Immunolocalizzazione fluorescente delle proteine arabinogalactane e delle pectine nella parete cellulare dei tessuti vegetali

Riepilogo

Questo protocollo descrive in dettaglio come viene fissato il materiale vegetale per l'immunolocalizzazione delle proteine arabinogalactane e delle pectine, incorporato in una resina acrilica idrofila, sezionale e montato su vetrini. Mostriamo che gli epitopi correlati alla parete cellulare verranno rilevati con anticorpi specifici.

Abstract

Lo sviluppo dell'impianto comporta regolazioni costanti della composizione e della struttura della parete cellulare in risposta a stimoli sia interni che esterni. Le pareti cellulari sono composte da cellulosa e polisaccaridi non cellulosici insieme a proteine, composti fenolici e acqua. Il 90% della parete cellulare è composto da polisaccaridi (ad esempio, pectine) e proteine arabinogalactane (ARP). L'immunolocalizzazione fluorescente di specifici epitopi glicani nelle sezioni istologiche vegetali rimane uno strumento chiave per scoprire il rimodellamento delle reti, della struttura e dei componenti del polisaccaride delle pareti.

Qui, segnalamo una procedura di immunolocalizzazione fluorescente ottimizzata per rilevare epitopi glicani da ARP e pectine nei tessuti vegetali. La fissazione della paraformaldeide/glutaraldeide è stata utilizzata insieme all'incorporamento LR-White dei campioni vegetali, consentendo una migliore conservazione della struttura e della composizione dei tessuti. Sezioni sottili dei campioni incorporati ottenuti con un ultra-microtomo sono state utilizzate per l'immunolocalizzazione con anticorpi specifici. Questa tecnica offre grande risoluzione, alta specificità e la possibilità di rilevare più epitopi glicani nello stesso campione. Questa tecnica consente la localizzazione subcellulare dei glicani e rileva il loro livello di accumulo nella parete cellulare. Consente inoltre la determinazione dei modelli spazio-temporali di distribuzione dell'AGP e della pectina durante i processi di sviluppo. L'uso di questo strumento può in ultima analisi guidare le direzioni di ricerca e collegare i glicani a funzioni specifiche nelle piante. Inoltre, le informazioni ottenute possono integrare gli studi biochimici e di espressione genica.

Introduzione

Le pareti delle cellule vegetali sono strutture complesse composte da polisaccaridi e glicoproteine. Le pareti cellulari sono strutture estremamente dinamiche la cui architettura, organizzazione e composizione variano a seconda del tipo di cella, della localizzazione, dello stadio di sviluppo, degli stimoli esterni e interni^1. Le proteine arabinogalactane (ARP) e le pectine sono componenti importanti della parete cellulare della pianta. Gli ARP sono proteine altamente glicosilate e le pectine sono polisaccaridi omogalattivonan la cui composizione, quantità e struttura variano notevolmente durante le diverse fasi di sviluppo delle^{piante 2,3,4}. ARP e studi sulla pectina hanno rivelato il loro coinvolgimento in diversi processi vegetali come la morte cellulare programmata, la risposta a stress abiotici, la riproduzione delle piante sessuali, tra molti^{altri 5}. La maggior parte di questi studi è iniziata con informazioni ottenute da studi di immunolocalizzazione.

Data la sua complessità, lo studio delle pareti cellulari richiede molti strumenti diversi. Il rilevamento di epitopi glicani utilizzando anticorpi monoclonali (mAbs) è un approccio prezioso per risolvere la distribuzione di polisaccaride e glicoproteina lungo questa struttura. C'è una vasta collezione di mAb disponibili per rilevare epitopi glicani e la specificità di ogni mAb viene continuamente migliorata^{anche 6}. La tecnica qui descritta è applicabile a tutte le specie vegetali ed è uno strumento perfetto per guidare le direzioni di ricerca future che potrebbero comportare tecniche più costose e complesse.

In questa tecnica, anticorpi specifici sono coniugati chimicamente a coloranti fluorescenti come FITC (isotiocianato di fluoresceina), TRITC (tetrametillrhodamina-5-(e 6)-isotiocianato) o diversi coloranti Alexa Fluor. L'immunofluorescenza offre diversi vantaggi, consentendo una localizzazione subcellulare chiara e rapida dei glicani che possono essere osservati direttamente al microscopio a fluorescenza. È altamente specifico e sensibile, poiché la preparazione del campione può proteggere efficacemente la struttura naturale dell'antigene, anche se presente in quantità inferiori. Consente il rilevamento di più antigeni nello stesso campione e, cosa più importante, offre risultati di alta qualità e visivamente belli. Nonostante la grande potenza offerta dagli studi di immunolocalizzazione a fluorescenza, sono spesso considerati difficili da eseguire e implementare molto probabilmente a causa della mancanza di protocolli dettagliati che consentono la visualizzazione delle diverse fasi della procedura. Qui, forniamo alcune semplici linee guida su come eseguire questa tecnica e su come ottenere immagini di alta qualità.

Per il protocollo qui presentato, i campioni devono prima essere corretti e incorporati utilizzando il fissatore più appropriato. Sebbene considerata una tecnica dispendiosa in termini di tempo e relativamente noiosa, una corretta fissazione e incorporamento del campione vegetale è la chiave per garantire un test di immunolocalizzazione di successo. A questo scopo, il più comune è la fissazione chimica usando fissanti reticali, come le aldeidi. I fissatori incrociati stabiliscono legami chimici tra molecole del tessuto, stabilizzando e indurendo il campione. La formaldeide e la glutaraldeide sono fissivi di collegamento incrociato e talvolta viene utilizzata una combinazione di entrambi i fissivi⁷. La formaldeide offre una grande conservazione strutturale dei tessuti e per lunghi periodi di tempo, producendo piccole retrazioni tissutali ed essendo compatibile con l'immunostaining. La glutaraldeide è un fissatore più forte e stabile solitamente usato in combinazione con la formaldeide. L'uso della glutaraldeide ha alcuni svantaggi che devono essere presi in considerazione in quanto introduce alcuni gruppi di aldeide liberi nel tessuto fisso, che possono generare qualche etichettatura aspecifica. Anche il collegamento incrociato tra proteine e altre molecole occasionalmente può rendere alcuni epitopi bersaglio inaccessibili per gli anticorpi. Per evitare ciò, la quantità e la durata della fissazione devono essere accuratamente definite.

Dopo la fissazione, i campioni vengono incorporati nella resina corretta per indurirsi prima di ottenere le sezioni. La resina acrilica London Resin (LR-White) è la resina preferita per gli studi di immunolocalizzazione. A differenza di altre resine, LR-White è idrofilo, permettendo agli anticorpi di raggiungere i loro antigeni, senza bisogno di alcun trattamento per facilitarlo. LR-White ha anche il vantaggio di offrire una bassa autofluorescenza, consentendo una riduzione del rumore di fondo durante l'imaging ad immunofluorescenza.

Ci sono molte tecniche di colorazione disponibili per rilevare diversi componenti della parete cellulare, come la colorazione blu alciana, la colorazione blu toluidina o la colorazione periodica acido-schiff (PAS). Nessuno di questi offre il potere delle analisi di immunolocalizzazione⁸. Questo approccio fornisce una maggiore specificità nel rilevamento dei glicani, offrendo informazioni più vaste sulla composizione e la struttura della parete cellulare.

Protocollo

1. Preparazione del campione: fissazione, disidratazione e incorporamento LR-White

1. Fissazione e disidratazione
   NOTA: il processo di fissazione è fondamentale per preservare il campione; incrociando le molecole il metabolismo cellulare viene interrotto, garantendo l'integrità cellulare e prevenendo la diffusione molecolare. Gli agenti fissivi e la concentrazione utilizzata devono essere adeguati a tale scopo, lasciando gli antigeni sufficientemente esposti per interagire con gli anticorpi. Il seguente protocollo combina la lieve capacità fissativa della paraformaldeide, con l'effetto più forte della glutaraldeide. Le loro proporzioni sono state ottimizzate per ARP e componenti delle pareti cellulari, ma è adatto ad altre proteine e strutture cellulari. Il successivo processo di disidratazione preparerà i campioni per l'incorporamento LR-White. Tessuti vegetali di diverse specie vegetali sono stati utilizzati in questo esperimento. Campioni di Quercus suber sono stati raccolti da alberi coltivati nel campo. I campioni di submersa trithuria sono stati gentilmente condivisi con noi da Paula Rudall (Kew Gardens, Londra, Regno Unito).
   1. Seminare tutte le piante arabidopsis direttamente sul terreno e crescere in un impianto di crescita interna con 60% di umidità relativa e un ciclo giorno/notte di 16 ore di luce a 21 °C e 8 ore di buio a 18 °C. Selezionare i tessuti vegetali da analizzare e tagliare i campioni in modo che non siano di dimensioni superiori a 16 mm^2.
   2. Trasferire immediatamente il campione su una fiala di vetro precedentemente riempita con una soluzione fissante a freddo sufficiente (2% di formaldeide (w/v), 2,5% di glutaraldeide (w/v), 25 mM PIPES pH 7 e 0,001% Tween-20 (v/v)) per immergere completamente i campioni(figura 1A).
      ATTENZIONE: Formaldeide e glutaraldeide sono entrambi agenti fissivi che possono essere dannosi per inalazione e contatto. Eseguire la fase di fissazione su un cappuccio dei fumi e indossare indumenti protettivi adeguati e guanti in nitrile. Tutte le soluzioni da questo passo in poi, comprese le serie di alcol fino al 70%, devono essere conservate per una successiva decontaminazione da parte di personale specializzato.
   3. Dopo aver raccolto tutti i campioni, aggiornare il fissatore.
   4. Trasferire i flaconcini in una camera a vuoto e applicare lentamente il vuoto. Una volta raggiunto -60 kPa, il materiale galleggiante inizierà ad affondare sul fondo del flaconcino (Figura 1B).
   5. Conservare sotto vuoto non più di -80 kPa per 2 ore a temperatura ambiente.
   6. Rilasciare lentamente il vuoto, sigillare il flaconcino di vetro e posizionarlo durante la notte a 4 °C.
   7. Scartare tutti i campioni che non hanno affondato durante la fissazione notturna. Lavare i campioni rimanenti con 25 mM PBS pH 7 per 10 min, seguito da un lavaggio di 20 minuti in tampone pipes pH 7.2 da 25 mM PIPES.
   8. Disidratare i campioni in una serie di etanolo (25%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90% e 3x 100% etanolo) per 20 minuti ciascuno. Trasferire immediatamente i campioni disidratati su flaconcini di vetro etichettati per l'incorporamento (Figura 1C).
      NOTA: Il processo di disidratazione può essere messo in pausa nella fase del 70% di etanolo.
2. Incorporamento in resina LR-White
   NOTA: LR-white è una resina acrilica non idrofobica a bassa viscosità, che la rende ideale per penetrare tessuti con molti strati di pareti cellulari spesse. LR-White è disponibile anche in diversi gradi di durezza compatibili per il taglio della maggior parte dei campioni di impianto. Assicurarsi che la resina usata sia già fornita con il corretto catalizzatore miscelato o seguire le istruzioni del fornitore per preparare la resina. Il seguente processo di incorporamento è lento, ma i risultati giustificano notevolmente i mezzi.
   1. Perfondere i campioni incubando con la resina LR-White in una serie di concentrazione crescente di resina (1:3, 2:3, 1:1, 3:2, 3:1, 1:0) in etanolo, incubando per 24 ore a 4 °C in ogni fase.
      ATTENZIONE: La resina LR-White è una resina acrilica a bassa tossicità; tuttavia, può essere irritante per la pelle per contatto e inalazione. Si consiglia vivamente di lavorare in un'area ben ventilata o sotto una cappa aspirante con un'adeguata usura protettiva e guanti in nitrile.
   2. Rinfrescare la resina lr-bianca e incubare per ulteriori 12 ore a 4 °C.
   3. Preparare capsule di gelatina di incorporamento di dimensioni appropriate (dimensioni 1 (0,5 mL) per campioni fino a 3 mm, 2 x 0,37 mL per campioni fino a 5 mm o 3 x 0,3 mL per campioni fino a 8 mm e etichette di carta(figura 1D).
      NOTA: Selezionare la dimensione della capsula in modo che sia leggermente più grande del campione, in modo che il campione possa essere completamente racchiuso nella resina. Inoltre, ricorda di etichettare le etichette con una matita, perché penna o inchiostri stampati contamineranno la resina, rovinando il campione.
   4. Applicare una goccia di resina fresca LR-bianca sul fondo di ogni capsula.
   5. Mettere un campione in ogni capsula di gelatina e riempire alla massima capacità con resina fresca. Posizionare il cappuccio della capsula e premere delicatamente per formare una guarnizione ermetica (Figura 1E).
   6. Polimerizzare la resina per 24-48 ore a 58 °C o fino a completo indurimento.
   7. Conservare i campioni a temperatura ambiente.
      NOTA: La resina LR-bianca post polimerizzazione è inerte.

2. Preparazione delle diapositive

NOTA: I vetrini devono essere puliti, senza polvere, grasso o altri contaminanti. Anche le nuove diapositive devono essere pulite poiché alcuni fornitori utilizzano oli e detergenti per evitare che le diapositive si attacchino. Qualsiasi grasso o detergente interferirà con l'adesione della sezione allo scivolo, anche se trattato con poli-L-lisina. Lanugine e la polvere influenzeranno le osservazioni del campione e molto probabilmente rovineranno l'esperimento. Gli scivoli rivestiti in teflon con pozzi di reazione sono perfetti per questo compito. Sono convenienti, riutilizzabili e riducono drasticamente la quantità di soluzione anticorpale necessaria. Con una corretta pulizia, l'immunolocalizzazione fluorescente di ottima qualità può essere eseguita a un costo molto conveniente.

1. Lavaggio scivolo
   1. Posizionare le diapositive in un rack di colorazione e coprire con soluzione detergente (0,1% SDS (w/v), 1% acido acetico (v/v), 10% etanolo (v/v)).
   2. Mantenere una lieve agitazione per 20 minuti.
   3. Trasferire i rack di colorazione in un bagno ddH₂O con lieve agitazione per 10 minuti. Ripeti 4 volte.
   4. Scolare accuratamente i rack prima di immergersi brevemente in etanolo al 100% e lasciare asciugare gli scivoli in un ambiente privo di polvere.
   5. Conservare fino all'uso.
2. Rivestimento in poli-L-lisina (opzionale)
   NOTA: Le piccole sezioni di solito si attaccano molto bene alle diapositive di vetro pulite. Questo passaggio è consigliato solo per sezioni più grandi (>2 mm²). Le sezioni più grandi tendono a piegarsi e rughe e non sono raccomandabili. Tuttavia, se necessario, utilizzare diapositive di reazione con fori più grandi. Puliscili come sopra e procedi come segue.
   1. Posizionare diapositive pulite in una piastra di Petri quadrata. Pipetta soluzione di poli-L-lisina allo 0,001% (w/v) per coprire i fori delle diapositive, senza traboccare.
   2. Lasciare asciugare gli scivoli durante la notte a 40 °C in piastre di Petri chiuse.
      NOTA: I vetrini rivestiti sono pronti per l'uso immediato e possono essere conservati in un ambiente privo di polvere a temperatura ambiente, per diversi mesi.

3. Rifilatura e sessatura del campione

1. Rifilatura di esempio
   1. Con una lama affilata, tagliare i blocchi LR-White sotto uno stereomicroscopio per formare una struttura a forma di piramide in cui l'apice è perpendicolare all'area di interesse del campione (Figura supplementare 1A).
      NOTA: Il supporto per campioni ultra-microtomi è uno strumento eccellente per fissare il blocco. Se il dispositivo non dispone di un supporto per campioni universale, utilizzare quello più adatto per i blocchi rotondi.
   2. Tagliare la struttura piramidale rimuovendo le fette sottili della resina in eccesso perpendicolarmente all'asse principale della piramide.
   3. Procedere fino a raggiungere il campione formando la superficie di taglio. All'interno della superficie di taglio, il campione di destinazione dovrebbe idealmente essere racchiuso in una forma trapezoidale.
      NOTA: Il blocco di resina può essere ulteriormente tagliato con un angolo di fessurazione per ridurre la superficie della sezione con una lama affilata (Figura 1F).
2. Sessatura semisottile
   NOTA: Verrà utilizzato un microtomo con coltelli di vetro. La capacità dell'anticorpo di legarsi all'epitopo condizionerà il successo della reazione immunoetichettatura. La natura idrofila della resina LR-White consentirà un buon contatto degli anticorpi con le sezioni del campione. Sezioni più sottili presenteranno la colorazione Calcofluor più debole che verrà utilizzata per aiutare a localizzare le sezioni e assistere con il processo di imaging. Lo stesso vale per altre macchie che potrebbero essere applicate in seguito. Anche lo spessore eccessivo influenzerà la qualità dell'acquisizione dell'immagine. Un buon compromesso per lo spessore della sezione può essere trovato tra 200 e 700 nm, a seconda delle caratteristiche tissutali. Montare i blocchi saldamente sul supporto del campione dell'ultra-microtomo.
   1. Con un ultra-microtomo, creare sezioni con uno spessore compreso tra 200 e 700 nm (Figura 1G).
   2. Controllare l'area della sezione trasferendo alcune sezioni in una goccia ddH₂O su uno scivolo di vetro. Posizionare lo scivolo su una piastra calda a 50 °C fino a quando l'acqua evapora. Macchia che posiziona un calo dell'1% di Toluidina Blue O (w/v) in soluzione di acido borico all'1% (w/v) sulle sezioni per 30 s. Risciacquare e osservare al microscopio.
   3. Dopo aver trovato la struttura desiderata, trasferire una o due sezioni ad ogni goccia di ddH₂O precedentemente posizionata su ogni pozzo di una diapositiva di reazione pulita.
   4. Posizionare ogni scivolo in una piastra di petri quadrata chiusa di 10 cm e lasciarla asciugare a 50 °C.
   5. Archiviare le diapositive in una casella di archiviazione pulita fino all'uso.

4. Immunolocalizzazione

NOTA: La procedura di immunolocalizzazione fluorescente si basa sull'uso sequenziale di due anticorpi. L'anticorpo primario viene sollevato contro uno specifico antigene bersaglio. L'anticorpo secondario viene sollevato specificamente contro l'anticorpo primario e per le tecniche fluorescenti è coniugato a un fluorofore (FITC in questo specifico protocollo). L'anticorpo primario sarà utilizzato per rilevare l'antigene bersaglio nel campione e l'anticorpo secondario verrà utilizzato per contrassegnare il luogo in cui l'anticorpo primario collegato al campione dopo aver lavato via l'eccesso di anticorpo primario. I controlli sono una parte importante di questo saggio e devono sempre essere eseguiti per garantire l'accuratezza delle osservazioni. Un pozzo sullo scivolo dovrebbe essere riservato all'uso come controllo negativo, dove il trattamento anticorpale primario verrà saltato, e quindi nessun segnale dovrebbe essere osservato alla fine dell'esperimento. Un controllo positivo deve essere incluso nell'esperimento trattando un bene con un anticorpo che l'etichettatura è già nota e certa. Il controllo positivo viene utilizzato per confermare l'efficacia e le condizioni di reazione dell'etichettatura degli anticorpi secondari mentre il controllo negativo verifica la specificità dell'anticorpo secondario.

