Metal-Limited Crescita di Neisseria gonorrhoeae per la caratterizzazione dei geni metal-reattivi e l'acquisizione di metalli da Host Ligands

Riepilogo

Descriviamo qui un metodo per la crescita delle gonorree Neisseria nel mezzo liquido con restrizioni metalliche per facilitare l'espressione dei geni per l'assorbimento dei metalli. Illustremo anche esperimenti a valle per caratterizzare il fenotipo dei gonocchi coltivati in queste condizioni. Questi metodi possono essere adattati per essere adatti per la caratterizzazione di geni che rispondono ai metalli in altri batteri.

Abstract

I metalli traccia come ferro e zinco sono nutrienti vitali noti per svolgere un ruolo chiave nei processi procatotici, tra cui la regolazione genica, la catalisi e la struttura delle proteine. Il sequestro di metallo da parte degli ospiti spesso porta a limitazioni di metallo per il batterio. Questa limitazione induce l'espressione genica batterica i cui prodotti proteici consentono ai batteri di superare il loro ambiente limitato dai metalli. La caratterizzazione di tali geni è impegnativa. I batteri devono essere coltivati in supporti meticolosamente preparati che consentano un accesso sufficiente ai metalli nutrizionali per consentire la crescita batterica, pur mantenendo un profilo metallico favorevole al raggiungimento dell'espressione dei suddetti geni. Come tale, un delicato equilibrio deve essere stabilito per le concentrazioni di questi metalli. Coltivare un organismo nutrizionalmente esigente come Neisseria gonorrhoeae, che si è evoluto per sopravvivere solo nell'ospite umano, aggiunge un ulteriore livello di complessità. Qui, descriviamo la preparazione di un mezzo definito a limitata di metalli sufficiente a consentire la crescita gonococcica e l'espressione genica desiderata. Questo metodo consente allo sperimentatore di maticare ferro e zinco da fonti indesiderate integrando i media con fonti definite di ferro o zinco, la cui preparazione è anche descritta. Infine, illustreremo tre esperimenti che utilizzano questo mezzo per aiutare a caratterizzare i prodotti proteici dei geni gonococcici regolati dai metalli.

Introduzione

Neisseria gonorrhoeae provoca la comune infezione trasmessa sessualmente gonorrea. Durante l'infezione, patogeni Neisseria esprimono un repertorio di geni che rispondono ai metalli che permettono ai batteri di superare gli sforzi di restrizione dei metalli da parte dell'ospite umano^1,2,3. I metalli traccia come il ferro e lo zinco svolgono un ruolo chiave in molti processi cellulari, come il legame agli enzimi nei siti catalitici, la partecipazione alle reazioni di redox e come fattori strutturali in varie proteine^4,5. In condizioni di metallo limitato, i loci che rispondono ai metalli sono derepressi e le loro proteine risultanti possono aiutare ad acquisire questi nutrienti. La caratterizzazione di questi geni e proteine rappresenta una sfida tecnica unica per lo sperimentatore. Gli ioni metallici devono essere trattenuti dai batteri per indurre la trascrizione di questi geni dai loro loci nativi, ma una malattia efficace di questi ioni da supporti carichi di metalli può essere difficile da ottimizzare. I diversi profili metallici dell'acqua di origine e la variazione intrinseca di⁶ ingredienti in polvere significano che la quantità di chelatore necessaria per rimuovere un metallo specifico da un mezzo ricco varierà tra diverse posizioni, fornitori di ingredienti, e anche nel tempo all'interno di un singolo laboratorio come inventario chimico viene sostituito.

Per aggirare questa sfida, descriviamo la preparazione di un mezzo definito che viene trattato con resina Chelex-100 durante la preparazione per rimuovere i metalli traccia dalla soluzione. Questo mezzo è sufficientemente nutriente denso per consentire la crescita del gonococco, che è difficile da coltura al di fuori dell'ospite umano, e permette allo sperimentatore di introdurre un profilo metallico specifico aggiungendo le proprie fonti definite e concentrazioni di Metalli. Il metodo di controllo add-back dei metalli desiderati a medio impoverito aumenta la consistenza sperimentale e consente esperimenti robusti e replicabili indipendentemente da fattori quali la fonte d'acqua e il numero di lotti chimici. Inoltre, questo supporto può essere distribuito come liquido o solido con solo piccole modifiche, rendendolo abbastanza versatile.

