ב Vivo הקלטה תאית של מוטונורון עמוד השדרה חולדה מזוהה סוג במהלך גירוי זרם ישיר טרנס-עמוד השדרה

Summary

פרוטוקול זה מתאר בהקלטה תאית vivo של motoneurons מותני חולדה עם גירוי זרם ישיר טרנס-עמוד השדרה בו זמנית. השיטה מאפשרת לנו למדוד תכונות קרום ולתעד ירי קצבי של motoneurons לפני, במהלך ואחרי קיטוב אנודל או קטודלי של חוט השדרה.

Abstract

הקלטה תאית של מוטונורונים בעמוד השדרה ב-vivo מספקת "תקן זהב" לקביעת המאפיינים האלקטרופיזיולוגיים של התאים ברשת עמוד השדרה השלמה ומחזיקה ביתרונות משמעותיים ביחס לטכניקות הקלטה קלאסיות במבחנה או בהקלטה חוץ-תאית. היתרון של הקלטות תאיות vivo הוא כי שיטה זו יכולה להתבצע על בעלי חיים בוגרים עם מערכת עצבים בוגרת לחלוטין, ולכן מנגנונים פיזיולוגיים רבים שנצפו ניתן לתרגם ליישומים מעשיים. בנייר מתודולוגי זה, אנו מתארים הליך זה בשילוב עם גירוי זרם קבוע מיושם חיצונית, המחקה תהליכי קיטוב המתרחשים בתוך רשתות עצביות בעמוד השדרה. גירוי זרם ישיר טרנס-עמוד השדרה (tsDCS) היא שיטה חדשנית המשמשת יותר ויותר כהתערבות נוירומודולטיבית בשיקום לאחר פציעות נוירולוגיות שונות, כמו גם בספורט. ההשפעה של tsDCS על מערכת העצבים נותרה מובנת היטב והמנגנונים הפיזיולוגיים מאחורי פעולותיה אינם ידועים ברובם. היישום של tsDCS בו זמנית עם הקלטות תאיות מאפשר לנו לבחון ישירות שינויים של תכונות קרום motoneuron ומאפיינים של ירי קצבי בתגובה לקיטוב של הרשת העצבית בעמוד השדרה, אשר חיוני להבנת פעולות TsDCS. יתר על כן, כאשר הפרוטוקול המוצג כולל זיהוי של motoneuron ביחס לשריר הפנימי ותפקודו (flexor לעומת extensor) כמו גם את הסוג הפיזיולוגי (מהיר לעומת איטי) הוא מספק הזדמנות לחקור באופן סלקטיבי את ההשפעה של tsDCS על רכיבים מזוהים של מעגלים בעמוד השדרה, אשר נראה מושפע באופן שונה על ידי קיטוב. ההליך המוצג מתמקד בהכנה כירורגית להקלטות תאיות וגירוי בדגש על הצעדים הנחוצים להשגת יציבות הכנה ושחזור של תוצאות. הפרטים של המתודולוגיה של יישום tsDCS אנודל או קטטודלי נדונים תוך מתן תשומת לב לבעיות מעשיות ובטיחותיות.

Introduction

גירוי זרם ישיר טרנס-עמוד השדרה (tsDCS) צובר הכרה כשיטה חזקה כדי לשנות את עירור מעגל השדרה בבריאות^{ומחלות 1,,2,,3}. בטכניקה זו, זרם קבוע מועבר בין אלקטרודה פעילה הממוקמת מעל מקטעים נבחרים בעמוד השדרה, עם אלקטרודה הפניה הממוקמת באופן גחיד או יותר rostrally⁴. מספר מחקרים כבר אישרו כי tsDCS יכול לשמש בניהול תנאים פתולוגיים מסוימים,^{כגון כאב נוירופתי 5}, ספסטיות⁶, פגיעה בחוט^{השדרה 7} או כדי להקל על^{שיקום 8}. החוקרים מציעים כי tsDCS מעורר שינויים בהתפלגות היונים בין המרחב התוך תאי לבין החלל החוץ-תאי על פני קרום התא, וזה יכול להקל או לעכב פעילות עצבית בהתאם לכיוון^{הנוכחי 9,10,11}. עם זאת, עד לאחרונה, היה חסר אישור ישיר להשפעה זו על המוטוניונים.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לנהל הקלטה תאית vivo של פוטנציאל חשמלי מmotoneurons עמוד השדרה המותני בחולדה מרדים עם יישום בו זמנית של tsDCS, על מנת לצפות בשינויים קרום motoneuron ומאפייני ירי בתגובה קיטוב anodal או קטודלי של הרשת העצבית בעמוד השדרה. הקלטות תאיות פותחות מספר תחומי חקירה של מאפייני נוירון, שאינן זמינות לטכניקות חוץ-תאיות^{שהיו בשימוש בעבר 9,12}. לדוגמה, ניתן למדוד במדויק את תגובת מתח קרום המוטון לזרימת זרם ישירה המושרה על-ידי tsDCS, כדי לציין סף מתח עבור יצירת ספייק, או לנתח פרמטרים פוטנציאליים של פעולה. יתר על כן, טכניקה זו מאפשרת לנו לקבוע תכונות קרום פסיבי motoneuron, כגון התנגדות קלט, ולקנות את הקשר בין זרם גירוי תאי ותדירות של ירי קצבי של motoneurons. זיהוי נוגדני של מוטון מוקלט, המבוסס על גירוי של עצבים המזוהים באופן פונקציונלי (כלומר, עצבים המספקים אפרטנטים כיפוף או מורטים) מאפשר לנו לזהות בנוסף סוגים של יחידות מנוע פנימיות (מהיר לעומת איטי), אשר נותן הזדמנות לבדוק אם קיטוב משפיע באופן שונה על אלמנטים בודדים של מערכת העצבים של עמוד השדרה הבוגר. בשל ניתוח מקיף לפני ההקלטה ודרישות גבוהות על יציבות ואמינות של הקלטות, טכניקה זו היא מאתגרת מאוד אך מאפשרת הערכה ישירה וארוך טווח של מאפיינים אלקטרופיזיולוגיים של motoneuron אחד: לפני, במהלך ואחרי יישום של tsDCS, אשר חיוני כדי לקבוע הן את פעולותיה אקוטיות והשפעות^{מתמידות 13}. כמו motoneuron ישירות מפעיל סיבי שריר extrafusal¹⁴ ולוקח חלק בשליטה משוב של התכווצות שרירים ופיתח כוח^15,16 כל השפעה נצפתה של tsDCS על יחידת המנוע או תכונות שריר מתכווץ עשוי להיות קשור אפנון של מוטונורון עירור או מאפייני ירי.

Protocol

כל ההליכים הקשורים לפרוטוקול זה התקבלו על ידי הרשויות המתאימות (למשל, ועדת האתיקה המקומית) ובהתאם לכללים הלאומיים והבינלאומיות בנוגע לרווחת בעלי החיים ולהנהלה.

הערה: כל משתתף המעורב בהליך צריך להיות מאומן כראוי בהליכים כירורגיים בסיסיים וצריך להיות בעל רישיון תקף לביצוע ניסויים בבעלי חיים.

1. הרדמה וקדם-התברמה

1. להרדמה חולדה עם זריקות תוך-אפרטונאליות של נתרן פנטוברביטל (מנה ראשונית של 60 מ"ג-ק"ג^-1 עבור חולדות Wistar זכר בן 6 חודשים במשקל 400\u2012550g).
   הערה: פרוטוקול זה אינו מוגבל לזן המצוין, מין או גיל של חולדות. כמו כן, הרדמה חלופית כגון תערובת קטמין-קסילאזין, אלפא-כלורוז או פנטניל +midazolam +medetomidine יכול לשמש אם מתאים יותר למטרות מחקר שונות או כאשר נדרש על ידי ועדת האתיקה.
2. לאחר כ 5 דקות, לבדוק את עומק ההרדמה על ידי צביטת בהון האחורי של העכברוש עם מפסים קהים. המשך לשלבים הבאים של הפרוטוקול רק כאשר לא נצפתה פעולת רפלקס.
3. להזריק 0.05 מ"ל של אטרופין תת עורי על מנת להפחית את ייצור הריר לאחר צנרור.
4. להזריק תת עורית 5 מ"ל של מאגר פוספט המכיל 4% תמיסת גלוקוז, NaHCO₃ (1 %) וג'לטין (14%). מאגר זה ייקלט על ידי כלי הדם התועניים במהלך ניסוי ויעזור לשמור על איזון נוזלים.
5. במהלך הניתוח, מדי פעם לבדוק את פעולות רפלקס החיה ולהשלים הרדמה במידת הצורך (10 מ"ג·ק"ג^-1·h^-1של נתרן פנטוברביטל).