1. Preparare una camera di incubazione posizionando alcuni tovaglioli di carta smorzati nella parte inferiore di una scatola di punte di pipetta e avvolgendolo con un foglio di latta(Figura supplementare 1B-1E). Posizionare le diapositive nella camera di incubazione.
2. Pipettare una goccia di 50 μL per 8 mm di pozzo di soluzione di blocco (5% di latte secco non grasso (w/v) in 1 M PBS) e incubare per 10 min. Rimuovere la soluzione di blocco e lavare tutti i pozzi due volte con PBS per 10 minuti.
3. Preparare le soluzioni anticorpali primarie (vedi tabella supplementare 1), 1:5 (v/v) anticorpo in soluzione di blocco; fare una stima di circa 40 μL per 8 mm di pozzo.
   NOTA: La concentrazione dell'anticorpo deve essere regolata secondo il protocollo della fabbricazione.
4. Eseguire un lavaggio finale con ddH₂O per 5 minuti, non lasciare mai asciugare completamente i pozzi.
5. Pipetta la soluzione anticorpale primaria ai pozzi di reazione. Soluzione di bloccaggio pipetta ai pozzi di controllo.
6. Chiudere la camera di incubazione e lasciare riposare per 2 ore a temperatura ambiente seguita da pernottamento a 4 °C. Preparare la soluzione anticorpale secondaria, 1% in soluzione di blocco (v/v) circa 40 μL per pozzo. Tienilo coperto di lamina di latta.
7. Lavare tutti i pozzi due volte con PBS per 10 minuti, seguito da 10 minuti aggiuntivi con ddH₂O. Assicurarsi che nessuna traccia della soluzione di blocco o dei depositi sia visibile sui pozzi.
8. Pipettare la soluzione anticorpale secondaria a tutti i pozzi. D'ora in ora in su, proteggi le diapositive dalla luce.
9. Incubare per 3-4 ore al buio a temperatura ambiente.
10. Lavare tutti i pozzi due volte per 10 minuti con PBS seguito da un altro lavaggio di 10 minuti con ddH₂O.
11. Applicare una goccia di calcofluor (1:10.000 (con v) fluorescente più luminosa 28 in PBS) su ciascun pozzo. Senza lavaggio, applicare una goccia di mezzo di montaggio (vedere Tabella dei materiali) su ciascun pozzo e posizionare un coverslip ( Figura1H).
12. Osservare con un microscopio a fluorescenza, dotato di lente 10x/0.45, 20x/0.75, 40x/0.95 e 100x/1.40, utilizzare filtri UV (per calcofluoro) e FITC, rispettivamente per rilevare la parete cellulare e l'immunolocalizzazione(figura 1I). Utilizzare le seguenti lunghezze d'onda: eccitazione/emissione (nm) 358/461 per UV e 485/530 per FITC.
13. Per una migliore visualizzazione dei risultati, sovrapporre entrambe le immagini a ImageJ o simili.

Risultati

In un esperimento riuscito, l'anticorpo secondario intaserà specificamente la posizione dell'epitopo specifico in verde brillante, in modo coerente, consentendo la caratterizzazione della composizione della parete cellulare in una certa fase di sviluppo della cellula, del tessuto o dell'organo. Ad esempio l'anticorpo LM6 ha un'alta affinità per 1,5-arabinan, un composto con rhamnogalacturonan di tipo I che può essere trovato abbondantemente etichettando la parete cellulare dell'anther Quercus suber in via di ...

Discussione

Il metodo di immunolocalizzazione fluorescente nelle piante qui descritto, sebbene perfettamente semplice, si basa sul successo di diversi piccoli passaggi. Il primo dei quali è la preparazione e la fissazione del campione. Durante questo primo passaggio, una miscela di formaldeide e glutaraldeide viene utilizzata per collegare la maggior parte dei componenti cellulari. La formaldeide nella soluzione fornisce una fissazione lieve e reversibile mentre la glutaraldeide fornisce un forte collegamento più permanente; l'equ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
25% (w/v) Gluteraldehyde	Agar Scientific	AGR1010	aq. Solution, methanol free
8 wells Glass reaction slides	Marinfeld	MARI1216750	other brands may be used
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produce in GOAT	Sigma-Aldrich	F6258
cover slips, 24 mm x 50 mm	Marinfeld	MARI0100222	The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used
ddH2O	na	na
Ethanol absolute	na	na
Fluorescent brightner 28	Sigma-Aldrich	F-6259
Gelatin capsules	Agar scientific	AGG29211	The capsule size sould feat the size of the sample.
Glass vials	na	na	Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be clean with 96% etanol after use to remove LR-White residue and reused.
LR-white medium grade, embdeding resin	Agar Scientific	AGR1281	LR-White comes in several forms the medium grade provides na adequate cutting suport for most tissues for harder tissues a harder grade of LR-white may be recomendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please folow the instructions of the suplier to prepare the resin.
Non fat dry milk	Nestlé	na	any non fat dry milk is adequate
Oven	na	na	generic laboratory oven
Petri dish, 10 cm x 10 cm square	na	na
PIPES	Sigma Aldrich	P1851
Rat generated Monoclonal Anti-Body	Plant probes	na	Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1
Razor blades	na	na	regular razor blades
SDS	Sigma-Aldrich	L6026
Toluidine Blue-O	Agar Scientific	AGR1727
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC7
upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters	Leica Mycrosistems	DMLb
vaccum chamber	na	na
vaccum pump	na	na
Vectashield	vecta Labs	T-1000	Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An antifade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.)