーの1 μLを追加します(10 μM;表 1)ピペッティングでミックスします。70°Cで2分間インキュベートし、その後、氷の上に直接チューブを置きます。
   2. RTに次の試薬を加える:5x第一鎖バッファーの2 μL、12.5 mM dNTPミックスの0.5 μL、100 mM DTTの1μL、RNase阻害剤の1μL、および1 μLの逆転写酵素(材料表)を追加する。50°Cで1時間インキュベートします。
5. PCR増幅
   1. RT反応混合物の12.5 μLに以下の試薬を追加します:PCRポリメラーゼバッファーの10 μL、ユニバーサルP5プライマーの2 μL(10 μM;表 1、2 μL の P7 インデックス プライマー (10 μM;表1、12.5 mM dNTPの1 μL、DNAポリメラーゼ(材料表)の0.5 μL、および22 μLの水。使用するまで氷の上に反応を保ちます。
   2. 次の PCR プログラムを実行する: 30 s の場合は 98 °C、11 サイクル (10 s の場合は 98 °C、30 s は 60 °C、15 s では 72 °C) と 72 °C を 10 分間実行します。
      注:PCRサイクルの数に関して:我々は通常11サイクルを実行しますが、これはユーザーによって最適化されるべきです。可能な限り少ない数の PCR サイクルを実行するようにしてください。
6. ゲル精製
   1. ネイティブの6%TBEゲル(材料の表を参照)と適切なはしご(材料の表を参照)でPCR製品の5、10、20 μLを実行します(材料の表を参照)。145Vで約1時間ゲルを実行します(ブロモフェノールブルーが底に達するまで、この色素は65bpの位置で移動します)。
   2. ゲルを取り出し、核酸ゲル汚れ(材料の表を参照)で10〜15分間水中でインキュベートします。
   3. 「ダークリーダー」トランスイルミネータでゲルを表示し(これはRNAを損傷する可能性があるため、UVを避けることを強くお勧めします)、150 bpでライブラリーバンドを切り取り、ステップ1.5で説明するようにゲルからRNAを溶出し、ゲル片を0.5 mLチューブに移すシステムを準備します。
   4. マイクロ遠心分離機で最高速度2分で遠心分離機を取り外し、0.5 mLチューブを取り外します。
   5. 破砕したゲルを含む2mLチューブに300μLのヌクレアーゼフリー水を加え、室温または一晩4°Cで少なくとも2時間回転させます。
   6. 水中の破砕ゲル片の懸濁液をスピンカラムと遠心分離機に最大速度で2分間移します。
   7. グリコーゲン(20 μg/μL)の1 μL、3M NaOAcの30 μL、975 μLの氷冷100%エタノールを加えます。4 °Cの最高速度で20分の遠心分離機。
   8. 10 mMトリスpH8の20 μLでペレットを再ステースします。濃度測定には1 μL、品質管理には1μLを使用してください。

4. データ分析

注: 以下に説明するデータ分析手順は、Linux オペレーティング システム Ubuntu 16.04 LTS に基づいています。

1. 生のシーケンスファイルの処理
   1. シーケンス実行中に生成された FASTQ シーケンス ファイルをダウンロードします。必要に応じて、bcl2fastq2 (バージョン V2.2.18.12; マニュアルは次のリンクからダウンロードできます) を使用して多重化を実行http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html。
      次のコマンドを使用します。
      nohup Pathway_of_bcl2fastq/bcl2fastq --runfolder-dir Pathway_of_Run --無視欠落-bcl --出力-dir Pathway_of_Output_Directory --バーコードミスマッチ 1 --集約タイル AUTO -r 16 -d 16 -p 16 -w 16
   2. Cutadapt 19 バージョン^1.15を使用してアダプター シーケンスを削除します。マニュアルはこちらからダウンロードできます: https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/guide.html。
      次のコマンドを使用します。
      パスウェイ_to_カットアダプト/カットアダプト -A TGGAATTCTCGGGTCAAGG -n 5 -O 4 -m 10 -j 0 --nextseq-trim 10 -o出力_File_Read1_cutadapt.fastq.gz入力_File_Read1.fastq.gz
      コマンドのシーケンスは、4つのランダムなヌクレオチドなしで3'HDアダプタに対応することに注意してください。したがって、これらの手順では削除されません。
   3. シーケンシング読み取りにおける末端ランダムヌクレオチドの除去には、seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) を使用します。次のコマンド (太字の変数名) を使用します。
      seqtk トリムフク -b 4 -e 4出力_ファイル_読み取り1_カットアダプト.fastq >出力_ファイル_読み取り1_トリミング.fastq
   4. 10 nt より短いシーケンスを破棄するには、次の awk コマンドを使用します。
      awk 'BEGIN { FS = "\t" ;OFS = "\n" } {ヘッダー = $0 ; ゲトリライン qeq ; getline qeq ; ゲトリライン qseq ; if (長さ(seq) >= 10) {印刷ヘッダー、seq、qeq、qseq}}' 出力_File_Read1_trimmed .fastq>長さフィルタリング済み
2. トリミングされたシーケンスのマッピング
   1. miRBaseから研究の生物に対応するデータベースをダウンロードしてください。http://www.mirbase.org/ftp.shtmlに移動し、'mature.fa' ファイルをダウンロードします。配列はRNA表記で示されている点に注意してください。U 残渣を T で置き換えるには、次のコマンドを使用します。
      sed -i '/^>/!s/U/T/g' 成熟した.fa
      注:これは、様々な生物に由来するmiRBase内のすべてのmiRNAの完全なリストを生成します。
   2. 次のコマンドを使用して、対象の生物の miRNA シーケンスを選択します。
      awk 'name_of_the_organism{印刷; nr[NR+1]; 次 };NR の成熟した.fa > 成熟した_名前_of_the_組織_mirs.fa
   3. Bowtie2²⁰ (バージョン 2.3.0) を使用して、読み取りを上記で作成したファイルにマップし、不一致を許しません。まず、次のコマンドを使用してファイルのインデックスを作成します。
      bowtie2-ビルド成熟した_name_of_the_organism_mirs.fa 成熟した_name_of_the_organism_mirs
   4. シーケンス読み取りをデータベースに合わせ、読み取りがデータベースの miRNA に完全にマップされ、不一致が生じずに必要になります。この目的のために、次のツールを使用します。
      bowtie2 -N 0 -L 10 --スコア分 C,0,0 --エンドツーエンド --時間 -x 成熟_name_of_the_organism_mirs -U長さ_フィルタリングされた.fastq -S長さ_Filtered_ALIGNMENT.sam
      注: オプション: --score-min C,0,0,0 は、位置合わせに不一致がないことを保証します。ツールのさまざまなパラメータの説明については、次のウェブサイトをご覧くださいhttp://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml
   5. 整列しなかった読み取りを破棄するには、次のコマンドを使用します。
      サムツールビュー -F 4長さ_フィルタリング_アライメント.sam >読み取り_aligned_to_Mirs.sam
      注: これらの手順の結果、miRNA に対応する整列された読み取りを取得する必要があります。

結果

重要なステップは、開始総RNA材料(図3)および所望の最終ライブラリー産物(図4)の小さなRNA分率の単離である。両方のステップは、ポリアクリルアミドゲル精製を含みます;小さなRNAは15%TBE尿素ゲルから単離され、最終ライブラリーは6%天然TBEゲルから単離されます。ゲルから単離された小さなRNAは、小さなRNA毛細血管電気泳動チップ(材料の表;...

ディスカッション

小さなRNAライブラリーの準備は、主にアダプタライゲーションステップ中に導入されるバイアスのために困難なままです。植物miRNA、昆虫、線虫および哺乳類のpiRNA、昆虫および植物における小さな干渉RNA(siRNA)のような3'末端に2'-OMe修飾を伴うRNAは、2'-OMe修飾が3'アダプターリゲーションを阻害するので、特に研究が困難である。sRNAライブラリー調製プロトコルを改善するために多くの解決策...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2939BA
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)	ThermoFisher	AM9720
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)	Nex England Biolabs	P0756S
Agencourt AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63880
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit	Agilent	5067-4626
Bioanalyzer Small RNA Kit	Agilent	5067-1548
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters	Sigma Aldrich	CLS8162-96EA
Dark Reader transilluminator	various suppiers
HotStart PCR Kit, with dNTPs	Kapa Biosystems	KK2501
NEXTflex small RNA-seq V3 kit	BIOO Scientific	NOVA-5132-05	optional
Novex TBE gels 6%	ThermoFisher	EC6265BOX
Novex TBE Urea gels 15%	ThermoFisher	EC6885BOX
QIAquick Nucleotide Removal Kit	Qiagen	28304
Qubit 4 Quantitation Starter Kit	ThermoFisher	Q33227
Qubit ssDNA Assay Kit	ThermoFisher	Q10212
RNA Gel Loading Dye (2X)	ThermoFisher	R0641
RNA Gel Loading Dye (2X)	ThermoFisher	R0641
RNase Inhibitor, Murine	Nex England Biolabs	M0314S
SuperScript IV Reverse Transcriptase	ThermoFisher	18090200
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain	ThermoFisher	S11494
T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)	Nex England Biolabs	M0204S
T4 RNA Ligase 2, truncated	Nex England Biolabs	M0242S
TrackIt 50 bp DNA ladder	ThermoFisher	10488043
TruSeq Small RNA Library Prep Kit	Illumina	RS-200-0012/24/36/48	optional
UltraPure Glycogen	ThermoFisher	10814010
XCell SureLock Mini-Cell	ThermoFisher	EI0001
XCell SureLock Mini-Cell	ThermoFisher	EI0001
ZR small RNA ladder	Zymo Research	R1090
			the last two numbers correspond to the set of indexes