Динамика олигомеризации рецепторов поверхности клеток в живых клетках с помощью общей внутренней флуоресценции в сочетании с анализом числа и яркости

Резюме

Мы описываем подход к визуализации для определения среднего олигомерного состояния mEGFP-тегами-рецепторами олигомеров, индуцированных связыванием лиганд в плазменной мембране живых клеток. Протокол основан на микроскопии Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) в сочетании с анализом числа и яркости (N и B).

Аннотация

Несмотря на важность и повсеместность олигомеризации рецепторов, для обнаружения событий кластеризации и измерения степени кластеризации применяется несколько методов. Здесь мы описываем подход к визуализации для определения среднего олигомерного состояния mEGFP-тегами-рецепторами гомокомплексов в мембране живых клеток. Протокол основан на микроскопии Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) в сочетании с анализом числа и яркости (N и B). Н З/Б - это метод, похожий на флуоресценцию-корреляционную спектроскопию (FCS) и фотон, считающий гистограмму (PCH), которые основаны на статистическом анализе колебаний интенсивности флюорофорора, распространяющихся в и из освещения объема во время наблюдения. В частности, Н И Б является упрощением ПХГ для получения информации о среднем количестве белков в олигомерных смесях. Амплитуды интенсивности описываются молекулярной яркостью фторофора и средним количеством флюорофоров в объеме освещения. Таким образом, Н З/Б рассматривает только первый и второй моменты распределения амплитуды, а именно, средняя интенсивность и дисперсия. Это, в то же время, сила и слабость метода. Поскольку учитываются только два момента, Н И Б не может определить моляровую фракцию неизвестных олигомеров в смеси, но она оценивает только среднее состояние олигомеризации смеси. Тем не менее, он может быть применен к относительно небольшим сериям времени (по сравнению с другими методами) изображений живых клеток на пиксельной основе, просто отслеживая временные колебания интенсивности флуоресценции. Это уменьшает эффективное время на пиксель до нескольких микросекунд, что позволяет приобретения в диапазоне секунд до миллисекунд, что необходимо для быстрой кинетики олигомеризации. Наконец, можно исследовать большие клеточные области, а также субклеточные отсеки.

Введение

Мы описываем подход к визуализации Total Internal Reflection Fluorescence-Number и Brightness (TIRF-N'amp;B) для определения среднего олигомерного состояния молекул рецепторов в плазменной мембране живых клеток, направленных на увязку рецепторной сборки динамика к биологической функции белков(Рисунок 1).

При внеклеточном связывании лиганд рецепторы инициируют трансдукцию внутриклеточного сигнала в зависимости от их конформации, олигомеризации, потенциальных корецепторов и мембранного состава. Несмотря на важность и повсеместность олигомеризации рецепторов, признанных ключевым событием в клеточной сигнализации

протокол

1. Подготовка образцов

1. День 1. Семена HeLa клетки в полной среде в концентрации 100000-200000 клеток / мл в стеклянно-нижней посуды. Семена 6-8 реплицировать блюда.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере среда дополняется 10% теплоинактивированной сывороткой плода (FBS), 1 мМ пируватом натрия, 100 U/100 мкг пенициллина/стрептомицина. Несколько реплицировать блюда готовятся.
2. День 2-3. Когда клетки находятся на суб-сфолентности, трансфектная половина посуды с плазмид протеином и вторая половина с плазмидами справки (мономер омичьей и dimer), в среде сыворотки-свободной.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Трансфекция производится в сыворотке своб....

Результаты

Результаты по двум репрезентативным клеткам HeLa-mEGFP-FGFR1, посеянным в одной и той же культуре, показаны на рисунке 5 и дополнительной таблице 1. Две клетки были захвачены в то время 0 мин(рисунок 5A, сверху) и 7 мин(?.......

Обсуждение

Н ЗБи требует нескольких мер предосторожности при выборе модели ячейки и стратегии маркировки. Он может быть применен только к живым клеткам, которые остаются пристежными во время захвата изображения. Дополнительные колебания из-за всего жесткого смещения ячейки могут быть обработан?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software.	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Albumin from Bovine Serum 98% minimun	Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA	A7906-100G
DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	21063029	Used serum free for microscopy
DMEM high-glucose GlutaMAX I	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10566-016	Used for complete medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)	Biowest, Nuaillé, France	X0515-500
Emission splitting system Photometrics DV2	TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10270106	10% inactivated supplement for complete medium
Glass bottom 35-mm sterile 1.5 dishes	MatTek, Ashland, MA, USA	P35G-0.170-14-C	uncoated, glass thickness 0.17 microns
GraphPad Prism	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells	Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany	CB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software	Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK		This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series
Matlab Executable N&B routine	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018b	The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA		download at https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x	Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA	LONZA 17-602E	supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100U/100µg.
pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector	Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy		Zamai et al., 2019
pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		Hellriegel et al., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		Hellriegel et al., 2011
Recombinant FGF2	PeproTech EC, Ltd., London, UK		Ligand solution: 20ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.
Sodium pyruvate GIBCO	ThermoFisher Scientific	11360070	1mM supplement for medium
TransIt-LT1 Transfection Reagent	MirusBio LLC, Madison, WI, USA	MIR 2300
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	25200056
Type F Immersion liquid 10 mL	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	AM2618	0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections