Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы описываем подход к визуализации для определения среднего олигомерного состояния mEGFP-тегами-рецепторами олигомеров, индуцированных связыванием лиганд в плазменной мембране живых клеток. Протокол основан на микроскопии Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) в сочетании с анализом числа и яркости (N и B).

Аннотация

Несмотря на важность и повсеместность олигомеризации рецепторов, для обнаружения событий кластеризации и измерения степени кластеризации применяется несколько методов. Здесь мы описываем подход к визуализации для определения среднего олигомерного состояния mEGFP-тегами-рецепторами гомокомплексов в мембране живых клеток. Протокол основан на микроскопии Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) в сочетании с анализом числа и яркости (N и B). Н З/Б - это метод, похожий на флуоресценцию-корреляционную спектроскопию (FCS) и фотон, считающий гистограмму (PCH), которые основаны на статистическом анализе колебаний интенсивности флюорофорора, распространяющихся в и из освещения объема во время наблюдения. В частности, Н И Б является упрощением ПХГ для получения информации о среднем количестве белков в олигомерных смесях. Амплитуды интенсивности описываются молекулярной яркостью фторофора и средним количеством флюорофоров в объеме освещения. Таким образом, Н З/Б рассматривает только первый и второй моменты распределения амплитуды, а именно, средняя интенсивность и дисперсия. Это, в то же время, сила и слабость метода. Поскольку учитываются только два момента, Н И Б не может определить моляровую фракцию неизвестных олигомеров в смеси, но она оценивает только среднее состояние олигомеризации смеси. Тем не менее, он может быть применен к относительно небольшим сериям времени (по сравнению с другими методами) изображений живых клеток на пиксельной основе, просто отслеживая временные колебания интенсивности флуоресценции. Это уменьшает эффективное время на пиксель до нескольких микросекунд, что позволяет приобретения в диапазоне секунд до миллисекунд, что необходимо для быстрой кинетики олигомеризации. Наконец, можно исследовать большие клеточные области, а также субклеточные отсеки.

Введение

Мы описываем подход к визуализации Total Internal Reflection Fluorescence-Number и Brightness (TIRF-N'amp;B) для определения среднего олигомерного состояния молекул рецепторов в плазменной мембране живых клеток, направленных на увязку рецепторной сборки динамика к биологической функции белков(Рисунок 1).

При внеклеточном связывании лиганд рецепторы инициируют трансдукцию внутриклеточного сигнала в зависимости от их конформации, олигомеризации, потенциальных корецепторов и мембранного состава. Несмотря на важность и повсеместность олигомеризации рецепторов, признанных ключевым событием в клеточной сигнализации1,2,3,4,5,6, 7, несколько методов могут обнаружить события кластеризации и измерить степень кластеризации экспериментально8,9. Конфокальный объем (x,y'300 nm, z z 900 nm) недостаточно решен для доказательства молекулярного взаимодействия и стоихиометрии, даже после оптимизации алгоритмами восстановления изображения10. Подедины состав белковых олигомеров не может быть решен на чисто пространственной основе даже с помощью супер-разрешения методов на х, разрешение 20-70 нм, таких как PALM11, STORM12, и STED13. Более того, их временное разрешение (в порядке минут на изображение) не может следовать за кинетиками в диапазоне секунд. Одномолекулярная ступенчатое отбеливание разрешает стойихиометрию белковых олигомеров только в том случае, если они неподвижны14.