Al fine di dimostrare l'utilità di questo mezzo, descriviamo un protocollo per il suo utilizzo per la crescita gonococcica e descriviamo tre esperimenti di successo per caratterizzare i geni Neisseria sensibili ai metalli. In primo luogo, prepariamo lismi a cellule intere gonococcali da colture impoverite o integrate di metallo e dimostriamo livelli variabili di produzione di proteine da loci che rispondono ai metalli. Viene quindi illustrato un saggio di crescita limitato allo zinco in cui la crescita gonococcale è controllata dal completamento di specifiche fonti di zinco utilizzabili. Infine, mostriamo saggi vincolanti che dimostrano cellule gonococciche intere che esprimono recettori di superficie che rispondono al metallo che si legano ai rispettivi ligoandi contenenti metalli. La presentazione superficiale di successo di questi recettori richiede la crescita nel mezzo impoverito di metalli.

L'attuale protocollo è stato ottimizzato specificamente per neisseria gonorrhoeae, ma numerosi altri patogeni batterici impiegano strategie di acquisizione di metalli durante l'infezione⁷, quindi questo protocollo può essere adattato per lo studio dell'omeostasi metallica in altri batteri. Ottimizzare questo supporto e questi protocolli sperimentali per l'uso in altri batteri richiederà probabilmente una leggera modifica delle concentrazioni di chelatori metallici e/o il tempo di trattamento con Chelex-100, poiché altri batteri possono avere requisiti metallici leggermente diversi rispetto al gonococcus. Ferro e zinco sono i metalli primari di preoccupazione per le indagini descritte, ma altri metalli (ad esempio, manganese) sono stati dimostrati come critici per i batteri, tra cui Neisseria^8,9^,10,11,12. Inoltre, sono stati descritti metodi simili per le caratterizzazioni dei metalli nel lavoro di coltura cellulare eucarome, che può anche essere considerato. ¹³ del sistema

Protocollo

1. Preparazione di soluzioni stock A media definita (CDM) trattate da Chelex

1. Soluzione stock I
   1. Combinare NaCl (233,8 g), K₂SO₄ (40,0 g), NH₄Cl (8,8 g), K₂HPO₄ (13,9 g) e KH₂PO₄ (10,9 g) in acqua deionizzata a un volume finale di 1 L.
   2. Filtro sterilizzare la soluzione e aliquota in tubi conici 50 mL.
   3. Conservare a -20 gradi centigradi.
2. Soluzione stock II
   1. Combinare tiamina HCl (0,2 g), tirafofafo-Cl (0,05 g), pantotofina di calcio (0,19 g) e biotina (0,3 g) nel 50% (vol/vol) di etanolo ad un volume finale di 1 L.
   2. Aliquota in tubi conici da 50 ml e conservata a -20 gradi centigradi.
3. Soluzione stock III
   1. Combinare L-aspartate (4,0 g), L-glutamate (10,4 g), L-arginina (1,2 g), glicina (0,2 g), L-serine (0,4 g), L-leucina (00 l-isoleucina (0,24 g), L-valine (0,48 g), L-tirosina (0,56 g), L-proline (0,4 g), L-tryptophan (0,64 g), L-threonine (0,4 g), L-fenilalanina (0,2 g), L-asparagine-H₂O (0,2 g), L-glutamine (0,4 g), L-istidine-HCl (0 0,8 g), L-metionina (0,12 g), L-alanina (0,8 g), L-lysina (0,4 g) e glutathione ridotto (0,36 g) in acqua diionizzata da 500 ml.
   2. Sciogliere L-cisteina (0,44 g) e L-cistina (0,28 g) in un volume minimo (1 mL) di 1 M HCl e aggiungere alla soluzione di amminoacido di cui sopra.
   3. Regolare il pH della soluzione con 10 N NaOH fino a quando tutto il particolato non viene sciolto. Il pH finale sarà 10.0–11.0.
   4. Portare il volume finale a 1 L con acqua deionizzata.
   5. Filtro sterilizzare la soluzione e aliquota in volumi 250 mL.
   6. Conservare a -20 gradi centigradi.
4. Soluzione stock IV
   1. Sciogliere il glucosio (200 g) in acqua deionizzata ad un volume finale di 1 L.
      NOTA: potrebbe essere necessario riscaldare la soluzione per sciogliere il glucosio.
   2. Filtrare sterilizzare e aliquota la soluzione in tubi conici da 50 ml.
   3. Conservare a -20 gradi centigradi.
5. Soluzione stock V
   1. Combinare l'iposintomata (5,0 g), l'uracile (5,0 g) e NaOH (4,0 g) in acqua deionizzata ad un volume finale di 1 L.
   2. Filtrare sterilizzare e aliquota in tubi conici da 50 mL.
   3. Conservare a -20 gradi centigradi.
6. Soluzione VI
   1. Preparare una soluzione da 1 M CaCl₂-2H₂O (147 g/L) in acqua divinizzata. Filtrare sterilizzare e conservare a temperatura ambiente (RT).
7. Soluzione Stock VII
   1. Preparare una soluzione MgSO₄ idroacqua da 1 m in acqua deionizzata. Filtrare sterilizzare e memorizzare a RT.
8. Soluzione Stock VIII
   1. Preparare una soluzione NaHCO_{3 da} 1 M in acqua deionizzata. Filtrare sterilizzare e memorizzare a RT.

2. Preparazione di 4x Sterile Concentrate e 1x CDM

NOTA: Questa procedura deve essere eseguita in vetro sterile trattato con acido o in plastica per evitare lisciviazione di metalli nelle soluzioni.

1. Combinare le soluzioni stock I (50 mL), II (20 mL), III (250 mL), IV (50 mL) e V (20 mL) con 20,0 g di HEPES e mescolare per mescolare.
2. Regolare il pH a 7,4, quindi portare il volume finale a 500 mL con acqua deionizzata.
3. Lavare la resina Chelex-100 in acqua 1 L per rimuovere i conservanti prima di aggiungerla al concentrato sterile 4x. In questo modo si aggiungono 50 g di resina a 1 L dionizzata acqua e mescolando per almeno 1 h. Rimuovere l'acqua mediante filtrazione sottovuoto e utilizzare questa resina lavata per il passaggio 2.4.
4. Aggiungere 50 g di resina e mescolare lentamente per esattamente 90 min.
5. Rimuovere la resina sterilizzazione del filtro e conservare il concentrato sterile 4x a 4 gradi centigradi.
6. Per preparare una concentrazione di lavoro di 1x di CDM, prima diluire il concentrato 4x con acqua sterile deionizzata, quindi aggiungere la soluzione VI (125 mL per 500 mL di soluzione 1x), la soluzione VII (535 x L per 500 mL) e la soluzione VIII (10 mL per 500 mL).
   NOTA: Anche se tutte le soluzioni di stock sono già state sterilizzate, si consiglia di filtrare di nuovo sterilizzare la soluzione 1x dopo la preparazione.

3. Preparazione di piastre CDM

NOTA: La ricetta qui sotto fa 1 L supporti per piatti, ma è meglio prepararli in volumi più piccoli. Tutto si riduce proporzionalmente.

1. Agarose lavate
   1. Sciogliere 50 g di agarose in 1 L dionizzata acqua, mescolando per 1 h.
   2. Trasferire la soluzione in una bottiglia di centrifuga e centrifugare a 1.200 x g per 15 min a RT. Versare con attenzione il supernatante e scartare.
   3. Aggiungere acqua sufficientemente ionizzata per risospendere il pellet di agarose, quindi trasferire in un pallone da 1 LL. Portare ad un volume finale di 1 L con acqua deionizzata e poi mescolare e centrifugare come al passo 3.1.2. Scartare il super-attardato.
   4. Aggiungere sufficiente 100% di etanolo per risospendere il pellet, quindi trasferire in un nuovo pallone da 1 L. Portare ad un volume finale di 1 L con etanolo. Mescolare e centrifugare come nel punto 3.1.2.
   5. Ripetere il passaggio 3.1.4.
   6. Aggiungere metanolo al pellet di agarose per risospendere, quindi trasferire in un pallone da 1 LL. Portare ad un volume finale di 1 L con metanolo. Mescolare e centrifugare come nel punto 3.1.2.
   7. Ripetere il passaggio 3.1.6.
   8. Trasferire agarose lavato in un vassoio rivestito con foglio di alluminio e lasciare asciugare in una cappa di fumi. Quando è asciutto, trasferire in un contenitore senza metalli per lo stoccaggio a lungo termine.
2. Aggiungere 10 g di agarose lavate e 5 g di amido di patate a 750 mL di acqua deionizzata.
3. Autoclave per 30 min a 121 gradi centigradi, 100 kPa sopra la pressione atmosferica.
4. Lasciare raffreddare i supporti a 65 gradi centigradi, quindi aggiungere 250 mL di 4X CDM, 250 l di soluzione VI, 1,07 mL di soluzione VII e 20 mL di soluzione VIII.
5. Se lo si desidera, aggiungere i metalli di scelta prima di versare piastre. L'aggiunta di chelatori non è necessaria per mantenere le condizioni senza metallo.
6. Versare nei piatti Petri e lasciare solidificare.

4. Metal Limited Crescita di Neisseria gonorrhoeae

NOTA: Per la maggior parte delle applicazioni, non è necessario stressare i batteri prima dell'inoculazione del CDM. La fase iniziale di raddoppio nel CDM e la successiva diluizione sono sufficienti per esaurire i gonocococchi dei loro depositi interni di ferro e zinco. Come tale, i primi due passaggi della seguente procedura sono condotti utilizzando piastre di agar fatte di base media GC che sono stati integrati con il supplemento di Kellogg I¹⁴ e 12.5 Fe(NO₃₎₃. Se si desidera lo stress metallico iniziale, si consiglia di preparare piastre di base medie GC senza Fe(NO₃₎₃ e con 5 TPEN (N,N',N'-tetrakis (2-pyridylmethyl) ethylenediamine) per la chelazione di zinco o 10 m di deferoxamina per la chelazione del ferro. Tutta l'incubazione è condotta a 37 gradi centigradi con il 5% di CO_2.

1. Due giorni prima dell'esperimento, il giorno -2, strisciago gonococci da scorte di congelatori su piastre medie GC e incubare per non più di 24 ore.
2. Il giorno -1, striscia singole colonie su piastre medie GC fresche. Provate a fare questo 14-16 h prima dell'esperimento di crescita.
3. Il giorno dell'esperimento, aggiungere 5-10 mL 1x CDM a un fiaschettadi braccio laterale sconcertato da 125 mL e utilizzarlo per svuotare un colorimetro Klett.
4. Utilizzare un tampone sterile con punta di cotone per inoculare CDM da colonie singole sane. Punta a 20 unità Klett.
   NOTA: Se non è disponibile un colorimetro Klett, è adatto anche uno spettrofotometro. Non esiste una formula di conversione universale per le unità Klett in OD, ma è disponibile una guida approssimativa (https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales).
5. Incubare con agitazione a 250 rpm fino a circa un raddoppio di massa (40 unità Klett). Questo dovrebbe richiedere tra 1-2 h.
6. A questo punto, le colture sono diluite dall'aggiunta di un volume sufficiente di CDM per raggiungere la metà della densità di coltura iniziale (ad esempio, se 5 mL di cultura è passata da 20 a 40 unità Klett, 15 mL di CDM lo riporterà a 10 unità Klett) e la crescita continuerà come nel passaggio 4.5. La quantità specifica di diluizione alla schiena, trattamenti metallici, ecc. dipende dalle applicazioni a valle. Di seguito sono riportati tre esempi (sezioni 5, 6 o 7).

5. Analisi occidentale dei prodotti genici metalressimi reattivi

1. A partire dal passaggio 4.6, retro diluire le culture con tre volumi di CDM (ad esempio, 15 mL di CDM se si inizia con 5 mL). A questo punto, aggiungere i trattamenti metallici, se lo si desidera.
   1. I geni di rilevamento del ferro possono essere derepressicon 12,5 M Fe(NO )₃. I geni che rispondono allo zinco possono essere derepressi con 10 snSO₄.
   2. Non è necessario ulteriore stress da ferro o zinco, poiché i media sono già esauriti, quindi i geni reattivi saranno già espressi. Se si desidera ulteriore stress, si consiglia di non più di 1-2 M di deferoxamina o TPEN, poiché lo stress eccessivo impedirà alle colture di crescere.
2. Coltivare le colture come nel passaggio 4.5 per 4 h e registrare la densità finale delle cellule dei campioni. Le culture meno sovraccariche di metalli raggiungeranno una densità finale più elevata.
3. Standardizzare le colture ad una densità adeguata e preparare listi.
   1. Standardizzare i listi a cellule intere a una densità equivalente a 100 unità Klett in 1 mL di coltura. Per ottenere questo risultato, dividete 100 per la densità dell'unità Klett del campione. Il numero che si ottiene è il volume, in mL, di coltura che verrà utilizzato per rendere la pellet cellulare.
4. Seguire le procedure standard SDS-PAGE e Western blotting¹⁵ per sondare le proteine di interesse.

6. Saggi di crescita con limitato di metalli

NOTA: Questi saggi descrivono le premiscele di crescita precostituite. La preparazione di queste miscele è descritta nella sezione 8.

1. Durante il raddoppio della massa nel passaggio 4.5, pretrattare i pozzi di una micropiastra da 96 pozzeconto con premix 10x. Inoltre, designare tre pozzi da servire come spazi vuoti. A questi pozze, aggiungere 10 L di 10x premix e 90 L di CDM.
2. Una volta raddoppiate le colture dei flaconi dell'arma laterale, aggiungere 100 l di ogni coltura a un pozzo inutilizzato nella microplacca e misurare la densità ottica a 600 nm (OD₆₀₀). Questo può essere fatto con cuvettein in uno spettrometro, ma con un maggior numero di ceppi all'interno di un saggio questo può diventare ingombrante e generalmente non è consigliato a meno che lo spettrofotometro può misurare direttamente dal braccio del braccio laterale (Figura supplementare 2).
   1. Durante la misurazione dell'OD, riporre i flaconi nell'incubatrice per garantire che i gonococci rimangano vitali.
3. Calcolare la corretta quantità di diluizione necessaria per portare le colture a OD₆₀₀ x 0,02. I premix 10x hanno un effetto trascurabile sull'OD e possono essere omessi dal calcolo.
4. Diluire le colture con CDM in piccoli tubi di coltura e aggiungere un volume sufficiente per diluire i premi 10x a 1x nella piastra. Se è disponibile un riscaldamento a piastra, tenere la piastra a 37 gradi centigradi mentre si lavora.
5. Incubare la piastra per 8-12 h con agitazione in un lettore di lamiere, prendendo₆₀₀ misurazioni OD a intervalli desiderati.

7. Rilevamento del rilegatura del ligando da parte dei trasportatori di metalli a membrana esterna

1. Trattare le culture come desiderato al punto 5.1, quindi incubare con agitazione per 4 h.
2. Poco prima del marchio 4 h, tagliare tre pezzi di carta da filtro e un pezzo di nitrocellulosa alla dimensione approssimativa necessaria per adattarsi a un apparato macchia punto (Figura supplementare 3). Presoak la nitrocellulosa in acqua deionizzata, quindi assemblare l'apparato con carta da filtro sotto la nitrocellulosa.
3. A 4 h, registrare la densità delle cellule e standardizzare ad una densità finale appropriata. Si consiglia di utilizzare il 10% della densità utilizzata per la preparazione delle lisate cellulari nel passaggio 5. Ad esempio, se si utilizza 100 KU in 1 mL per i lismi, ciò significa 10 KU in 1 mL per questi set di macchie. Il calcolo è altrimenti lo stesso descritto in 5.3.1 e le culture vengono aggiunte direttamente alla nitrocellulosa nei volumi calcolati piuttosto che trasformate in lisari.
4. Le colture cellulari pipet sulla nitrocellulosa e consentono tempo sufficiente per la carta filtrante per assorbire tutto il liquido.
5. Smontare l'apparato, lasciare asciugare la macchia e bloccare la membrana di nitrocellulosa per 1 h in 5% di albumina di siero bovino o latte non grasso (w/v) in salina con buffer Tris.
6. Rimontare l'apparato macchia del punto, sostituendo la carta da filtro con pellicola di paraffina per creare una guarnizione a prova di perdita sotto la nitrocellulosa.
7. Diluire il ligando metallico di interesse a 0,2 M nelle celle bloccante e sonda per 1 h.
8. Sifone dal liquido con un vuoto, lavare la macchia, quindi seguire le procedure immunologiche standard per sviluppare il segnale¹⁶. I passaggi di lavaggio possono essere eseguiti all'esterno o all'esterno dell'apparecchio.

8. Caricamento metallico di Transferrin, S100A7 e Calprotectin e Preparazione di premi 10x

NOTA: Come con la preparazione CDM, utilizzare vetro lavato acido o plastica per la preparazione della soluzione.

1. Sciogliere la transferrina umana a 10 mg/mL (125 mL) nel buffer iniziale (100 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO₃, pH - 8,4). S100A7 e calprotectin sono sospesi in buffer costituito da 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 10 mM 2-Mercaptoethanol e 1 mM CaCl₂, pH - 8,0).
   1. Aggiungere alla soluzione di ferrazione la soluzione di ferrazione (100 mM di citrato di sodio, 100 mM NaHCO₃, 5 mM FeCl₃-6H₂O, pH - 8,4) alla soluzione di transferrina per ottenere una saturazione di ferro del 30% (ad esempio, 75 gradi di soluzione di ferrazione è adatta per il transferrin5 mL se effettuata a 10 mg/mL).
   2. Aggiungete il 4_a S100A7 o la calprotectina con un rapporto molare del 50% rispetto alla proteina per creare una saturazione del 25% (ogni molecola proteica ha due siti di legame metallico). È possibile utilizzare i preparativi di 100 S100A7 o calprotectin con 50 M nSO_4.
   3. Per entrambi i casi, consentire la miscelazione end-over-end per almeno 1 h per il carico di metallo.
2. Preparare 4 L di buffer di dialisi (40 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO₃, pH - 7.4). Dividere questo in due volumi separati 2 L e posizionarne uno a 4 gradi centigradi.
3. Aggiungere le proteine metalliche caricate in una cassetta di dialisi utilizzando una siringa e dialyze contro il primo volume tampone per 4 h a RT.
4. Spostare la cassetta sul secondo volume tampone e dialare durante la notte a 4 gradi centigradi. Dopo questi passaggi, tutti i metalli non associati devono essere rimossi.
   NOTA: Consigliamo un saggio di acido bicinchoninico per determinare le concentrazioni di proteine dopo la dialisi.
5. Utilizzare una premix 10x transferrin per l'utilizzo del transferrin come unica fonte di ferro.
   1. Preparare questa premix diluindo il 30% di trasferimento umano Fe-transferrin e di opotrasferimento bovino (preparato a 125 M come descritto per il transferrin umano, senza la fase di carico di ferro) rispettivamente a 75 e 30M, rispettivamente, in PBS. Una premiazione di controllo positiva sostituisce il 30% di Fe-transferrin con 75 Fe(NO₃)₃, e una premidicina di controllo negativo omette qualsiasi ferro aggiunto, mantenendo solo l'apo-transferrin bovino. Nel saggio di crescita, diluire 10 l di questi concentrati con 90 . Le concentrazioni finali sono pari al 7,5 M -30% di Fe-transferrin umano e 3 m di apo-transferrin bovino.
6. Utilizzare una versione modificata della premix transferrin 10x per l'utilizzo di S100A7 o calprotectin come unica fonte di zinco.
   1. Per una premix di controllo positivo, incorporare 50 M nSO₄ nella premix di trasferimento. Per un controllo negativo, incorporare 50 TPEN e omettere lo zinco. Quindi, prendere 10 l di ciascuno di questi per ogni campione ben necessario, e spostare quel volume in un nuovo tubo. Aggiungete a questo mezzo volume di PBS sterile. Ad esempio, se 10 pozze riceveranno la premix di controllo positivo, prendere 100 L di premix, spostarlo in un nuovo tubo e aggiungere 50 L di PBS. Eseguire la stessa operazione per il controllo negativo.
   2. Per fare la premix S100A7 o calprotectin, prendere 10 L della premix di controllo negativo per ben necessario, passare a un nuovo tubo, e aggiungere la metà di quel volume del 25% n-S100A7 o calprotectin. Nel pezzetto di crescita, utilizzare 15 l di premieri e diluire con 85 l l di coltura. Le concentrazioni finali per i trasferimenti rimangono le stesse del punto 8,5, con un aumento di 5 M di N, TPEN o S100A7/calprotectin.

Risultati

Uno specifico mezzo definito in assenza di metalli traccia per la crescita di Neisseria gonorrhoeae è stato sviluppato e implementato per la caratterizzazione dei geni che rispondono ai metalli e dei loro prodotti genici. Nel protocollo ottimizzato, il profilo metallico dei supporti è controllato aggiungendo metalli a discrezione dello sperimentatore, piuttosto che titerando chelazione di un bersaglio metallico, consentendo un maggiore controllo e coerenza da laboratorio a labo...

Discussione

I mezzi di crescita riscantono una varietà di ruoli nella ricerca microbiologica. I supporti specializzati vengono utilizzati per la selezione, l'arricchimento e varie altre applicazioni per molti tipi di studio unici. Una di queste applicazioni è l'induzione di geni che rispondono ai metalli, che viene in genere realizzata mediante l'aggiunta di un chelante specifico che si rivolge a un particolare ione metallico. Questo metodo è limitato, in quanto la quantità di chelazione necessaria per vari metalli traccia è pr...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
125 mL sidearm flasks	Bellco	2578-S0030	Must be custom ordered
2-Mercaptoethanol	VWR	M131	Open in fume hood
3MM Paper	GE Health	3030-6461	Called "filter paper" in text
Agarose	Biolone	BIO-41025	Powder
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	A9434	Powder
Biotin	Sigma-Aldrich	B4501	Powder
Blotting grade blocker	Bio-Rad	170-6404	Nonfat dry milk
Bovine serum albumin	Roche	3116964001	Powder
Bovine transferrin	Sigma-Aldrich	T1428	Powder
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C5080	Powder
Calcium pantothenate	Sigma-Aldrich	C8731	Powder
Calprotectin	N/A	N/A	We are supplied with this by a collaborator
Chelex-100 Resin	Bio-Rad	142-2832	Wash with deionized water prior to use
Cotton-tipped sterile swab	Puritan	25-806	Cotton is better than polyester for this application
Deferoxamine	Sigma-Aldrich	D9533	Powder
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Powder
Dialysis cassette	Thermo	66380	Presoak in buffer prior to use
Dot blot apparatus	Schleicher & Schwell	10484138	Lock down lid as tightly as possible before sample loading
Ethanol	Koptec	V1016	Flammable liquid, store in flammables cabinet
Ferric chloride	Sigma-Aldrich	F7134	Irritant, do not inhale
Ferric nitrate nonahydrate	Sigma-Aldrich	F1143	Irritant, do not inhale
GC medium base	Difco	228950	Powder, already contains agar
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898	Powder
HEPES	Fisher	L-15694	Powder
Human transferrin	Sigma-Aldrich	T2030	Powder
Hypoxanthine	Sigma-Aldrich	H9377	Powder
Klett colorimeter	Manostat	37012-0000	Uses color transmission to assess culture density
L-alanine	Sigma-Aldrich	A7627	Powder
L-arginine	Sigma-Aldrich	A5006	Powder
L-asparagine monohydrate	Sigma-Aldrich	A8381	Powder
L-aspartate	Sigma-Aldrich	A9256	Powder
L-cysteine hydrochloride	Sigma-Aldrich	C1276	Powder
L-cystine	Sigma-Aldrich	C8755	Powder
L-glutamate	Sigma-Aldrich	G1251	Powder
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G3126	Powder
L-histidine monohydrochloride	Sigma-Aldrich	H8125	Powder
L-isoleucine	Sigma-Aldrich	I2752	Powder
L-leucine	Sigma-Aldrich	L8000	Powder
L-lysine	Sigma-Aldrich	L5501	Powder
L-methionine	Sigma-Aldrich	M9625	Powder
L-phenylalanine	Sigma-Aldrich	P2126	Powder
L-proline	Sigma-Aldrich	P0380	Powder
L-serine	Sigma-Aldrich	S4500	Powder
L-threonine	Sigma-Aldrich	T8625	Powder
L-tryptophan	Sigma-Aldrich	T0254	Powder
L-tyrosine	Sigma-Aldrich	T3754	Powder
L-valine	Sigma-Aldrich	V0500	Powder
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506	Powder
Methanol	VWR	BDH1135-4LP	Flammable liquid, store in flammables cabinet
Nitrocellulose	GE Health	10600002	Keep in protective sheath until use
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	60356	Powder
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P9791	Powder
Potassium sulfate	Sigma-Aldrich	P0772	Powder
Potato starch	Sigma-Aldrich	S4251	Powder
Reduced glutathione	Sigma-Aldrich	G4251	Handle carefully. Can oxidize easily.
S100A7	N/A	N/A	We are supplied with this by a collaborator
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Powder
Sodium chloride	VWR	470302	Powder
Sodium citrate	Fisher	S279	Powder
Sodium hydroxide	Acros Organics	383040010	Highly hygroscopic
Thiamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	T4625	Powder
Thiamine pyrophosphate	Sigma-Aldrich	C8754	Also called cocarboxylase
TPEN	Sigma-Aldrich	P4413	Powder
Tris	VWR	497	Powder
Uracil	Sigma-Aldrich	U0750	Powder
Zinc sulfte heptahydrate	Sigma-Aldrich	204986	Irritant, do not inhale