Очистка фибробластов и клеток Шванн от сенсорных и моторных нервов в vitro

Основными клетками периферической нервной системы являются клетки Шванн (СК) и фибробласты. Обе эти клетки отчетливо выражают сенсорные и моторные фенотипы, участвующие в различных моделях экспрессии генов нейротрофического фактора и других биологических процессов, влияющих на регенерацию нервов. В настоящем исследовании установлен протокол для получения высокоочищенных крыс сенсорных и моторных ОВ и фибробластов быстрее. Вентральный корень (моторный нерв) и спинной корень (сенсорный нерв) неонатальных крыс (7-дней) были разобщены и клетки были культивируются в течение 4-5 дней, а затем изоляции сенсорных и моторных фибробластов и SC путем сочетания дифференциального пищеварения и дифференциальных методов последовательно. Результаты иммуноцитохимии и анализа цитометрии потока показали, что чистота сенсорных и моторных ОК и фибробластов составила 90%. Этот протокол может быть использован для получения большого количества сенсорных и моторных фибробластов / SCs быстрее, способствуя исследованию сенсорной и регенерации моторных нервов.

Введение

В периферической нервной системе нервные волокна в основном состоят из аксонов, клеток Шванн (СК) и фибробластов, а также содержит небольшое количество макрофагов, микрососудистых эндотелиальных клеток и иммунных клеток^1. SCs обернуть аксоны в соотношении 1:1 и заключены с помощью слоя соединительной ткани, называемого эндонеуриум. Аксоны затем в комплекте вместе, чтобы сформировать группы, называемые fascicles, и каждая фасцикля завернутый в слой соединительной ткани, известный как промежности. Наконец, все нервное волокно завернуто в слой соединительной ткани, который называется эпинеури. В эндонеуриум, вся популяция клеток состоит из 48% ОК, и значительная часть оставшихся клеток включает фибробласты². Кроме того, фибробласты являются важными компонентами всех нервных отсеков, включая эпинеуриум, промежную и эндонеуриум^3. Многие исследования показали, что ХК и фибробласты играют решающую роль в процессе регенерации после травмы периферического нерва^4,^,^5,^,⁶. После трансекции периферического нерва, проницаемые фибробласты регулируют сортировку клеток через эпирин-B/EphB2 сигнальный путь между ОК и фибробластами, дальнейшее руководство аксональным отрастанием через раны^5. Периферические нервные фибробласты выделяют белок тенасцин-С и усиливают миграцию ХК во время регенерации нервов через сигнальный путь⁷1-интегрин. Тем не менее, ТС и фибробласты, используемые в вышеуказанных исследованиях, были получены из седалищного нерва, который включает в себя как сенсорные, так и моторные нервы.

В периферической нервной системе сенсорные нервы (афферентные нервы) проводят сенсорную сигнализацию от рецепторов к центральной нервной системе (ЦНС), в то время как моторные нервы (эфферентные нервы) проводят сигналы от ЦНС к мышцам. Предыдущие исследования показали, что РК выражают различные моторные и сенсорные фенотипы и выделяют нейротрофические факторы для поддержки периферической регенерации нервов^8,^,⁹. Согласно недавнему исследованию, фибробласты также выражают различные двигательные и сенсорные фенотипы и влияют на миграцию SCs^10. Таким образом, изучение различий между моторными и сенсорными фибробластами нервов/ТС позволяет нам изучать сложные основные молекулярные механизмы периферической регенерации нервов.

В настоящее время существует множество способов очищения ОВ и фибробластов, включая применение антимитических агентов, антител-опосредованного цитолиза^11,^,^12,последовательного иммунопанирования¹³ и ламинина субстратом^14. Однако все вышеперечисленные методы удаляют фибробласты и сохраняют только НК. Высоко очищенные РК и фибробласты могут быть получены с помощью технологии сортировки цитометрии^{потока 15,}но это трудоемкая и дорогостоящая техника. Таким образом, в этом исследовании, простой дифференциальный пищеварения и дифференциального присоединения метод для очистки и изоляции сенсорных и моторных фибробластов нерва и РС был разработан для того, чтобы получить большое количество фибробластов и ОВ быстрее.

протокол

Данное исследование было проведено в соответствии с Руководящими принципами институционального ухода за животными Университета Нантонга. Все процедуры, включая животных субъектов были этически одобрены Административным комитетом экспериментальных животных, провинция Цзянсу, Китай.

1. Изоляция и культура двигательных и сенсорных фибробластов нерва и НК

Используйте семидневных крыс Sprague-Dawley (SD) (n'4), предоставленных Экспериментальным центром животных Нантонгского университета Китая. Поместите крыс в бак, содержащий 5% изофлуран в течение 2-3 минут, дайте животным медленно дышать и не имеют самостоятельной деятельности, а затем дезинфицировать с помощью 75% этанола до обезглавливания.
Используйте ножницы, чтобы сократить заднюю кожу около 3 см и удалить позвоночник. Откройте позвоночный канал тщательно, чтобы разоблачить спинной мозг.
Поддерживайте спинной мозг в 60 мм чашке Петри с 2-3 мл сбалансированным солевым раствором D-Hanks (HBSS).
Основываясь на анатомической структуре, отведение вентральный корень (моторный нерв), а затем спинной корень (сенсорный нерв) под рассекающим микроскопом. Затем поместите их в ледяной раствор соли D-Hanks (HBSS).
После удаления HBSS, нарезать нервы на 3-5 мм штук с ножницами и переварить с 1 мл 0,25% (w/v) трипсин при 37 градусов по Цельсию в течение 18-20 мин. Далее, дополнение с 3-4 мЛ DMEM содержащие 10% плода бычьей сыворотки (FBS), чтобы остановить пищеварение.
Pipette смесь вверх и вниз осторожно около 10 раз и центрифуги на 800 х г в течение 5 минут. После этого отбросьте супернатант и приостановите осадку в 2-3 мл DMEM, дополненном 10% FBS.
Фильтр клеточной подвески с помощью фильтра 400 сетки, а затем привить клетки в 60 мм Петри блюдо и культуры при 37 градусов по Цельсию в присутствии 5% CO₂. После 4-5 дней культивирования, изолировать проход 0 (p0) фибробластов и ОВ после достижения 90% слияния.
Изоляция и культура ТС(рисунок 1)
1. Вымойте клетки один раз с помощью 1x PBS. Добавьте 1 мл 0,25% (w/v) трипсина (37 градусов по Цельсию) на 60 мм чашку Петри, чтобы переварить клетки в течение 8-10 с при комнатной температуре. После этого, добавить 3 мЛ DMEM дополняется 10% FBS, чтобы остановить пищеварение.
2. Аккуратно взорвать смесь, чтобы отсоединить SCs с пипеткой. Затем собирайте и центрифужщите SCs при 800 х г в течение 5 минут.
3. Отбросьте супернатант и приостановите осадок в 3 мл DMEM с 10% FBS, 1% пенициллином/стрептомицином, 2 мл форсколина и 10 нг/мл HRG, а затем привить клетки в неокрашенной 60 мм чашке Петри. После культивирования при 37 градусах в течение 30-45 мин фибробласты (несколько фибробластов перевариваются с помощью ОК) прикрепляются к нижней части блюда.
4. Перенесите супернатант (включая SCs) в другой поли-L-лизин (PLL) со покрытием среднего блюда и культуры при 37 градусов по Цельсию в течение 2 дней.
Изоляция и культура фибробластов(рисунок 1)
1. После удаления ТС (как показано в шаге 1.8), мыть оставшиеся фибробласты в блюдах с 1x PBS, а затем добавить 1 мл 0,25% (w/v) trypsin переварить фибробласты в течение 2 минут при 37 градусов по Цельсию.
2. Добавить DMEM дополнен 10% FBS, чтобы положить конец пищеварению. Удар фибробластов с помощью пипетки, а затем собирать и центрифуг их на 800 х г в течение 5 минут.
3. Отбросьте супернатант, приостановите осадок с 2 мЛ DMEM, содержащим 10% FBS, а затем привить клетки в неокрашенном 60 мм чашке Петри. Фибробласты после культивирования в течение 30-45 мин при 37 градусах Цельсия прикрепляются к нижней части блюда. Откажитесь от супернатанта (в том числе нескольких номеров SCs). Затем добавьте 3 мЛ DMEM, дополненный 10% FBS в блюдо фибробластов и культуры при 37 градусов по Цельсию в течение 2 дней.
Прохождение ячеек p1 до тех пор, пока они не достигнут 90% слияния. Затем очистить их дифференциальным пищеварением и дифференциальным присоединением снова, как описано в разделах 1.8 и 1.9.
Переварить p2 фибробластов и СК после культивирования в течение 2 дней, а затем собирать клетки, считать и прививать в 1 х 10⁵ чисел / хорошо на PLL покрытием слайды для иммуноцинохимии (ICC).

2. МУС для определения чистоты клеток

Культура клеток для 24 ч при температуре 37 градусов по Цельсию и выполнять ICC окрашивания после дифференциального пищеварения и дифференциального соблюдения двигательных и сенсорных фибробластов и SCs.
Вымойте двигательные и сенсорные фибробласты и SCs с 1x PBS и исправить их в 200 мл/ хорошо 4% параформальдегида (рН 7,4) в течение 18 мин при комнатной температуре.
Блокируйте образец SCs с блокирующим буфером (0.1% Triton X-100 в 0.01 M PBS, содержащий 5% козью сыворотку) и блокируйте образец фибробластов с блокирующим буфером (0.01 M PBS, содержащим 5% козьей сыворотки) в течение 45 минут при 37 градусах после мытья их с помощью PBS трижды.
Удалите блокирующий буфер, и инкубировать со следующими первичными антителами: мышь моноклональных анти-CD90 антитела (специфический маркер для фибробластов) (1:1000) для фибробластов и мыши анти-S100 антитела (специфический маркер для SCs) (1:400) для SCs на 4 кк ночь.
Откажитесь от первичных антител, мыть с PBS трижды, и инкубировать со следующими вторичными антителами: Alexa Fluor 594 козы анти-мышеловки IgG (1:400) для фибробластов и 488-конъюгированных коз анти-мышь IgG (1:400) для SCs при комнатной температуре для 1,5 ч.
Вымойте образцы трижды с PBS, и пятно ядер с 5 мкг / мл Hoechst 33342 красителя в течение 10 минут при комнатной температуре. Вымойте образец с 1x PBS трижды и смонтировать их с помощью монтажа среды (20 мл/ слайд) на стеклянной слайде.
Возьмите фотографии клеток с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа в трех случайных полях для каждого колодца. Оцените общее количество ядер и CD90-положительных клеток, S100-положительных клеток, а затем рассчитать процент CD90-положительных клеток и S100-положительных клеток, соответственно. Выполните окрашивание в трипликате.

3. Анализ цитометрии потока (FCA) для определения чистоты клеток

Оцените чистоту моторных и сенсорных фибробластов и ОК, как описано ранее FCA¹⁶. Кратко переварить p2 двигатель и сенсорные фибробласты и SCs с 0,25% (w/v) трипсин, повторно клеточных гранул и инкубировать их в среде фиксации при комнатной температуре в течение 15 мин.
Инкубировать клетки с permeabilization среды и зонда с помощью мыши моноклональных анти-CD90 антитела (0,1 мкг/10⁶ клеток, 200 мл) для фибробластов и мыши анти-S100 антитела (1:400, 200 мл) для SCs при комнатной температуре в течение 30 мин, соответственно.
Инкубировать клетки с 488-конъюгированных коза анти-мышь IgG в течение 30 мин. Используйте калибр FACS для выполнения потока цитометрии, и анализировать данные с помощью программного обеспечения Cell Квест.
Инкубировать клетки только с 488-конъюгированных коз анти-мышей IgG (фибробласты группы) и мыши IgG1 каппа (MOPC-21) (FITC) - Изотип управления (группа ТС), который служит в качестве отрицательного контроля.

4. Статистический анализ

Представить все данные в качестве средства - SEM. Оцените статистические различия в данных с помощью неспаренных т-тестовс помощью GraphPad Prism 6.0. Установить статистическую значимость на уровне р-л;0,05. p Выполните все анализы в трипликате.

Результаты

Световое микроскопическое наблюдение
SCs и фибробласты являются двумя основными группами клеток, полученных в первичной клеточной культуре из нервных тканей. После прививки на 1 ч, большинство клеток придерживались нижней части блюда, и морфология клетки из...

Обсуждение

Две основные популяции клеток периферических нервов включали ХК и фибробласты. В первую очередь культивируемые фибробласты и ТЦ могут точно помочь в моделировании физиологии фибробластов и ОК во время развития и регенерации периферических нервов. Исследование показало, что P7 крысины...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (Грант No 2017YFA010104703), Национальным природным фондом Китая (Грант No 31500927).

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG(H+L)	Life Technologies	A11005	Dilution: 1:400
CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)	Proteintech	SA00013-1	Dilution: 1:400
Confocal laser scanning microscope	Leica Microsystems	TCS SP5
Cell Quest software	Becton Dickinson Biosciences
D-Hank's balanced salt solution	Gibco	14170112
DMEM	Corning	10-013-CV
Dissecting microscope	Olympus	SZ2-ILST
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10099-141C
Forskolin	Sigma	F6886-10MG
Fluoroshield Mounting Medium	Abcam	ab104135
Fixation medium/Permeabilization medium	Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD	GAS005
Flow cytometry	Becton Dickinson Biosciences	FACS Calibur
Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Isotype Control	Abcam	ab106163	Dilution: 1:400
Mouse monoclonal anti-CD90 antibody	Abcam	ab225	Dilution: 1:1000 for ICC, 0.1 µg for 10⁶ cells for Flow Cyt
Mouse anti-S100 antibody	Abcam	ab212816	Dilution: 1:400
Polylysine (PLL)	Sigma	P4832
Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain Protein	R&D Systems	396-HB-050
0.25% (w/v) trypsin	Gibco	25200-072