Одним из наиболее универсальных методов измерения плотности и олигомеризации флуоресцентно отмеченных белков в пределах одного изображения является анализ распределения пространственной интенсивности (SpIDA), который опирается на пространственную выборку. Он применим как к химически фиксированным, так и к живым клеткам, и позволяет анализировать несколько областей, представляющих интерес для клетки, одновременно с помощью стандартной флуоресценции15. Кроме того, методы момента, такие как флуоресценция-корреляция спектроскопии (FCS)16, фотон подсчета гистограммы (PCH)17, и количество и яркость (N и B)18,19, подходят для количественного олигомера Измерения. Эти методы анализируют колебания интенсивности флуоресценции, которые могут наблюдаться во времени, когда фторфоры рассеивается в и из объема освещения. Амплитуда колебаний интенсивности можно однозначно описать молекулярной яркостью флюорофора (к) и средним количеством флюорофоров (n) в пределах объема освещения17 (Рисунок 2). Как правило, коэффициент диффузии фторфоров и среднее количество молекул (обратно связанных с значением G(0) в пределах объема освещения могут быть получены FCS20. Однако, так как время диффузии только масштабируется с кубической корнем массы, FCS не является достаточно чувствительным для обнаружения изменений в молекулярной массе21. На практике, один цвет FCS не может обнаружить димеризацию мембранных рецепторов. PCH разрешает смеси различных олигомеров точно. Используя более двух мгновений распределения амплитуды, он обнаруживает молекулы разной яркости, которые занимают один и тот же объем освещения. Сканирование FCS22 и разработки, такие как интересная парно-корреляция молекулярной яркости (pCOMB) подход23, введены для расширения диапазона применимости методов корреляции флуоресценции в биологических системах24 , остаются одноточечными методами, не имеющими возможности быстрых измерений на большой площади ячейки, требующих много последовательных наблюдений на каждом пикселе и получения данных в порядке секунд.

Н З/Б является упрощенной версией PCH, которая учитывает только первый и второй моменты амплитуды распределения флуоресценции, а именно, средняя интенсивность, lt; I'gt;, и дисперсия,No 2 (Рисунок 2)18,19 и, из-за этого, он не может определить моляровую фракцию неизвестных олигомеров в смеси, а лишь оценивает среднее состояние олигомеризации смеси. Тем не менее, Н И Б имеет то преимущество, что работает с относительно меньшими временные ряды изображений живых клеток, чем PCH на пиксель за пикселем основе, просто путем мониторинга колебаний во времени флуоресценции интенсивности. Поскольку Н И Б сокращает время за пикселем до нескольких микросекунд, он может следить за быстрой кинетикой олигомеризации на больших клеточных площадях, позволяя присугнять изображение в временной шкале секунд в сканирующей микроскопии (например, confocal, 2-фотон) и миллисекундах микроскопии на основе камеры (например, TIRFM).

В нескольких докладах была продемонстрирована способность Н И Б количественно очислять количество субъединиц в белковых кластерах с помощью визуализации расширенных клеточных регионов. Кластеры Paxillin-EGFP были обнаружены на участках адгезии в клетках CHO-K125,а внутриклеточная агрегация патогенного пептида Httex1p была описана в клетках COS-726. Н З/Б был применен для следующих лиганд-управляемых олигомеризации рецептора ErbB27, и влияние лиганд FGF21 на Klothob (KLB) и FGFR1c в клетках HeLa28. Сочетание tIRF изображений и N и B анализ был использован, чтобы показать, что динамин-2 в первую очередь тетрамерические всей клеточной мембраны29. Мы применили N и B как raster сканирования и TIRF изображения доказать лиганд-управляемый димеризации uPAR и FGFR1 клеточных мембранных рецепторов30,31.

Методы корреляции флуоресценции, такие как Н И Б, FCS и PCH, основаны на том, что в открытом томе число частиц следует за распределением Пуассона. Потому что только фотоны, что фторофоры излучают могут быть обнаружены, среднее значение для измеренной интенсивности флуоресценции по сравнению со временем в пикселе изображения, figure-introduction-6608 является продуктом среднего количества флюорофоров в объеме освещения,, и их молекулярная яркость, No17:

figure-introduction-6820

где выражено как количество фотонов, испускаемых на единицу времени (обычно в секунду) на молекулу, когда молекула находится в центре объема освещения.

Яркость является свойством каждого фторофора в данном приобретении создана, в то время как интенсивность сумма всех взносов от всех фторофоров. В биологических конкурсах, яркость будет увеличиваться с увеличением числа флюорофоров, которые колеблются вместе, давая информацию о состоянии олигомеризации флуоресцентно помечены белка. Амплитуда колебаний на данном пикселе измеряется из дисперсии сигнала флуоресценции,No 2:

figure-introduction-7539

Где среднее значение квадрата figure-introduction-7646 интенсивности, и квадрат среднего figure-introduction-7735 интенсивности, , вычисляются из индивидуальных значений интенсивности в каждом пикселе каждого кадра:

figure-introduction-7920

где K — это количество общих кадров в временных рядах. Экспериментально необходимо вычислить для всей серии изображений дисперсию, описывающая рассеяние значений индивидуальной интенсивности на каждом пикселе одного изображения вокруг значения средней интенсивности. Разница включает в себя все колебания разного происхождения. В первом приближении, дисперсия из-за рассеяния частиц в объеме освещения,20, могут быть отделены от дисперсии из-за шума выстрела детектора,2d. Эти два отклонения являются независимыми; таким образом, общая дисперсия дается их сумма:

figure-introduction-8641

Разница, из-за молекулярных колебаний в и из объема обнаружения, линейно зависит от молекулярной яркости и интенсивности:

figure-introduction-8868

Перестановка eq. 6 в соответствии с eq. 1:

figure-introduction-9016

Согласно типичной концепции флуоресценции корреляции спектроскопии, уравнение 7 гласит, что дисперсия из-за количества колебаний зависит от квадрата яркости частицы.

Затем, дисперсия из-за колебаний детектора является линейной функцией обнаруженной интенсивности, при предположении, что детектор работает ниже предела насыщения19:

figure-introduction-9504

В случае фотонововых детекторов 1и с0, таким образом, дисперсия детектора равна средней интенсивности:

figure-introduction-9731

Чтобы применить эти понятия к реальным измерениям в живых клетках, Gratton и его коллеги18 определяют кажущуюся яркость, B, для каждого пикселя как соотношение дисперсии над средней интенсивностью:

figure-introduction-10059

B является параметр, который измеряется экспериментально. В этой работе, временные ряды изображения рецепторов FGFR1 на плазменной мембране клеток HeLa захвачены tIRF микроскопии и средняя кажущаяся яркость, B, определяется анализом N и B. Затем, после добавления FGF2, последовательные временные ряды фиксируются, чтобы следить за изменениями в самосборке молекул рецепторов на поверхности мембраны после стимуляции рецептора каноническим лигандой.

Однако, поскольку детектором микроскопа TIRF является камера EMCCD, выражение видимой яркости должно быть изменено как19:

figure-introduction-10790

где смещение является смещение интенсивности обнаружения электроники, что является характерной для настроек детектора. Дисперсия и средняя интенсивность для аналогового детектора, соответственно, даются:

figure-introduction-11110

где G является аналоговым увеличением в цифровых уровнях (DL/фотоны), S, цифровые уровни на фотон19, дается наклон интенсивности против дисперсии участка для источника света с постоянной интенсивностью (без временных колебаний). Коэффициент q связан с формой объема обнаружения пикселей. По данным Hassler et al.32, коэффициент q равен 0,3 для tIRF изображения, работающего при максимальном выигрыше камеры обнаружения19. Параметры смещения, S и G являются характеристиками камеры и микроскопа. Очевидная яркость, B, получена путем перестановки eq. 11 в соответствии с eq. 12 и 13:

figure-introduction-11880

Экспериментально, является сложной функцией интенсивности лазера и эффективности обнаружения системы. Тем не менее, поскольку B/S линейно зависит от К, важно определить только относительную стоимость к для данного режима обнаружения:

figure-introduction-12220

где « пропорционально К. Тем не менее, калибровка выполняется с помощью внутренней ссылки.

протокол

1. Подготовка образцов

  1. День 1. Семена HeLa клетки в полной среде в концентрации 100000-200000 клеток / мл в стеклянно-нижней посуды. Семена 6-8 реплицировать блюда.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере среда дополняется 10% теплоинактивированной сывороткой плода (FBS), 1 мМ пируватом натрия, 100 U/100 мкг пенициллина/стрептомицина. Несколько реплицировать блюда готовятся.
  2. День 2-3. Когда клетки находятся на суб-сфолентности, трансфектная половина посуды с плазмид протеином и вторая половина с плазмидами справки (мономер омичьей и dimer), в среде сыворотки-свободной.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трансфекция производится в сыворотке свободной среде дополняется антибиотиками, 0,1% Бовин сыворотки Альбумин и 25 мМ HEPES буфер, без фенола красного.
  3. День 3-4. Убедитесь, что транс-инфицированные клетки придерживаются нижней части посуды и клеточной мембраны флуоресцентные. Откажитесь от посуды с заросшими клетками или с очень низкой флуоресценцией.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте клеткам перерастать. Клетки должны быть хорошо распределены и должны быть привязаны к стеклянной области блюда(рисунок 1А). Предварительно покрытая стеклянная донная посуда может быть использована для благоприятствования сливк клеток. Культура клеток проверяется на наличие микоплазмы перед любым экспериментом. В этом примере клетки трансфицируются плазмидом (A207K)mEGFP-FGFR1, а эталонные клетки трансфицируются плазмидами GPI-(A207K) с использованием стандартных протоколов. Для живой клеточной микроскопии рекомендуется среда, свободная от индикаторов; 25 mM HEPES буфер добавляется для предотвращения изменений рН во время изображения.

2. TIRF Изображений - Выравнивание лазерной линии и оптимизация TIRF освещение

  1. За четыре часа до начала эксперимента активируйте температурный инкубатор микроскопа при температуре 37 градусов По Цельсию.
  2. Включите микроскоп, компьютеры и камеры и ждите, пока камеры достигнут надлежащей рабочей температуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочая температура камеры, используемой в данном исследовании, составляет -75 градусов по Цельсию.
  3. Поместите немного капли масла на цель. Положите образец блюда на место. Закройте двери инкубатора и дайте температуре блюда уравновеситься (10 мин).
  4. Включите лампу эпифлюоресценции и лазер 488 нм.
  5. Выберите режим контраста эпифлюоресценции, чтобы исследовать образец, ища клетку, чтобы сосредоточиться на глаз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование флуоресцентной лампы для поиска клеток корыта глаз не является обязательным. Вместо этого можно использовать подходящую лазерную линию.
  6. Выберите правильный фильтр для сбора зеленого выброса через микроскоп камеры (Band Pass Ex 490/20 (500) Band Pass Em 525/50, или аналогичный.
  7. Переключитесь с глазного на порт камеры (камера #1 в режиме 1)в режиме эпифлюоресценции, уточните фокус и переключитесь на режим TIRF. Режимы Epifluorescence и TIRF могут быть названы с другой номенклатурой в зависимости от марки микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Там могут быть проблемы фокусировки или выравнивания лазера, если Есть нет флуоресцентных маркеров на интерфейсе coverslip. Чтобы выровнять лазер правильно (необходимо для хорошего TIRF), сосредоточьтесь на coverslip. Часто очень трудно определить, находится ли в центре внимания покрытие. В качестве предложения сосредоточьтесь на краях клеток.
  8. Активируйте автоматическое выравнивание в соответствии с инструкциями микроскопа TIRF.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кратко, для шагов от 2.4 до 2.8, сперва находите клетки через ocular и фокусируйте на их, после этого посылайте излучение к порту камеры микроскопа TIRF, перефокусируйте клетки на экране компьютера микроскопа и активируйте процедуру для выравнивания лазера. Выравнивание состоит в поиске критического угла, под которым освещение становится эвакуационным(рисунок 3). Коммерческие микроскопы могут иметь несколько иные протоколы выравнивания, а также быть полностью автоматизированы; другие могут иметь небольшую камеру для облегчения визуализации критических условий угла.
  9. Выберите подходящую глубину освещения и оптимизируйте направление эвакуационного поля(рисунок 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Глубина проникновения сохраняется постоянной для всех элементов управления и образцов.

3. TIRF Изображений: Захват серии времени

  1. Определите область интереса (ROI) не менее 256 х 256 пикселей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом настройке, захват осуществляется с камерой #2 под программным обеспечением, которое непосредственно контролирует только камеру (см. Рисунок 1 легенда).
  2. Установите воздействие на 1 мс и EM получить до 1000 (это фактор G в eq. 12 и 13). При такой скорости может потребоваться регулировка или увеличение мощности лазера. Здесь мощность лазера составляет 0,5 мВт.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от типа камеры и пределов, установленных коэффициентом диффузии белка, интенсивностью флуоресценции и фоном, общие критерии для установки лазерной мощности не насыщают детектор, минимизируют фотоотрубение и захватывают как быстро, как это возможно на разумные S / N. Прибыль EM всегда устанавливается на максимуме камеры (см. Введение).
  3. Запустите первую пробную последовательность в начальных условиях и приблизительно оцените значение S/N. Условия приемлемы на S/N 2-3 или выше, как измеряется в первом кадре первого тайм-ряда.
  4. Используйте ползунок системы расщепления выбросов, соединяющей камеру #2 микроскопом для маскировки стороны изображения(Рисунок 1B, Рисунок 4A-B)
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом настройке многоканальный разъем изображения устанавливается на камеру #2, чтобы позволить приобретение двух пространственно идентичных изображений одновременно. Система оснащена слайдами для установки различных фильтров для выбросов. Один из ползунок монтирует черную маску, чтобы покрыть сторону изображения. Область в маске используется для внутренней калибровки каждой временной серии для определения параметров камеры (eq. 12 и eq. 13). Таким образом, нет необходимости в независимом шаге калибровки и, что немаловажно, калибровка выполняется параллельно захвату каждой временной серии. При отсутствии этой системы камера может быть откалибрована при применении опубликованных протоколов33.
  5. Выберите опцию автоматического сохранения файла камеры.
  6. Начните приобретение серии изображений. Приобретите минимум 700 кадров при минимальном соотношении S/N 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество кадров, необходимых для анализа, зависит от устойчивости образца к фотоотбелению и от дисперсии данных. Таким образом, качество каждой временной серии оценивается в ходе анализа N и B.
  7. Не вынимая блюдо из микроскопа, добавьте лиганд.
  8. Выберите клетку с яркой флуоресценцией мембраны и быстро начать первый раз серии кинетической перспективе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если добавление лиганда выполняется быстро, этот первый захват устанавливает точку 0 времени лиганды кинетики. Программное обеспечение регистрирует точное время захвата.
  9. Обыщите вторую ячейку и приобретите вторую точку времени кинетики.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Точечные процедуры посещения доступны в некоторых микроскопах, оснащенных x,y, z моторизованных этапов. Они позволяют запоминать несколько позиций на клеточной тарелке, и может помочь в сохранении более постоянного интервала времени между изображениями серии на разных клетках.
  10. Захват новой ячейки для каждой временной точки кинетической перспективе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После захвата ячейка частично отбеливается и не может быть повторно изображений. Из-за этого, кинетика получается путем объединения временных рядов многих клеток, каждая из которых захвачена в разное время.
  11. Для каждого нового блюда повторяйте протокол со ступени 2,3 до 3,9.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для эталонных блюд добавьте объем транспортного средства (PBS дополненный 0,01% бычьего сыворотоки альбумина), эквивалентный тому, который используется для лиганда.

4. Количество и яркость (N и B): Проверка качества временных рядов

  1. Конвертировать и сохранить как . TIFF файлы, приобретенные с помощью программного обеспечения камеры (.sif файлы в этом примере).
  2. Импорт. TIFF файлы в режиме программного обеспечения анализа, активируя графический пользовательский интерфейс N и B (GUI) MATLAB.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используется индивидуальная процедура Matlab, исполняемая n и B (анализ N и B на https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia). Открыв импортный . TIFF файл, рутина генерирует среднее изображение интенсивности, средний профиль интенсивности и позволяет проверить серии кадр за кадром(Дополнительная диаграмма 1). Другое программное обеспечение доступно для анализа N и B (например, программное обеспечение SimFCS).
  3. Отбросить серии, для которых средняя интенсивность профиля показывает более 10% фотоотбелении, и серии, в которых было очевидно искажения мембраны клеток или перевода во время приобретения.
  4. Обрез кадров, которые, очевидно, вне фокуса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инструмент обрезки реализован в рутине для отбрасывания одного или нескольких кадров в серии изображений. Эта операция разрешена, поскольку время кадра в кадр не является критическим, в то время как время расположения пикселей (время экспозиции) (см. Обсуждение).
  5. Храните для анализа только серии, по крайней мере 500 временных рамок.

5. Количество и яркость (N и B): Определение параметров камеры (Offset, и S)

  1. Активируйте обычную калибровоченную камеру.
  2. Выберите область не менее 20 х 50 пикселей в области шума детектора(рисунок 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рутина происходит гистограмма значений (также определены цифровой уровень, DL) и он возвращает logarithm участок частоты по сравнению с цифровыми уровнями.
  3. В сюжете журнала Frequency по сравнению с цифровым уровнем переместите линейный красный курсор, чтобы разграничить гауссовскую и линейную часть кривой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Красный курсор разделяет две части кривой, и активирует рутину возвращения смещения, который является центром гауссийской функции реакции камеры, кв гауссианской подгонки, и s фактор, который является склонли линейной части камеры respons e(Рисунок 4C-D).

6. Количество и яркость (N и B): Вычисление B-значений в выбранном регионе интересов (ROI)

  1. Активируйте ключ B.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это действие генерирует изображение средней интенсивности(рисунок 5, первый столбец) и B-изображение, в котором каждый отдельный B-значение связано с соответствующим пикселем на изображении(Дополнительная диаграмма 1).
  2. Примените минимальный биннинг (2 2), чтобы уменьшить рассеивание данных и создать гистограмму B-I(рисунок 5, второй столбец).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гистограмма B-I представляет распределение B-значений всех пикселей изображения по сравнению с интенсивностью пикселей. Y и B/S; Х -figure-protocol-11825 смещение)/S(Дополнительная диаграмма 1 и eq. 11 и 15).
  3. Осмотрите гистограмму B-I с помощью интерактивного квадратного курсора.
  4. Выберите квадратную рентабельность инвестиций для анализа(рисунок 5, третья колонка).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Курсор синхронизирует мобильную маску на изображении средней интенсивности, подчеркивая пиксели, которые выбраны внутри квадратной области курсора(Дополнительная диаграмма 1). Этой инспекцией можно исключить из анализа фон и области с очень низкой интенсивностью.
  5. Создайте B-карту выбранной рентабельности инвестиций(рисунок 5, четвертый столбец).
  6. Сохраните файл ASCII B-значений, связанных с выбором.
  7. Импортируйте файл ASCII в графическом программном обеспечении, чтобы вычислить распределение частот данных и получить среднее Значение B и S.E(рисунок 5, пятая колонка).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если данные однородны, распределение частот ы B-значения приблизительно гауссийское распределение.
  8. Применить eq. 15 для получения figure-protocol-13044 figure-protocol-13094 средней яркости - 1 (количество /молекула) в течение времени" для каждой клетки в каждой точке времени кинетической перспективе. Нормализация данных в соответствии с:
    figure-protocol-13314
    где figure-protocol-13371 среднее Значение B измеряется во время "т" figure-protocol-13464 после добавления лиганда, и является средним B-значениеизмеряется в то время t'0 (10-20 s после лиганда того).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нормализация результатов позволяет прямо сравнивать эксперименты, которые проводятся в разные дни. Он компенсирует различия в измеренной яркости за счет лазерной мощности и технических колебаний.
  9. Участок нормализованной Средней яркости по сравнению с приобретением времени для создания кинетической перспективе (Рисунок 6).

Результаты

Результаты по двум репрезентативным клеткам HeLa-mEGFP-FGFR1, посеянным в одной и той же культуре, показаны на рисунке 5 и дополнительной таблице 1. Две клетки были захвачены в то время 0 мин(рисунок 5A, сверху) и 7 мин(?...

Обсуждение

Н ЗБи требует нескольких мер предосторожности при выборе модели ячейки и стратегии маркировки. Он может быть применен только к живым клеткам, которые остаются пристежными во время захвата изображения. Дополнительные колебания из-за всего жесткого смещения ячейки могут быть обработан?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

CNIC поддерживается Министерством Cencia, Innovacion y Universidades и Фондом Pro CNIC, а также является Центром передового опыта Северо-Очоа (SEV-2015-0505). Нас также поддерживает Европейский фонд регионального развития (ФЕДЕР) «Una manera de hacer Europa». UC признает поддержку со стороны Associazione Italiana Ricerca sul Cancro, Ассоциации международных исследований рака (теперь известный как Всемирное исследование рака), и итальянского министерства здравоохранения. A.T. признать Fondazione Banca дель Монте ди Ломбардия для частичной поддержки его работы с. стипендий Progetto Professionalit Ивано Бекки 2011-2012.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software.Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Albumin from Bovine Serum 98% minimunSigma-Aldrich, St. Louis, MI, USAA7906-100G
DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPESGIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA21063029Used serum free for microscopy
DMEM high-glucose GlutaMAX IGIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA10566-016Used for complete medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)Biowest, Nuaillé, FranceX0515-500
Emission splitting system Photometrics DV2TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Fetal Bovine Serum, qualified, BrazilGIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA1027010610% inactivated supplement for complete medium
Glass bottom 35-mm sterile 1.5 dishesMatTek, Ashland, MA, USAP35G-0.170-14-Cuncoated, glass thickness 0.17 microns
GraphPad PrismGraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cellsMillipore-Sigma ECACC, Darmstadt, GermanyCB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis softwareOxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UKThis camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series
Matlab Executable N&B routineUnit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spaindownload at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018bThe MathWorks, Inc. Natick, MA, USAdownload at https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100xBiowhittaker Inc. Walkersville, MD, USALONZA 17-602Esupplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100U/100µg.
pN1-mEGFP-FGFR1 expression vectorUnit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, ItalyZamai et al., 2019
pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vectorUnit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, SpainHellriegel et al., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vectorUnit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, SpainHellriegel et al., 2011
Recombinant FGF2PeproTech EC, Ltd., London, UKLigand solution: 20ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.
Sodium pyruvate GIBCOThermoFisher Scientific113600701mM supplement for medium
TransIt-LT1 Transfection ReagentMirusBio LLC, Madison, WI, USAMIR 2300
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA25200056
Type F Immersion liquid 10 mLLeica Microsystems, Wetzlar, Germany11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL)ThermoFisher ScientificAM26180.1% supplement for medium without phenol red used for transfections

