Crecimiento de capas celulares endoteliales corneales humanas y ovinas en membranas biomateriales

Resumen

Este protocolo describe los pasos críticos necesarios para establecer y cultivar cultivos celulares endoteliales corneales a partir de explantas de tejido humano o ovino. También se presenta un método para subculturizar células endoteliales corneales en biomateriales membranosas.

Resumen

Los cultivos de células endoteliales corneales tienden a someterse a una transición epitelial a mesenquimal (EMT) después de la pérdida del contacto entre células. La EMT es perjudicial para las células, ya que reduce su capacidad para formar una capa madura y funcional. Aquí, presentamos un método para establecer y suculcar cultivos celulares endoteliales humanos y ovinos que minimiza nalve la pérdida de contacto de célula a célula. Los explantas de la membrana del endotelio/Descemet se toman de las córneas del donante y se colocan en el cultivo de tejidos en condiciones que permiten que las células migren colectivamente a la superficie de cultivo. Una vez establecida una cultura, los explantes se transfieren a placas nuevas para iniciar nuevos cultivos. Dispase II se utiliza para levantar suavemente los grupos de células de las placas de cultivo de tejido para su subcultura. Los cultivos celulares endoteliales corneales que se han establecido utilizando este protocolo son adecuados para transferir a membranas biomateriales para producir capas celulares de ingeniería tisular para trasplante en ensayos con animales. Se describe un dispositivo hecho a medida para apoyar las membranas biomateriales durante el cultivo del tejido y se presenta un ejemplo de un injerto de ingeniería tisular compuesto por una capa de células endoteliales corneales y una capa de células estromales corneales a ambos lados de una membrana de colágeno tipo I.

Introducción

La córnea es un tejido transparente que se encuentra en la parte delantera del ojo. Se compone de tres capas principales: una capa epitelial en la superficie externa, una capa de estroma medio y una capa interna llamada endotelio corneal. El endotelio corneal es una monocapa de células que se asienta sobre una membrana del sótano llamada membrana de Descemet y mantiene la transparencia de la córnea regulando la cantidad de líquido que entra en el estroma desde el humor acuoso subyacente. El exceso de líquido dentro del estroma causa hinchazón de la córnea, opacidad y pérdida de la visión. Por lo tanto, el endotelio es vital para mantener la visión.

El endotelio corneal puede llegar a ser disfuncional por una serie de razones, incluyendo el envejecimiento, enfermedad y lesión, y el único tratamiento actual es la cirugía de trasplante. Durante esta cirugía, la membrana del endotelio y Descemet se extrae de la córnea del paciente y se reemplaza con un injerto de endotelio y la membrana de Descemet obtenida de una córnea donante. Muchos injertos de endotelio también contienen una fina capa de tejido estroveral para ayudar a la manipulación y fijación a la córnea huésped¹.

En todo el mundo, la demanda de tejido de donante corneal para cirugías de trasplante es mayor que la cantidad que pueden ser suministradas por los bancos oculares². Por lo tanto, ha habido un impulso para desarrollar trasplantes de endotelio corneal de ingeniería de tejido que podrían utilizarse para aliviar este déficit³. La razón de ser de esto se basa en el hecho de que actualmente, el endotelio de una córnea individual sólo puede ser transferido a un solo paciente, sin embargo, si las células endoteliales corneales se expandieron y cultivaron por primera vez en andamios biomateriales en el cultivo de tejidos, podrían ser utilizados para tratar a múltiples pacientes.

Los principales desafíos que deben abordarse antes de que los trasplantes de endotelio corneal con ingeniería de tejido se conviertan en una opción factible para los cirujanos incluyen: (1) establecer técnicas para expandir las células endoteliales corneales de alta calidad y para producir células endoteliales maduras y funcionales capas de células endoteliales corneales in vitro, y (2) establecer técnicas para el cultivo de las células en andamios biomateriales para producir injertos de ingeniería tisular que sean iguales o mejores que los injertos derivados de la córnea del donante que se utilizan actualmente.