2. כירורגיה

1. הכן את החיה לטיפול כירורגי על ידי גילוח פרווה מעל החלק האחורי של החלק האחורי השמאלי, מהקרסול עד הירך, הישבן, מהזנב לקטעי בית החזה הגבוהים, הצד השמאלי של החזה, והצד הגחוני של אזור הצוואר מעל עצם החזה
2. מיקום הקו התוך-ורתי
   1. מניחים את העכברוש על גבו על משטח חימום בלולאה סגורה (ואבטחו אותו עם קיבעון גפיים).
   2. באמצעות להב 21, לעשות חתך אורכי דרך העור מעצם החזה לסנטר.
   3. החזק את העור עם ממחטות והפרד אותו מהרקמות הבסיסיות.
   4. שימוש בטכניקות ניתח קהה חושפות את וריד הצוואר הימני. לנתח בזהירות את וווה מהרקמות שמסביב.
   5. אתר את החלק של וווין ללא נקודות הסתעפות, להחליק שני ליגטורות 4-0 מתחתיו.
   6. לעשות קשר רופף אחד בקצה הפרוקסימלי של קטע שאינו מסתעף שזוהה בעבר של וווין וקשר רופף אחד בקצה הדיסטלי של קטע זה של ורין. מהדק את הפרוקסימל של ווין ללב, ולאחר מכן לתקע את החלק הדיסטלי של ורין.
   7. באמצעות מספריים קשתית, לעשות חתך בין המלחציים קשירה רחוקה. החזק דש של וירק, ולהציג צנתר מלא מראש עד לנקודה שבה הוא חסום על ידי המלחציים.
   8. תוך החזקת וורין וצנתר יחד עם מלחציים, להסיר את המלחציים ולדחוף את הצנתר כמה מילימטרים לתוך וורין. אבטחו את שני קצות הצנתר לוויר, והוספו נקודת קיבעון נוספת לעור.
3. מבוא של צינור tracheal
   1. באמצעות מפסים קהים מפרידים את שתי בלוטות הבלוטות הריסת בטן המכסים את שרירי הסטרנוהיואיד. הפרד את שרירי הסטרנוהיואיד בקו האמצע כדי לחשוף את קנה הנשימה.
   2. להחליק שלוש 4-0 ליגטורות מתחת קנה הנשימה, ואז לעשות שני קשרים מתחת לנקודת הכניסה צינור קנה הנשימה וקשר אחד מעל.
   3. אתר את הסחוס cricoid של הגרון ו לעשות חתך מתחת לסחוס השלישי של הדרך.
   4. הכנס צינור קנה הנשימה במורד קנה הנשימה ואבטח את הצינור במקום עם קשירה מוכנה מראש, ולאחר מכן להוסיף קשירה נוספת לעור.
   5. מניחים פיסת צמר גפן קטנה מעל השרירים המופרדים, ותפרים את העור מעל האזור המופעל.
4. פירוק של עצבים אחוריים
   1. באמצעות להב 21, לעשות חתך אורכי בצד האחורי של האיבר האחורי השמאלי, מגיד אכילס עד הירך.
   2. תפוס את העור עם ממחצויות, ובשימוש בטכניקות חתך קהות להפריד את העור מן השרירים הבסיסיים משני צידי החתך.
   3. אתר את הפוסה popliteal בחלק האחורי של מפרק הברך, אשר מכוסה על ידי שריר femoris שרירים שרירי, ובשימוש במספריים לעשות חתך בין החלק הקדמי והחלק האחורי של שריר זה.
   4. נע כלפי מעלה לחתוך שני ראשים של שרירי femoris כל הדרך אל הירך כדי לחשוף את עצב הירך. לצרוב כצורך כדי למנוע דימום.
   5. זהה את הענפים הפלורליים, היצוקיים והסניפים הנפוצים של עצב הירך.
   6. באמצעות מספריים, להפריד את החוץ מהראש המדל של שריר גסטרו-קסטרונומיוס כדי לחשוף את עצב השוקה וענפיו.
   7. באמצעות 55 מפסים לתפוס את הקצה הדיסטלי של העצב העצבי, לחתוך אותו בחוסר תום ולחתוך ככל האפשר.
   8. חזור על ההליך עם עצב ה peroneal המשותף.
   9. שימוש במוט זכוכית קהה מפריד את עצב השיכוך מהרקמות שמסביב, דואג לא לפגוע בכלי הדם, ולחתוך אותו בלשון קטנה.
   10. זהה את גסטרו-קסטרונומיוס (MG) ואת העצבים הגסטרו-קסטרונומיוס והסוס (LGS) הניקפיים.
   11. באמצעות 55 משקולות, לנתח בזהירות את העצבים MG ו LGS, ניתוקם מן הרקמות שמסביב, אבל שמירה על הקשר שלהם לשרירים בהתאמה.
   12. מניחים חתיכת צמר גפן ספוגה בתמיסת מלח מתחת לעצבים החשופים.
   13. סגור את העור מעל האזור המופעל.
5. כריתת למינקט
   1. באמצעות להב 21 לעשות חתך אורכי מsacrum עד חוליות בית החזה.
   2. הפרד את העור מהשרירים הבסיסיים.
   3. חותכים את שריר האורך משני צידי תהליכי בית החזה והמותניים.
   4. באמצעות אזמל קהה משוך את השרירים מעמוד השדרה כדי לחשוף את התהליכים הרוחביים של כל חוליה.
   5. שימוש במספריים קצה בוטה לחתוך את גידים של השרירים מחוברים לתהליכים רוחביים לאורך עמוד השדרה החשוף. החל סוכנים המוסטיים במידת הצורך.
   6. זהה את חוליית Th13 כמקטע בית החזה הנמוך ביותר עם החדרת צלעות ושימוש במוטות ברזל עדינים להסיר תהליכים קוצניים ולמינה מ Th13 עד L2 חוליות לחשוף קטעים מותניים של חוט השדרה. זכור לא לפגוע בתהליך הספיני L3 אשר ישמש כמקום קיבעון לייצוב עמוד השדרה.
   7. הסר את התהליך הספיני Th12 ולהחליק את משטח הגב החוליות ככל האפשר.
   8. שימוש בטכניקות פירוק קהות מפרידות את השרירים מ החוליה Th11 כדי ליצור נקודות כניסה של מחזיק.
   9. מניחים צמר גפן דק ספוג תמיסת מלח מעל מקטעי חוט השדרה החשופים.
   10. הזז את העכברוש למסגרת מתכת מותאמת אישית עם שני פסים מקבילים ושתי זרועות מתכווננות עם מהדקים כדי לתמוך ולייצב את עמוד השדרה.

3. הכנה להקלטה וגירוי

1. קיבעון עמודות חוליות וסדר עצבי
   1. מקם את העכברוש במסגרת בהזמנה אישית על משטח חימום, המחובר למערכת החימום בלולאה סגורה כדי לשמור על טמפרטורת גוף החי ב- 37 ± 1°C.
   2. הכנס אלקטרודות א.ק.ג מתחת לעור והתחבר למגבר לניטור דופק.
   3. בעזרת מדפים העור, ליצור בריכה עמוקה מעל חוט השדרה החשוף.
   4. באמצעות מהדקי מתכת, לתקן את עמוד החוליות על ידי הצבת מהדקים מתחת Th12 תהליכים רוחביים בתהליך ספיני L3.
   5. ודא כי עמוד החוליות מאובטח ומסודר אופקית, ולאחר מכן להחיל לחץ דורסו-גחן משני צידי העמודה כדי למשוך את השרירים.
   6. מלאו את הבריכה בשמן מינרלי חם (37°C) ושמרו עלה בטמפרטורה זו.
   7. להשחיל קשירה 4-0 דרך גיד אכילס, להרים ולתוח את האיבר האחורי השמאלי מופעל, כך הקרסול הוא מאוזן עם הירך.
   8. באמצעות מדפי העור לעשות בריכה עמוקה מעל החשוף טיבי, MG ועצבים LGS.
   9. מלאו את הבריכה בשמן מינרלי חם (37°C).
   10. מקם עצבי MG ו-LGS על אלקטרודות מגרה חוט כסף דו קוטבי ולחבר אותם ממריץ דופק מרובע. השתמשו בערוצים נפרדים לגירוי עבור כל עצב.
2. מיקום אלקטרודה משטחית
   1. מניחים אלקטרודה כדורית כסופה בצד השמאלי של חוט השדרה החשוף, עם אלקטרודה הפניה המוכנסת לשרירי הגב, וחברו את שתי האלקטרודות למגבר DC הדיפרנציאלי. אלקטרודה כדור פני השטח ישמש כדי להקליט מטחים שונים מן העצבים.
   2. באמצעות ממריץ זרם קבוע, לעורר את העצבים MG ו LGS עם פולסים מרובעים של 0.1 ms משך, חוזר בתדירות של 3 הרץ, ולצפות מטחים שונים.
   3. לקבוע את הסף (T) להפעלת עצב, לעורר כל עצב בערך 3· עוצמת T, ושיא משרעת של מטח א-פרה לכל עצב.
   4. הזז את האלקטרודה הרוסטראלית של פני השטח וחזור על ההליך לזיהוי מקטעים בעמוד השדרה שבהם משרעת מטחים היא הגבוהה ביותר עבור כל עצב. לאחר קביעת מיקום המטח המרבי, הזז את אלקטרודה פני השטח למרחק בטוח מחוט השדרה.
3. שיתוק שרירים ויוצרים דלקת ריאות כדי להפחית את תנועות הנשימה
   1. לשתק את העכברוש דרך ורידי עם חוסם עצבי-שרירי ולחבר את צינור tracheal למכונת הנשמה חיצונית בקנה אחד עם capnometer תואם מכרסמים (Pancuronium ברומיד, במינון ראשוני של 0.4 מ ג· ק"ג^-1, בתוספת כל 30 דקות במינונים של 0.2 מ"ג· kg^-1)
   2. נטר את ריכוז CO_{2 של גאות ושפל} ותשמור עליו על 3\u20124% על ידי התאמת פרמטרי האוורור (תדירות, לחץ אוויר ונפחי זרימה).
   3. עשה חתך אורכי בעור בין הצלע 5 ו -6 בצד של ההקלטה.
   4. באמצעות מספריים קצה בוטה לחתוך את השרירים מעל כדי לדמיין רווח בין צלמי בין הצלעות.
   5. באמצעות מספריים חדות קטנות, לעשות חתך קטן בשרירים הבין-צליים ובpleura, לאחר מכן להכניס קצה של מלקחיים קצה קהה לתוך הפתח, טיפול לא ללחוץ על הריאות.
   6. אפשר למלקות להרחיב או להכניס צינור קטן כדי להשאיר את חזה הריאות פתוח לאורך כל הניסוי.
   7. לאחר בלוק neuromuscular, לפקח על עומק הרדמה על ידי בדיקת תדירות ECG, ולהשלים את סוכן ההרדמה אם קצב הלב עולה על 400 bpm. שיתוק שרירים ויוצרים דלקת ריאות כדי להפחית את תנועות הנשימה, אשר ישפרו את יציבות ההקלטה
4. פתיחת הדורה והפיה מאטר
   1. באמצעות #55 מקצצים, הרם בעדינות את מאטר dura, ולחתוך אותו caudally ממקטע L5, rostrally עד קטע L4.
   2. באמצעות זוג מקציות 5SF דק במיוחד לעשות תיקון קטן בפיה מכסה את עמוד הגב, בין כלי הדם, בדיוק ברמה של מטח אפיל המרבי מן MG או עצב LGS.
   3. השתמש בחתיכות קטנות של קצף ג'ל ספוג תמיסת מלח ומיובש כדי לחסום דימום במידת הצורך.
5. מיקום אלקטרודה tsDCS
   1. בצע חתך קטן בעור בצד האוורני של בטן חולדה ברמת הרוזטרו-סיבתית המתאימה למיקום של מקטעי עמוד השדרה L4-L5.
   2. תפוס את דש העור החשוף עם קליפ מתכת אשר ישמש אלקטרודה התייחסות.
   3. מניחים ספוג ספוג ספוג בתמיסת מלח על הצד האחורי של חוליית Th12. ודא כי גודל הספוג שווה לזה של אלקטרודה tsDCS פעיל (צלחת נירוסטה בצורת עיגול של 5 מ"מ קוטר).
   4. באמצעות מניפולטור פיין, לחץ על הספוג עם אלקטרודה tsDCS פעילה לעצם ולוודא כי כל פני השטח של האלקטרודה נלחץ באופן שווה.
   5. חבר הן את אלקטרודות ההפניה והן את אלקטרודות TsDCS הפעילות ליחידת ממריץ בעלת זרם קבוע, המסוגלת לספק זרימה רציפה של זרם ישיר.
6. הכנת מיקרופיפטות
   1. בעזרת פולר מיקרואלקטרודה, הכינו מיקרואלקטרודה.
      הערה: ניתן להשתמש הן באלקטרודות חוטים והן באלקטרודות ללא חוט, עם זאת, לזכור כי הסכר של האלקטרודה חייב להיות ארוך מספיק כדי להגיע לקרן הפתח תוך כדי להיות רזה מספיק כדי לא לדחוס את חוט השדרה בעת היורד.
      1. כוונון את הגדרת המשוך כך הסכין הנכנס לחוט השדרה הוא כ 3 מ"מ ארוך, בעוד קצה האלקטרודה הוא לא יותר מ 1\u20122 μm בקוטר ומיקרואלקטרודה התנגדות הוא בין 10 ו 20 MΩ.
   2. מלאו את המיקרואלקטרודים באלקטרוליט אשלגן-ציטראט ב-2 מ'.
   3. הר microelectrode מוכן על micromanipulator המאפשר 1\u20122 μ צעד תנועה לכיול סטריאו-מס.
   4. חבר את המיקרו-אלקטרודה למגבר התוך תאי עם אלקטרודה הייחוס הממוקמת בשרירי הגב.
7. לאחר בלוק neuromuscular, לפקח על עומק הרדמה על ידי בדיקת תדירות ECG, ולהשלים את סוכן ההרדמה, כך קצב הלב חולדה לא יעלה על 400 bpm.

4. מעקב וחדירה של מוטון

1. מניחים את אלקטרודה הקלטת מטח אפרנטי בחזרה על פני השטח האחורי של חוט השדרה, caudally למיקום של אתר ההקלטה, ברמה של קטע L6.
2. לעורר את העצבים MG ו LGS עם פולסים חשמליים 0.1 ms בתדר של 3 הרץ, ועוצמה 3T, כדי להפעיל את כל האקסונים של אלפא-motoneurons בתוך עצב נבחר.
3. כונן micropipette לתוך תיקון נבחר בפיא עם זווית בינונית-רוחב של 15\u201220° (עם קצה מכוון לרוחב).
4. לאחר הירידה מתחת לפני השטח, כייל את המיקרו-אלקטרודה ו לפצות על הקיבוליות והיסט המתח שלו, והמשך חדירה של חוט השדרה כאשר כל הפרמטרים יציבים. פוטנציאל שדה נוגדן של בריכת המוטוניון יהיה גלוי במעקב מתח microelectrode תוך התקרבות גרעין מנוע ייעודי במהלך גירוי של העצב המתאים.
5. המשך חדירה עם microelectrode ב 1\u20122 μm צעדים, מעת לעת להשתמש בפונקציית באז של המגבר תאי כדי לנקות את קצה האלקטרודה מכל שאריות.
6. צפה חדירה motoneuron אשר יהיה מאופיין על ידי היפרקוטביזציה פתאומית של עקבות מתח מוקלט ומראה של פוטנציאל ספייק אנטידרום.

5. הקלטת קרום מוטונורון וירי נכסים

1. במצב גשר של המגבר התוך תאי, זהה את המוטונירון על בסיס המראה "הכל או כלום" של פוטנציאל הפעולה האנטי-דרומית על-ידי גירוי ענפי העצבים המתאימים. שיא 20 עקבות עוקבות עבור ממוצע מאוחר יותר.
2. ליישם קריטריון הכללה קפדני כדי להבטיח נתונים באיכות גבוהה: פוטנציאל קרום מנוחה של לפחות -50 mV במשרעת; משרעת פוטנציאלית פעולה גדולה מ- 50 mV, עם עודף חיובי; קרום פוטנציאלי יציב לפחות 5 דקות לפני ההקלטה.
3. במצב לא רציף-מהדק (מצב קצב מתג נוכחי 4-8 kHz) של מגבר תאי, לעורר פוטנציאל פעולה אורתודרום בmotoneuron באמצעות 0.5 ms פולסים זרם תוך תאי. חזור על הפעולה לפחות 20 פעמים עבור ממוצע לא מקוון.
4. לעורר מוטון עם 40 פולסים קצרים (100 אלפיות מכן) של זרם היפר-קוטבי (1 nA) על מנת לחשב את התנגדות קלט התא.
5. לעורר motoneuron עם 50 ms פולסים גל מרובע בהגדלת משרעת כדי לקבוע את ערך rheobase כמשרעת המינימלית של זרם depolarizing הנדרש כדי לעורר ספייק אחד.
6. להזריק 500 ms פולסים גל מרובע של זרם depolarizing, במשרעת גוברת בצעדים של 0.1-2 nA לעורר פריקה קצבית של motoneurons.

6. גירוי זרם ישיר דרך עמוד השדרה (tsDCS)

1. תוך שמירה על חדירה יציבה של motoneuron, להתחיל את הליך הקיטוב על ידי יישום דרך עמוד השדרה של זרם ישיר. התאם את העוצמה הנוכחית ואת זמן היישום לעיצוב הניסוי (לדוגמה, 0.1 mA למשך 15 דקות).
2. מיד לאחר ההפעלה על DC, לצפות פוטנציאל קרום motoneuron. קיטוב אנודל (האלקטרודה הפעילה כאנודה) אמור לגרום לדה-קוטביזציה של פוטנציאל הממברנה, בעוד קיטוב קטודלי (האלקטרודה הפעילה כקטודה) אמור לעורר אפקט הפוך. שים לב אם שינוי בפוטנציאל קרום המנוחה בתגובה לגירוי DC הוא קבוע, אשר מבטיח כי עוצמת השדה החשמלי אינו מושפע.
3. במהלך יישום נוכחי רציף, חזור על שלבים 5.3\u20125.6 במרווחי זמן של 5 דקות.
4. כבה את ה- DC והמשך לחזור על שלבים 5.3\u20125.6 במרווחי זמן של 5 דקות עד שההקלטות יהפכו לקריטריונים לא יציבים או ייפגעו בקריטריונים להכללה.
5. לסיים את הניסוי ולהרדים את החיה באמצעות ניהול תוך ורדי של מנה קטלנית של נתרן פנטוברביטל (180 מ"ג-ק"ג^-1).

תוצאות

פרמטרים של פוטנציאל פעולה ומספר מאפייני ממברנה ניתן לחשב על בסיס הקלטות תאיות כאשר תנאים יציבים של חדירה לתא מובטחים. איור 1א מציג פוטנציאל פעולה אורתודרום טיפוסי העורר על ידי גירוי תאי, אשר עומד בכל הקריטריונים להכללת נתונים (פוטנציאל קרום מנוחה של לפחות -50 mV, ומשרעת ספייק...

Discussion

אם תבוצע כראוי, יש להשלים את החלק הכירורגי של הפרוטוקול המתואר בתוך כשלוש שעות. יש לנקוט טיפול מיוחד בשמירה על מצבים פיזיולוגיים יציבים של בעל חיים במהלך הניתוח, בפרט טמפרטורת הגוף ועומק ההרדמה. מלבד שיקולים אתיים ברורים, חוסר הרדמה נכונה יכול לגרום לתנועות גפיים מוגזמות במהלך כריתת עצב א?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Durgs and solutions	-	-	-
Atropinum sulfuricum	Polfa Warszawa	-	-
Glucose	Merck	346351	-
NaHCO3	Merck	106329	-
Pancuronium Jelfa	PharmaSwiss/Valeant	-	Neuromuscular blocker
Pentobarbital sodium	Biowet Pu?awy Sp. z o.o	-	Main anesthetic agent
Pottasium citrate	Chempur	6100-05-06	-
Tetraspan	Braun	-	HES solution
Surgical equipment	-	-	-
21 Blade	FST	10021-00	Scalpel blade
Cauterizer	FST	18010-00	-
Chest Tubes	Mila	CT1215	-
Dumont #4 Forceps	FST	11241-30	Muscle forceps
Dumont #5 Forceps	FST	11254-20	Dura forceps
Dumont #5F Forceps	FST	11255-20	Nerve forceps
Dumont #5SF Forceps	FST	11252-00	Pia forceps
Forceps	FST	11008-13	Blunt forceps
Forceps	FST	11053-10	Skin forceps
Hemostat	FST	13013-14	-
Rongeur	FST	16021-14	For laminectomy
Scissors	FST	15000-08	Vein scissors
Scissors	FST	15002-08	Dura scissors
Scissors	FST	14184-09	For trachea cut
Scissors	FST	104075-11	Muscle scissors
Scissors	FST	14002-13	Skin scissors
Tracheal tube	-	-	Custom made
Vein catheter	Vygon	1261.201	-
Vessel cannulation forceps	FST	18403-11	-
Vessel clamp	FST	18320-11	For vein clamping
Vessel Dilating Probe	FST	10160-13	For vein dissection
Sugrgical materials	-	-	-
Gel foam	Pfizer	GTIN 00300090315085	Hemostatic agent
Silk suture 4.0	FST	18020-40	-
Silk suture 6.0	FST	18020-60	-
Equipment	-	-	-
Axoclamp 2B	Molecular devices	discontinued	Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A
CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor	CWE	11-10000	Gas analyzer
Grass S-88	A-M Systems	discontinued	Constant current stimulator
Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe	Harvard Apparatus	507222F	Heating system
ISO-DAM8A	WPI	74020	Extracellular amplifier
Microdrive	-	-	Custom made/replacement IVM/Scientifica
P-1000 Microelectrode puller	Sutter Instruments	P-1000	Microelectrode puller
SAR-830/AP Small Animal Ventilator	CWE	12-02100	Respirator
Support frame	-	-	Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting
Spinal clamps	-	-	Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting
TP-1 DC stimulator	WiNUE	-	tsDCS stimulator
Miscellaneous	-	-	-
1B150-4 glass capillaries	WPI	1B150-4	For microelectrodes production
Cotton wool	-	-	-
flexible tubing	-	-	For respirator and CO2 analyzer connection
MicroFil	WPI	MF28G67-5	For filling micropipettes
Silver wire	-	-	For nerve electrodes