Ссылки

  1. Agwuegbo, U. C., Jonas, K. C. Molecular and functional insights into gonadotropin hormone receptor dimerization and oligomerization. Minerva Ginecologica. 70 (5), 539-548 (2018).
  2. Ferre, S., et al. G protein-coupled receptor oligomerization revisited: functional and pharmacological perspectives. Pharmacological Reviews. 66 (2), 413-434 (2014).
  3. Marsango, S., Ward, R. J., Alvarez-Curto, E., Milligan, G. Muscarinic receptor oligomerization. Neuropharmacology. 136 (Pt C), 401-410 (2018).
  4. Oishi, A., Cecon, E., Jockers, R. Melatonin Receptor Signaling: Impact of Receptor Oligomerization on Receptor Function. International Review of Cell and Molecular Biology. 338, 59-77 (2018).
  5. Thelen, M., Munoz, L. M., Rodriguez-Frade, J. M., Mellado, M. Chemokine receptor oligomerization: functional considerations. Current Opinion in Pharmacology. 10 (1), 38-43 (2010).
  6. Van Craenenbroeck, K. GPCR oligomerization: contribution to receptor biogenesis. Subcellular Biochemistry. 63, 43-65 (2012).
  7. Wnorowski, A., Jozwiak, K. Homo- and hetero-oligomerization of beta2-adrenergic receptor in receptor trafficking, signaling pathways and receptor pharmacology. Cell Signaling Technology. 26 (10), 2259-2265 (2014).
  8. Fricke, F., Dietz, M. S., Heilemann, M. Single-molecule methods to study membrane receptor oligomerization. Chemphyschem. 16 (4), 713-721 (2015).
  9. Vidi, P. A., Ejendal, K. F., Przybyla, J. A., Watts, V. J. Fluorescent protein complementation assays: new tools to study G protein-coupled receptor oligomerization and GPCR-mediated signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 331 (2), 185-193 (2011).
  10. Trussell, H. J., et al., Trussell, J., et al. . Academic Press Library in Signal Processing. 4, 3-9 (2014).
  11. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  12. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  13. Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18982-18987 (2008).
  14. Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Presse, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
  15. Godin, A. G., et al. Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7010-7015 (2011).
  16. Qian, H., Elson, E. L. Distribution of molecular aggregation by analysis of fluctuation moments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (14), 5479-5483 (1990).
  17. Chen, Y., Muller, J. D., So, P. T., Gratton, E. The photon counting histogram in fluorescence fluctuation spectroscopy. Biophysical Journal. 77 (1), 553-567 (1999).
  18. Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 69-81 (2008).
  19. Unruh, J. R., Gratton, E. Analysis of molecular concentration and brightness from fluorescence fluctuation data with an electron multiplied CCD camera. Biophysical Journal. 95 (11), 5385-5398 (2008).
  20. Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: a review. Biochemistry. 41 (3), 697-705 (2002).
  21. Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).
  22. Levi, V., Ruan, Q., Kis-Petikova, K., Gratton, E. Scanning FCS, a novel method for three-dimensional particle tracking. Biochemical Society Transactions. 31 (Pt 5), 997-1000 (2003).
  23. Hinde, E., et al. Quantifying the dynamics of the oligomeric transcription factor STAT3 by pair correlation of molecular brightness. Nature Communications. 7, 11047 (2016).
  24. Waithe, D., et al. Optimized processing and analysis of conventional confocal microscopy generated scanning FCS data. Methods. 140-141, 62-73 (2018).
  25. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
  26. Ossato, G., et al. A two-step path to inclusion formation of huntingtin peptides revealed by number and brightness analysis. Biophysical Journal. 98 (12), 3078-3085 (2010).
  27. Nagy, P., Claus, J., Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Distribution of resting and ligand-bound ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases in living cells using number and brightness analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16524-16529 (2010).
  28. Ming, A. Y., et al. Dynamics and Distribution of Klothobeta (KLB) and fibroblast growth factor receptor-1 (FGFR1) in living cells reveal the fibroblast growth factor-21 (FGF21)-induced receptor complex. Journal of Biological Chemistry. 287 (24), 19997-20006 (2012).
  29. Ross, J. A., et al. Oligomerization state of dynamin 2 in cell membranes using TIRF and number and brightness analysis. Biophysical Journal. 100 (3), L15-L17 (2011).
  30. Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane. FASEB J. 25 (9), 2883-2897 (2011).
  31. Zamai, M., et al. Number and brightness analysis reveals that NCAM and FGF2 elicit different assembly and dynamics of FGFR1 in live cells. Journal of Cell Science. 132 (1), (2019).
  32. Hassler, K., et al. Total internal reflection fluorescence correlation spectroscopy (TIR-FCS) with low background and high count-rate per molecule. Optics Express. 13 (19), 7415-7423 (2005).
  33. Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. From fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope. Journal of Visualized Experiments. (92), e51994 (2014).
  34. Beenken, A., Mohammadi, M. The FGF family: biology, pathophysiology and therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (3), 235-253 (2009).
  35. Joubert, J., Sharma, D. Light microscopy digital imaging. Current Protocols in Cytometry. , (2011).
  36. Gell, C., Berndt, M., Enderlein, J., Diez, S. TIRF microscopy evanescent field calibration using tilted fluorescent microtubules. Journal of Microscopy. 234 (1), 38-46 (2009).
  37. Burghardt, T. P. Measuring incidence angle for through-the-objective total internal reflection fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 17 (12), 126007 (2012).
  38. Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis. Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).
  39. Caiolfa, V. R., et al. Monomer-dimer dynamics and distribution of GPI-anchored uPAR are determined by cell surface protein assemblies. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1067-1082 (2007).
  40. Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 7877-7882 (2002).
  41. Cutrale, F., et al. Using enhanced number and brightness to measure protein oligomerization dynamics in live cells. Nature Protocols. 14 (2), 616-638 (2019).
  42. Dunsing, V., Chiantia, S. A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts. Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

153N BtIRF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены