Dynamique d'oligomerisation des récepteurs de surface cellulaire dans les cellules vivantes par microscopie de fluorescence interne totale combinée à l'analyse du nombre et de la luminosité

Summary

Nous décrivons une approche de formation image pour la détermination de l'état oligomeric moyen des oligomères mEGFP-marqué-récepteurs induits par la liaison de ligand dans la membrane de plasma des cellules vivantes. Le protocole est basé sur la microscopie de la fluorescence de la réflexion interne totale (TIRF) combinée à l'analyse du nombre et de la luminosité (N-B).

Abstract

Malgré l'importance et l'omniprésence de l'oligomerisation des récepteurs, peu de méthodes sont applicables pour détecter les événements de regroupement et mesurer le degré de regroupement. Ici, nous décrivons une approche de formation image pour déterminer l'état oligomeric moyen des homocomplexes mEGFP-marqué-récepteur dans la membrane des cellules vivantes. Le protocole est basé sur la microscopie de la fluorescence de la réflexion interne totale (TIRF) combinée à l'analyse du nombre et de la luminosité (N-B). La méthode est une méthode semblable à la spectroscopie de corrélation fluorescence (FCS) et à l'histogramme de comptage de photons (PCH), qui sont basées sur l'analyse statistique des fluctuations de l'intensité de fluorescence des fluorophores diffusant dans et hors d'un éclairage volume pendant un temps d'observation. En particulier, n'est une simplification de PCH pour obtenir des informations sur le nombre moyen de protéines dans les mélanges d'oligomériques. Les amplitudes de fluctuation d'intensité sont décrites par la luminosité moléculaire du fluorophore et le nombre moyen de fluorophores dans le volume d'illumination. Ainsi, N-B ne considère que les premier et deuxième moments de la distribution de l'amplitude, à savoir l'intensité moyenne et la variance. C'est, en même temps, la force et la faiblesse de la méthode. Étant donné que seulement deux moments sont pris en considération, n'est pas en passe de déterminer la fraction molaire des oligomères inconnus dans un mélange, mais elle n'estime que l'état moyen d'oligomerisation du mélange. Néanmoins, il peut être appliqué à des séries chronologiques relativement petites (par rapport à d'autres méthodes de moment) d'images de cellules vivantes sur une base pixel par pixel, simplement en surveillant les fluctuations temporelles de l'intensité de la fluorescence. Il réduit le temps efficace par pixel à quelques microsecondes, permettant l'acquisition dans la plage de temps de secondes à millisecondes, ce qui est nécessaire pour la cinétique d'oligomerisation rapide. Enfin, de grandes zones cellulaires ainsi que des compartiments sous-cellulaires peuvent être explorés.

Introduction

Nous décrivons une approche d'imagerie de fluorescence et de luminosité de réflexion interne totale (TIRF-N-B) pour déterminer l'état oligomeric moyen des molécules de récepteur à la membrane de plasma des cellules vivantes, visant à relier l'assemblage de récepteur dynamique à la fonction biologique des protéines (Figure 1).

Sur la liaison extracellulaire de ligand, les récepteurs initient la transduction intracellulaire de signal selon leur conformation, oligomerization, co-récepteurs potentiels et composition de membrane. Malgré l'importance et l'omniprésence de l'oligomerisation des récepteurs, reconnu comme un événemen....

Protocol

1. Préparation de l'échantillon

1. Jour 1. Cellules HeLa de graine dans le milieu complet à une concentration de 100.000-200.000 cellules/mL dans les plats en verre-fond. Graines 6-8 reproduire les plats.
   REMARQUE: Dans cet exemple, le milieu est complété par 10% de chaleur inactivée sérum bovin fœtal (FBS), 1 mM de pyruvate de sodium, 100 U/100 g de pénicilline/streptomycine. Plusieurs plats reproduits sont préparés.
2. Jour 2-3. Lorsque les cellules sont sous-confluences, tr.......

Discussion

La N-B exige plusieurs précautions dans le choix du modèle cellulaire et de la stratégie d'étiquetage. Il ne peut être appliqué qu'aux cellules vivantes qui restent stablement respectées pendant le temps de capture d'image. Les fluctuations supplémentaires dues à l'ensemble du déplacement rigide de la cellule peuvent être traitées avec des approches appropriées de restauration d'image³⁸. Cependant, généralement quand une cellule se déplace, la membrane cellulaire se déforme égale.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software.	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Albumin from Bovine Serum 98% minimun	Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA	A7906-100G
DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	21063029	Used serum free for microscopy
DMEM high-glucose GlutaMAX I	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10566-016	Used for complete medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)	Biowest, Nuaillé, France	X0515-500
Emission splitting system Photometrics DV2	TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10270106	10% inactivated supplement for complete medium
Glass bottom 35-mm sterile 1.5 dishes	MatTek, Ashland, MA, USA	P35G-0.170-14-C	uncoated, glass thickness 0.17 microns
GraphPad Prism	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells	Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany	CB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software	Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK		This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series
Matlab Executable N&B routine	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018b	The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA		download at https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x	Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA	LONZA 17-602E	supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100U/100µg.
pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector	Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy		Zamai et al., 2019
pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		Hellriegel et al., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		Hellriegel et al., 2011
Recombinant FGF2	PeproTech EC, Ltd., London, UK		Ligand solution: 20ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.
Sodium pyruvate GIBCO	ThermoFisher Scientific	11360070	1mM supplement for medium
TransIt-LT1 Transfection Reagent	MirusBio LLC, Madison, WI, USA	MIR 2300
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	25200056
Type F Immersion liquid 10 mL	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	AM2618	0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections