C.エレガンス胚発生を解析するセミハイスループットイメージング法とデータ可視化ツールキット

要約

本研究では、80~100 C.エレガンス胚の3Dタイムラプスイメージングを1回の夜間実行で可能にするセミハイスループットプロトコルについて説明します。さらに、データ分析を合理化するために、画像処理ツールと視覚化ツールが含まれています。カスタムレポーター株とこれらの方法の組み合わせは、胚発生の詳細なモニタリングを可能にします。

要約

C.エレガンスは、胚発生時の細胞運命仕様と形態形成過程の系統的解析のための最高のシステムです。1つの課題は、胚発生が約13時間にわたって動的に展開することです。この半日のタイムスケールは、画像化できる胚の数を制限することによって実験の範囲を制限している。ここでは、1回の夜間実行で、中程度の時間分解能で80~100個の胚の同時3Dタイムラプスイメージングを可能にするセミハイスループットプロトコルについて説明します。プロトコルは簡単で、ポイント訪問容量の顕微鏡へのアクセスを持つ任意の実験室によって実装することができる。このプロトコルの有用性は、生殖層の仕様および形態形成の主要な側面を視覚化するために最適化された蛍光マーカーを発現する2つのカスタム構築された株を画像化することによって実証される。データを分析するために、すべてのチャネル、Z ステップ、およびタイムポイントで、より広い視野から個々の胚をトリミングし、各胚のシーケンスを別々の tiff スタックに保存するカスタム プログラムが作成されました。ユーザーフレンドリーなグラフィカルユーザーインターフェイス(GUI)を含むプログラムは、可視化または自動分析の準備のために個々の胚を分離、前処理、均一に指向することにより、データ処理を合理化します。また、個々の胚データをマルチパネルファイルにコンパイルし、各時点で各胚の最大強度蛍光投影と明視野画像を表示するImageJマクロも提供されています。本明細書に記載されているプロトコルおよびツールは、40の前に説明した発達遺伝子のノックダウン後に胚発生を特徴付けるためにそれらを使用することによって検証された;この分析は、以前にアノトされた発達表現型を可視化し、新しいものを明らかにした。要約すると、この研究では、クロッピングプログラムとImageJ可視化ツールを組み合わせた半ハイスループットイメージング法の詳細を説明し、有益な蛍光マーカーを発現する株と組み合わせることで、実験を大幅に加速して分析します。胚。

概要

C.エレガンス胚は、機械学的細胞生物学のための重要なモデルシステムであり、胚発生を駆動する細胞運命の仕様と形態形成過程の解析1、2、3、4 ^,5,6,7,8,9.現在までに、胚における細胞レベルの事象と細胞運命仕様の両方の特徴付けの多くは、比較的高い時間分解能を1回に1回のイメージング実験(すなわち、10~100s毎に取得)を用いて達成されてきた。蛍光マーカー。数秒から数十分の順序でのイベントには適していますが、このアプローチは、時間単位から数日の順序で、より長いプロセスの特性評価を技術的に制限するようになります。最初の切断から伸びの終わりまでの胚の発達は約10時間かかります。この時間スケールでは、胚のより大きなコホートの同時に低い時間分解能イメージング(すなわち、5〜20分の時間間隔での取得)を可能にするセミハイス....

プロトコル

1. セミハイスループットイメージングのためのC.エレガンス胚の準備

注:プロトコルのこの部分の目的は、半同期(2〜8細胞段階)C.エレガンス胚の集団を、適切なマーカー株から解剖し、イメージング用のガラス底384ウェルプレートにロードすることです。他のプレートフォーマットも機能する可能性がありますが、384ウェルプレートは、小さなウェルサイズが比較的小さな領域への胚の広がりを制約するため、タイムラプスイメージングのために複数の胚を含むフィールドの同定を容易にするため、好ましい。胚を大まかに同期させることで、現場の胚ごとに開発の完全な過程が確実に捕捉されます。

1. 氷冷M9培地に溶解したテトラミソール塩酸塩(TMHC)麻酔薬の0.1mg/mL溶液を5~10mL調製し、氷冷M9培地(0.45M Na₂HPO₄∙7H2O、0.11 M KH₂PO_4、0.04M NaCl、0.09 M_NH4Cl)を使用する解剖およびイメージング。この媒体は、孵化した幼虫を動かすことが初期の発達段階で胚のイメージングを妨げないことを保証する麻酔薬を含む。
   注:トリミングおよび可視化ツールを....

結果

C.エレガンス胚発生に対する分子摂動の影響を特徴付ける上で重要な課題は、胚が最初の切断から20°16で伸びの終わりまで進行するのに約10時間かかることです。胚の大きなコホートを同時に画像化できるセミハイスループット法は、各条件に対して十分なアンサンブルサイズと並行して複数の条件をイメージングできるため、このタイムスケールのイベントに役立ち.......

ディスカッション

この研究では、C.エレガンスにおける胚発生における遺伝子の機能をプロファイリングするために、より大規模な取り組みを可能にするために開発された一連のツールと方法について説明します。当社のセミハイスループット法により、1回の実験で80~100個の胚に対して20分分解能で胚発生の3Dタイムラプスイメージングが可能です。このプロトコルは任意の所望のマーカー株で使用する.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator Tube Assembly	Drummond Scientific	2-000-000
Calibrated Pipette (25mL)	Drummond Scientific	2-000-025
Cell Voyager Software	Yokogawa Electric Corp	Included with CV1000
Conical Tube (15 mL )	USA Scientific	1475-0501
CV1000 Microscope	Yokogawa Electric Corp	CV1000
Depression slide (3-well)	Erie Scientific	1520-006
Dissection Microscope	Nikon	SMZ-645
Eppendorf Centrifuge 5810R	Eppendorf	5811 07336
ImageJ/FIJI	Open Source	https://imagej.net/Fiji
M9 Buffer	Lab Prepared	https://openwetware.org/wiki/M9_salts
Microcentrifuge Tube (1.5 mLl)	USA Scientific	1615-5500
Microseal F-foil Seal	Bio-Rad	MSF1001
NGM Plates	Lab Prepared	http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
Scalpel #15	Bard Parker	REF 371615
Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom	Greiner Bio-One	781855
Tetramisole Hydrochloride	Sigma Aldirch	T1512-10G
Tweezers, Dumont #3	Electron Microscopy Sciences	0109-3-PO
U-PlanApo objective (10× 0.4NA)	Olympus	1-U2B823
U-PlanApo objective (60× 1.35 NA)	Olympus	1-U2B832