Las células endoteliales corneales tienen un potencial proliferativo in vivo muy bajo, pero se pueden estimular para dividir in vitro^4. Sin embargo, tienen una fuerte tendencia a someterse a una transición epitelial-mesenquimal (EMT) in vitro, lo que reduce su capacidad para formar una capa endotelial madura y funcional. Los desencadenantes conocidos de la EMT en las células endoteliales corneales incluyen la exposición a ciertos factores de crecimiento y la pérdida del contacto entre células⁵. Por lo tanto, es casi inevitable que los cultivos celulares endoteliales corneales que se disilizan enzimáticamente durante la subcultura sufren cambios asociados con la EMT. Aquí, presentamos un método de cultivo celular para células endoteliales corneales humanas u ovinas que está diseñado para minimizar la interrupción de los contactos de célula a célula durante las etapas de aislamiento, expansión y subcultivo, para reducir el potencial de EMT. Además, demostramos cómo los injertos de ingeniería tisular que se asemejan a los injertos de endotelio/tejido estrogénico derivados de la córnea de donantes que se asemejan a los injertos de endotelio/tejido estrogénico de descemet pueden ser producidos por el cultivo de capas celulares cultivadas en ambos lados de una membrana biomaterial en un dispositivo de montaje hecho a medida.

Protocolo

Las córneas humanas con el consentimiento de los donantes para la investigación se obtuvieron del Banco de Ojos de Queensland y se utilizaron con la aprobación ética del Comité de ética de investigación humana del Hospital Metro Sur y del Servicio de Salud (HREC/07/QPAH/048). Las córneas de oveja se obtuvieron de animales eutanasiados en el Centro de Investigación Médica de Herston de la Universidad de Queensland bajo un acuerdo de intercambio de tejidos.

1. Preparación de herramientas de disección

1. Esterilice dos pares de fórceps relojero número 4 empapórlos en una solución de etanol al 70% durante 5 min o autoclando.

2. Preparación de placas de cultivo medio de cultivo y de cultivo de tejidos

1. Preparar 100 ml de medio de cultivo que contenga Opti-MEM 1 (1x) + GlutaMAX-1, 5% de suero bovino fetal y 100 U/ml de pluma/estreptococo. Este medio de cultivo es adecuado para cultivos celulares endoteliales corneales de oveja, sin embargo, para cultivos celulares endoteliales corneales humanos, el medio debe complementarse con 50 g/ml de extracto de la hipófisis bovina, 0,08% sulfato de condroitina, cloruro de calcio de 200 g/ml y ácido L-ascórbico de 0,3 mM 2-fosfato. El medio de cultivo se puede almacenar en la oscuridad a 4 oC durante dos semanas.
2. Recubrir los pozos de una placa de cultivo de tejido de 6 pocillos con Factor de fijación utilizando las instrucciones del fabricante y luego añadir 1 ml de medio de cultivo a cada pocato recubierto. Prepare un pozo para cada córnea.

3. Procedimiento de disección y cultivo celular explantado

1. Coloque la córnea, lado del endotelio hacia arriba, en una placa estéril de Petri en el escenario de un microscopio de disección. Ajuste la iluminación para que la superficie corneal esté bien iluminada con suficiente contraste para resaltar la capa endotelial. Ajuste el zoom para que el borde y algún endotelio corneal central estén a la vista.
2. Utilice fórceps de relojero esterilizado para levantar y desgarrar suavemente la membrana de Descemet lejos del estroma subyacente (Figura 1). La membrana se separará del estroma como una tira que inmediatamente se acurruca. Coloque la tira en un pozo de una placa de cultivo de tejido de 6 pocillos que ha sido recubierta con Factor de Fijación y contiene 1 ml de medio de cultivo. La tapa de la placa de cultivo de tejido debe mantenerse encendida en todo momento, excepto cuando se le añaden explantas, para reducir el riesgo de contaminación.
3. Retire primero las tiras de la membrana de Descemet de la periferia extrema del endotelio y luego de las regiones centrales. Coloque todas las tiras de una córnea en un solo pozo dentro del plato de 6 pocillos.
4. Incubar los explantes en una incubadora de cultivo celular humidificado situada en un 5% de_CO2 y 37oC. Deje el cultivo intacto durante 2 días para permitir que los explantes se asienten y se adhieran a la superficie de la placa. Por lo general, hasta un tercio de los explantes no se adhieren a la placa.
5. Retire el medio y los explantes no unidos del cultivo después de 4 días y agregue suavemente 2 ml de medio de cultivo fresco teniendo cuidado de no molestar a los explantes adjuntos. El medio cultural debe cambiarse dos veces por semana.

4. Producción continua de células endoteliales corneales por cultivo explanta en serie

NOTA: Los explantes se pueden transferir a placas de cultivo de tejido fresco después de 10 días para establecer cultivos adicionales de células endoteliales corneales.

1. Coloque el cultivo explant en el escenario de un microscopio de disección y ajuste la iluminación y el zoom para que los explantes sean visibles.
2. Usando fórceps de relojero esterilizados, saque suavemente cada explant de su placa de cultivo y transfiérala a un pozo fresco de una placa de cultivo de tejido de 6 pocillos que ha sido recubierta con Factor de Fijación y contiene 1 ml de medio de cultivo.
3. Dejar que los explantes se asienten en la superficie de su nueva placa durante 4 días antes de sustituir el medio de cultivo por 2 ml de medio de cultivo fresco. El medio de cultivo de cambio sincambios dos veces por semana.

5. Crecimiento de células endoteliales corneales en tapas de vidrio para análisis de inmunofluorescencia

NOTA: Los cultivos celulares destinados a ser analizados mediante inmunofluorescencia deben establecerse en cubiertas de vidrio que se pueden montar en diapositivas de microscopio de vidrio siguiendo el procedimiento de tinción.

1. Esterilice un paquete de tapas redondas de vidrio de 13 mm de diámetro en un autoclave o empapada en 70% de etanol durante 15 minutos seguido de tres enjuagues en solución salina con búfer de fosfato (PBS).
2. Coloque los revestimientos individuales en los pozos de una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos, recubrirlos con Factor de fijación, y luego agregar 0,5 ml de medio de cultivo a cada poc.
3. El uso de fórceps de relojero esterilizados elimina los explantes de sus placas de cultivo de tejidoy los transfiere a pozos que contienen cubreobjetos. Deje que los explantes se asienten en las cubiertas durante 4 días antes de cambiar el medio.
4. Después del período de incubación requerido, fijar y manchar las culturas encubiertas dentro de sus pozos de cultivo. Monte los cubreobjetos manchados en diapositivas de microscopio de vidrio para su análisis bajo un microscopio de fluorescencia.

6. Subcultivo de células endoteliales corneales utilizando Dispase II

NOTA: Las células fibroblásticas grandes se pueden eliminar selectivamente de los cultivos de explantación en placas de 6 pocillos antes de suculturar mediante este procedimiento. Si se van a subculturar todas las celdas, no realice los pasos 6.2 a 6.4. El objetivo de este procedimiento es transferir las células a placas nuevas mientras se mantienen sus contactos de célula a célula tanto como sea posible. Las células deben manipularse suavemente. Los pozos de confluente completamente deben ser repasados en una proporción de 1:2, mientras que los pozos de subconfluentes deben ser pasados en una proporción de 1:1 o menos.

1. Retire el medio del cultivo y enjuague brevemente con DPBS.
2. Añadir 1 mL de Versene. Incubar a temperatura ambiente durante 30 s.
3. Retire el Versene y agregue 1 ml de TrypLE. Incubar a 37oC en la incubadora de cultivos tisulares durante 3 min.
4. Observe el cultivo utilizando un microscopio de contraste de fase. Toque suavemente el cultivo para desalojar las células de la placa. Tan pronto como las células fibroblásticas grandes se hayan desprendido de la placa, retírelas y el TrypLE con una pipeta de 1 ml. Lave el TrypLE residual de las células restantes encerrando dos veces con 2 ml de DPBS.
5. Añadir 1 ml de 1 mg/ml Despensar II al cultivo e incubar en la incubadora de cultivos tisulares durante 1 a 2 h o hasta que todas las células se hayan separado de la placa. Las células deben flotar gradualmente lejos de la placa en grumos.
6. Recoger las células utilizando una pipeta de 1 ml y transferir a 20 ml de DPBS en un tubo centrífugo de 50 ml. Centrífuga durante 5 min a 300 x g a temperatura ambiente.
7. Retire el sobrenadante y resuspenda suavemente el pellet celular mediante la trituración con una pipeta de 1 ml en 1 ml de medio de cultivo. Transfiera la suspensión celular a uno o dos pozos de una placa de 6 pocillos, para pasar a una proporción de 1:1 o 1:2 respectivamente.
8. Recargar el medio en cada pozo para hacer 2 ml y colocar los cultivos en la incubadora de cultivo de tejido. Sustituya el medio por 2 ml de medio fresco dos veces por semana.

7. Crecimiento de capas celulares endoteliales corneales en membranas biomateriales

NOTA: El siguiente procedimiento describe los pasos involucrados en el montaje de un biomaterial membranoso en un dispositivo de montaje hecho a medida, llamado cámara micro-Boyden, para el cultivo celular. Consulte nuestra reciente publicación⁶ para obtener más información sobre el dispositivo y para obtener más información sobre la compra.

1. Montar la cámara superior de la cámara micro-Boyden colocando una placa tórica roja en su centro.
2. Utilice un trephine de 18 mm de diámetro para perforar un disco de una hoja de biomaterial en una tabla de corte de politetrafluoroetileno (PTFE). Coloque este disco sobre la tórtela roja en la cámara superior de la cámara micro-Boyden.
3. Atornille la cámara inferior a la cámara superior, asegurando el disco biomaterial en el medio.
4. Remoje la cámara micro-Boyden montada en 70% de etanol durante 1 h para esterilizarla.
5. Sumerja completamente la cámara micro-Boyden montada en HBSS estéril durante 10 minutos para eliminar el etanol. Repita este paso de lavado dos veces. Realice un paso de lavado final durante 10 minutos en medio de cultivo sin suplementar.
6. Transfiera la cámara micro-Boyden esterilizada al medio de cultivo en el pozo de una placa de 6 pocillos asegurando que la cámara superior esté más alta. Ajuste el nivel del medio de cultivo para que entre en contacto con la superficie inferior de la membrana biomaterial, pero no fluya hacia la cámara superior.
7. Preparar una suspensión de las células endoteliales corneales utilizando el procedimiento descrito en la sección 6. Se debe lograr una densidad celular suficiente en la suspensión para permitir una densidad de sembración de al menos 100.000 células por cm² en la membrana de la cámara micro-Boyden. La superficie de cultivo dentro de la cámara micro-Boyden es de 0,5 cm² y puede contener un volumen de 100 l. Por lo tanto, se debe preparar una suspensión que contenga 500.000 células/ml.
8. Pipetear 100 l de suspensión celular (50.000 células) sobre la membrana de la cámara micro-Boyden. Incubar en la incubadora de cultivo de tejido durante 4 h antes de recargar el medio para sumergir completamente la cámara. Incubar el cultivo durante el período de tiempo requerido, reemplazando el medio dos veces por semana.
   NOTA: Una vez que las células endoteliales corneales se han unido a la superficie superior de la membrana biomaterial, la cámara micro-Boyden se puede voltear dentro del cultivo bien para que la cámara inferior esté más alta. Luego se pueden agregar más células a la cámara para iniciar cultivos celulares en la otra superficie de la membrana. Por ejemplo, las células estromales corneales se pueden aplicar fácilmente a la superficie alternativa imitando así la ubicación relativa de los tipos de células corneales como se ve dentro de la córnea posterior.

Resultados

El método para aislar y expandir las células endoteliales corneales de las córneas humanas u ovinas se resume en la Figura 1 y la Figura 2. La mayoría de los explantes que se derivan de las córneas de 1 a 2 años de edad ovejas o donantes humanos de menos de 30 años de edad se unirán a las placas de cultivo de tejido recubierto de Factor de Apéndice dentro de una semana, sin embargo, no es inusual encontrar que hasta un tercio de los explantas no se adhi...

Discusión

Un desafío técnico significativo asociado con el establecimiento y la expansión de las células endoteliales corneales humanas es evitar que la EMT ocurra en los cultivos. La EMT se puede activar en las células endoteliales corneales por pérdida de contacto de célula a célula, sin embargo, la mayoría de los protocolos de cultivo celular para estas células implican disociación enzimática a células individuales durante el aislamiento y la subcultura¹⁰. Aquí presentamos un protocolo de c...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Attachment factor	Gibco	S006100	A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C.
Bovine pituitary extract	Gibco	13028014	A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots.
Calcium chloride	Merck	C5670	Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise.
Centrifuge tube, 50 ml	Labtek	650.550.050
Chondroitin sulphate	LKT Laboratories	C2960	This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Dispase II	Gibco	17105-041	Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Ethanol	Labtek	EA043	100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces.
Foetal bovine serum	GE Healthcare Australia Pty Ltd	SH30084.03	This is a HyClone brand of foetal bovine serum.
Coverglass No. 1, Ø 13 mm	Proscitech	G401-13	Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture.
HBSS	Gibco	14025-092	Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride.
L-ascorbic acid 2-phosphate	Merck	A8960	Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise.
Micro-Boyden chamber	CNC Components Pty. Ltd.	Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007	Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE).
O-ring for micro-Boyden chamber	Ludowici Sealing Solutions	RSB012	Composed of silicon rubber.
Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1	Gibco	51985-034	A reduced serum medium containing glutamine.
DPBS	Gibco	14190-144	Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride.
Pen Strep	Gibco	15140-122	A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin.
Petri dish	Sarstedt	82.14473.001	Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections.
Tissue culture plate, 24 well	Corning Incorporated	Costar 3524	A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2.
Tissue culture plate, 6 well	Corning Incorporated	Costar 3516	A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2.
TrypLE Select	Gibco	12563-011	A 1X enzyme solution for dissociating cells.
Versene	Gibco	15040-066	A 1X EDTA solution for dissociating cells.
Watchmaker forceps	Labtek	BWMF4	Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas.