テトロドトキシンマイクロインジェクションによる可逆不活性化による排卵調節におけるラット脳の離散領域の役割の解明

要約

このプロトコルは、低コストのマイクロインジェクションシステムの構築、深部脳構造への立体的移植、および目覚めおよび拘束されていないラットにおけるテトロドトキシンの時回マイクロ注射の手順を記述する。目標は、その神経活動を阻害することによって排卵の調節における視床下部構造の関与を明らかにすることです.

要約

多くの実験的なアプローチは、排卵の調節における脳の役割を研究するために使用されてきた。例としては、ニューロン群の病変および耳障りなことが挙げられるが、これは両方とも標的領域の完全性を永久に損なう侵襲的方法である。これらの方法は、急性および時間的調節メカニズムの分析に影響を与える可能性のある担保効果を伴う。特定の脳領域を対象としたガイドカニューレの立体的移植は、回復期間が続き、研究者が手術の望ましくない影響の消失後に異なる薬物をマイクロインジェクトすることを可能にする。テトロドトキシンは、一過性のナトリウム依存作用電位を阻害し、標的領域における全ての神経活動を遮断するため、多様な生理学的過程における複数の脳領域の役割を決定するために用いられている。このプロトコルは、この方法を、エストルースサイクルおよび排卵の評価のための戦略と組み合わせて、エストルースサイクルの特定の段階の特定の時間における排卵調節における離散脳領域の役割を明らかにする。目覚めと拘束されていないラット (ラタス・ノルベギカス) は、麻酔薬やストレスホルモンが排卵に及ぼす遮断効果を避けるために使用されました。このプロトコルは、他の種、脳標的および薬理学的薬剤に容易に適応して、異なる生理学的プロセスを研究することができる。この方法の将来の改善には、ガイドカニューラの代わりに小径のガラス毛細血管を使用したマイクロインジェクションシステムの設計が含まれます。これは、移植中に損傷を受けた組織の量を減少させ、注入された薬物が標的領域外に広がることを減少させる。

概要

排卵は、1つ以上の成熟した卵母細胞が一度毎エストラル/月経周期から1回卵巣から放出されるプロセスである。すべての哺乳類種は繁殖する配偶子の生産に依存しているので、排卵を調節するメカニズムの理解は、生物医学、家畜産業、絶滅危惧種の維持に至るまでの分野で大きな影響を与えます。排卵は視床下部下垂体-卵巣軸によって調節され、いくつかの視床下部および視床外領域、下垂体前葉座のゴナドロープ、および卵母細胞および顆粒球細胞と共に卵巣卵胞を形成する卵巣卵胞を形成する^1。

卵巣卵胞は成長し、成長し、最終的には卵胞刺激ホルモンおよび黄体形成ホルモンの強壮性および精神病分分に応答して排卵する、ゴナトロープによって分泌される2つのゴナドトロピン。ゴナドトロピン分泌のパターンは、適切な濾胞の発達と排卵のために極めて重要であり、それは性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)1、2によって調節される。この神経ペプチドは、基底の全脳症に散在するニューロンによって合成され、視床下部と下垂体前を結びつける門脈管系に分泌される。GnRH-ニューロンの分泌活性は、多様な脳構造から生じるシナプス入力によって変調される。これらの構造は、食物の入手可能性、光周期の長さ、血液中のホルモン濃度など、生物の外部および内部環境の状態に関する情報を伝える。この意味で、それらは、それぞれの種の生殖パターンを形作り、排卵を支配するメカニズムを適切に理解するために、そのような構造の特定の役割を決定する必要があります。例として、エストルースサイクル中のエストラジオールレベルの変動がGnRHの分泌を調節することが示されている。しかし、GnRHニューロンは、そのような変化を検出するために必要なエストラジオール受容体アイソフォームを発現していない。これらの受容体を発現するニューロンの2つの集団は、それぞれ第3心室のロストラル室近親子領域と円弧核内に位置し、GnRHニューロンを有するスタブリシナプスである。これらのニューロンがエストラジオールの濃度を解釈し、GnRH分泌の強力なインダクタであるキスペプチンを放出することによってGnRHニューロンの活性を刺激することを示唆する証拠がある^。

サーミックまたは化学病変、ならびに機械的聴覚障害を含む実験により、研究者は排卵^{4、5、6、7、8、9、10、11、12}の調節におけるいくつかの脳構造の関与^を決定することができた.しかし、これらの実験は、侵襲的で外傷性であるという欠点を有し、治療の効果を評価する前に数日間の回復を必要とし、治療の急性効果の分析を妨げる。さらに、それらは永続的に標的領域に影響を与え、長期的には他の生理学的プロセスを破壊する。これらの問題により、これらの実験の結果は、通常、動物の体内の恒恒湿補償機構によって隠され、領域が関与する時間的調節ダイナミクスに関する正確な情報を抽出することはかなり困難である。

ガイドカニューレを介してニューロンの活動を一過性に破壊する薬物の微小注射は、上記の欠点を上回る適切な代替手段である。カニューレは、立体的手術によって任意の脳領域に配置することができ、研究者は手術の交核化効果が消失した後に薬物治療を開始することができます。薬物の時限マイクロインジェクションは、研究者がプロセスの特定のステップに地域の貢献に関する仮説をテストすることを可能にし、目覚めの抑制または自由に動く動物で行うことができる。局所麻酔薬、アゴニスト、アンタゴニスト、逆アゴニストおよびテトロドトキシン(TTX)などの生物学的毒素を含む様々な薬物を、特定の時期に対象領域にマイクロインジェクションすることができる。

TTXは、他の脊椎動物や無脊椎動物だけでなく、フグの体内に住んでいる細菌によって合成された生物学的毒素です。TTXはナトリウムチャネルの選択的および一時的な遮断を通して神経活動を沈黙させ、その結果、ナトリウム依存性作用電位の阻害をもたらす。TTXの存在下では、細胞は脱分極期に変化を経験し、興奮しないが生き続ける。TTXの遮断効果は、その分子組成によって説明される:グアニジニウム基は、ナトリウムチャネルの細胞外の側面を通過することができるが、分子の残りの部分は、そのサイズのために通過することができないので、それは立ち往生し、チャネル13、14、15、16、17をブロックします.TTXの作用機序は、インビトロとインビボの両方の神経系を研究するためのツールとしての使用を可能にした。この毒素の脳内注射は、記憶保持^18、睡眠および覚醒^19、場所認識^{20、空間ナビゲーション21、薬物乱用22、}体温調節^23、統合失調症24の発症、性行動²⁵および排卵の調節などのいくつかのプロセスにおける離散的な脳領域の役割を研究するために使用されてきた とりわけ。このプロトコルでは、目覚めのないラットにおけるTTXマイクロインジェクションによる視床下部核の一過性不活性化の排卵に及ぼす影響について述べた。

プロトコル

動物に関する手続きは、UNAMの学部エスタジオス・スペリオルテス・サラゴサの倫理委員会によって承認されました。この機関は、動物の取り扱いのためのメキシコの規則に厳密に従って動作します, 公式ノルム: NOM-062-ZOO-1999, 国際ガイドラインに同意します.

1. 二国間カニューレの建設

1. 圧力ピンセットを使用して23G皮下注射針のハブからステンレスシャフトを抽出し、メスブレードを使用して残りの接着剤を取り除きます。
2. 細かい永久マーカーでシャフトの鈍い端から離れて15ミリメートルの線を描きます。切削ピンセットを使用して、ベベの端を取り除く。
3. 細かい止まり止まりで15 mmのセグメントを保持し、チューブの14ミリメートルセグメントが得られるまで、回転工具に取り付けられたカットオフディスクで垂直に押します。このステップはシャフトの閉塞部分を除去するために行われ、開いた、鈍い端を作成する。最後に、30Gの針をセグメントに通して挿入して、内部の障害物を除去します。
4. 脳アトラス²⁷の助けを借りて、脳の左右半球における目的の構造間の距離を決定する。くすぶる粘土を使用して、2つの14 mmセグメントを顕微鏡スライドに取り付け、両方が同じ水平レベルであることを確認します。眼マイクロメーター(10x)を通して観察し、目的の距離が得られるまで細かいピンセットでセグメントを調整します。
5. 2:1の割合で10%塩酸とはんだペーストを混ぜ、セグメントの鈍い端の下に2mmの混合物の滴を加えます。はんだ付け鉄と直径0.5mmのはんだワイヤーを使用して、単一の点を持つ両方のセグメントをはんだ付けします。はんだがセグメントのルーメンを妨げないようにしてください。
6. 弾力性のある0.3mmステンレス鋼線の10 mmセグメントを切断することにより、カニューレをステレオタックスホルダーに取り付けるためのサポートを作成します。以前のはんだ点と接触してワイヤの2mmを配置するためにくすぶる粘土を使用し、残りはカニューラの鈍い端の上に敷設します。ワイヤーをカニューラにはんだ。
7. カナラの表面を70%エタノールで洗浄し、残りのはんだペーストを除去します。金属粒子を除去するために滅菌水でカニューレの内部を洗い流す。10倍の倍率で顕微鏡下で粒子が検出されなくなるまで、このプロセスを繰り返します。

2. オブチュレーターとキャップの構築

1. オブチュレータを構築するには、丸いステンレス鋼のソフトワイヤ(直径0.35ミリメートル)の2つの16 mmセグメントをカットしました。ヘモスタットを持つ両側カニューレを持ち、ラボベンチに垂直に持ち、ベンチに到達するまでこれらのセグメントの1つを各カニューレに挿入します。残骸を90°の角度で曲げてください。
2. キャップの場合は、シリコーンチューブの2つの2 mmセグメント(内径=0.76mm)を切断し、各セグメントの端の1つにシリコン接着剤の滴を適用します。接着剤をチューブに入れないでください。少なくとも24時間乾燥させてください。

3. マイクロインジェクターの構築

1. シャフトを作成する代わりに30 G皮下注射針を使用して、ステップ1.1を繰り返します。
2. シャフトの鈍い端から18.5 mm離れて線を引き、先端の切り取りピンセットでベベリング端の残骸を取り除きます。
3. 1本の23G針でステップ1.1を繰り返し、鈍い端から始まる2つの6mm長セグメントを切断してアダプタを構築します。
4. 2つの4mmアダプターが得られるまで、6mmセグメントの閉塞部分をカットオフディスクに対して垂直に押し付けて排除します。内部の障害物を除去します。
5. 30 G セグメントのベベラの端をアダプターに挿入します。実体顕微鏡を見て、セグメントとアダプタの両方の端が同じレベルにあることを確認します。綿棒を使用して遠位関節にシアノアクリル酸接着剤を塗布し、15分間乾燥させます。
6. 2つのテフロンチューブコネクタを70%エタノールに5分間浸し、アダプターを通してマイクロインジェクターに取り付けます。コネクタの直径が少なくとも24時間縮小するまで待ってから、コネクタの損傷を避けるために低温法でマイクロインジェクターを殺菌します(エチレンオキシド滅菌をお勧めします)。

4. 動物のメンテナンスと膣の汚れ

1. 230と260グラムの間の重量を量る環状成人雌フード付きラット(ラトゥスノルベジカス、CIIZ-V株)を使用してください。14:10明暗の光周期を持つ部屋に、標準的なポリプロピレンケージの4つのグループでラットを収容します。温度と湿度を22±2°C、40%に設定します。食料と水 のアドリビタムを提供します。
2. 毎日10:00から12:00の間に膣の塗り薬を服用してください。
   1. アルコールランプを使用して1mmの内径で改変細菌学的ループを殺菌し、滅菌水で冷却します。ラットをしっかりと握り、細菌学的ループの5mmを膣に導入し、内部の壁に触れます。細菌学的ループを取り除きます。成功した場合は、先端に曇りのドロップが表示されます。この落としを顕微鏡のスライドに置きます。
   2. 各ラットの殺菌と各動物間のループの冷却に対して、このプロセスを繰り返します。
   3. 滴下後、ヘマトキシリン-エオジンで染色し、10倍の顕微鏡でサンプルを観察します。
   4. 白血球、上皮核細胞およびケラチン化細胞の割合を各塗抹体上で決定し、図1で報告されたエストロスサイクルステージの基準に従って分類し、これは以前の文献^28,29と一致する。

5. カニューレの立体移植

注:定期的な無菌の立体性の外科手術に続いて、制度的規範に従ってカニューレの注入を行います。

1. 手術前
   1. 手術器具、カヌラス、外科用ネジ、閉塞器、ガーゼ、木製綿綿棒を蒸気オートクレーブを使用して手術前に24時間殺菌する。連続手術の間に、連続した手術の間に金属器具の先端を殺菌し、10%過酸化水素を洗浄し、水を加え、熱いビーズの滅菌器に入れます。
   2. ホームルームから動物を取り除く前に、作業領域とステレオタックス楽器を準備してください。処置の間に汚染を避けるために外科のテーブルから可能な限り位置している区域の外科のための動物を準備しなさい。
   3. 70%エタノールで準備と手術領域を洗浄し、その後10%の塩化物溶液を10分間塗布します。70%エタノールで立体化器のベース、フレーム、マニピュレータを清掃し、ホットビーズの滅菌器を使用してイヤーバーの先端を滅菌し、手術前に空冷します。
   4. 専用のラボコート、フェイスマスク、ヘッドボンネット、外科用スリーブ、靴カバー、外科用手袋を着用して手術を行います。手術のために動物を準備し、手順中に彼らの一般的な状態を確認するためにアシスタントに依頼します。
   5. カニューレをステレオタックスホルダーに取り付けます。助手に最初に手術を受けた動物を部屋に連れて行ってもらいます。私たちの研究室からの観察は、これらの動物が他の段階で手術されたラットよりも速く適切なエストルスサイクルを回復することを示しているので、手術のためのダイストルのラットを選択してください。
   6. 動物の重量を量り、イオフルラン気化器に接続されたラットの誘導チャンバー内の100%酸素中の4%イオフルランで麻酔を誘導する。動物にストレスを与えないように、チャンバーを前もって充填しないでください。右反射の喪失を観察した後、尾と耳のピンチテストで測定された瞳孔の拡張と痛みの損失を確認することによって麻酔の外科面を確認します。
      1. イゾフルラン気化器が利用できない場合は、ケタミン(100mg/kg)とキシラジン(10mg/kg)の混合物の腹腔内注射によってラットを麻酔する。
   7. 誘導室からラットを取り出し、100%酸素中の2.5%のイオフルランで麻酔の効果を維持するために、準備テーブルで鼻コーンを使用してください。バリカンで頭皮の髪をトリミングし、糸くずローラーで緩い髪を削除します。非ステロイド性抗炎症/鎮痛薬および抗生物質として、メロキシカム2mg/kgとエンロフロキサシン5mg/kgの術前投与皮下投与量をそれぞれ注射する。
      1. 手術中の乾燥を避けるために、各目にヒプロメロース人工涙を適用します。
   8. 非破裂耳棒と麻酔マスクを使用して、温暖化パッドの上のステレオタキシック器具に動物をマウントします。鼻クランプを調整して、動物の頭部が平らであることを確認します。ポビドネヨウ素と石鹸と70%エタノールを交互に剃った領域で外科スクラブを行い、次いでポビドネヨウ素と70%エタノールを2回使用します。直腸温度計を挿入して、処置中に動物の温度を記録し、滅菌手術場で覆います。
2. 手術中
   1. メスを使用して、剃った領域の真ん中に皮膚と筋肉に2cmの切開を行います。2%過酸化水素でコーティングされた綿棒を使用して頭蓋骨から骨膜を取り除き、ターゲット座標の計算に使用されるランドマークであるブレグマまたはラムダを明らかにします。ランドマークのより良い視覚化のために空気で頭蓋骨を乾燥させます。
   2. ステレオタックス楽器のマニピュレータを使用して、カニューレを選択したランドマークの真上の位置に移動します。立体的な機器から前部後方と内側側面座標を登録し、それらを用いて脳アトラス²⁷に従ってターゲット領域の座標を計算する。
   3. ステレオタックス楽器で計算された座標を設定し、頭蓋骨の表面にカニューレの先端を配置します。底側側腹側座標を登録し、それを使用してターゲット領域への深さを計算します。
   4. マニピュレータのアームをフレームから外して取り外します。15,000 rpmの速度で回転工具に取り付けられた歯科用バリを使用して、頭蓋間術が行われる場所にマークを付けます。その後、バリを使用して3つの穴を作り、マークの周りに正三角形を形成します。これらの穴は頭蓋骨を突き刺してはならない。外科用ネジを穴に差し込み、しっかりと配置します。
   5. 各半球のターゲット領域間の距離に対応できる十分な広さを頭蓋骨切り取り術にします。これは軌道を変更するので、可能な限り直径が小さいが、頭蓋骨の境界に触れることなくカニューレの下げを可能にするのに十分な大きさでなければなりません。頭蓋間術を徐々に行い、可能な限り低い圧力を加える。げっ歯類の頭蓋骨はわずか数ミリメートルの厚さであり、下の組織の完全性を維持することが極めて重要です。
   6. 硬膜が見える場合は、90°の角度で湾曲した先端を持つ無菌21G針を使用して骨の破片を取り除き、髄膜で前後部切断を行います。Wirtshafterたちは、標的領域が正中線に近い場合に上座矢状の正座への損傷を避けるために、Wirtshafterと³⁰ の技術を使用する。
      1. フレームにカニューレを持つホルダーを配置し、側側腹側マニピュレータを使用して腹側座標に到達します。下降中に針が境界に触れていないことを確認し、必要に応じて開頭術の直径を大きくします。
         注: ガイドの先端が対象地域の 0.5 ~ 2.0 mm 以上の領域をターゲットにすることが重要です。これは、異物の導入および組織の破壊に応答して脳の炎症反応に起因する。これは、対象領域が小さく、作業距離を経験的に事前に計算する必要がある場合に特に重要です。
   7. 歯のセメントを塗布してカニューレを頭蓋骨に取り付け、乾燥させます。歯科用セメントがカニューレの鈍い端を覆わないことを確認してください。セメントが完全に固まるまで待ちます。
   8. さらに障害物を避け、研究中の愛知を確実にするために、閉塞器を挿入します。汚れを避けるためにシリコーンキャップをかぶしてください。
3. 手術後
   1. 生理学的温度で1.0 mLの無菌生理食塩水の腹腔内注入によって失われた液体を交換してください。麻酔から回復するまで、動物を熱支持の回復ケージに入れます。動物の温度と炉端/呼吸速度を定期的に確認します。イソフルラン効果は、ケタミン/キシラジン効果が40〜50分間持続する間、ガスフラックスの中断後数分間持続する。
   2. 抗生物質、鎮痛薬および抗炎症薬(以前に述べたのと同じ用量と経路)の術後注射を48〜72時間提供し、実験の残りの部分について日常的に動物を綿密に検査する。獣医サービスや研究室の訓練を受けたメンバーに痛み、ストレスや体重の損失の兆候を報告します。この期間中、ラットに対して他の操作を行わない。
   3. 術後の治療の後に膣の塗抹標本を服用し始め、動物が4日間の3つの連続したestrousサイクルを示すまでそれを続ける。
      注:慢性頸部カテーテルは外科的に移植することができ、研究者はエストラジオール、プロゲステロン、テストステロン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモンおよびコルチコステロンなどのホルモンの分泌を分析するために連続血液サンプルを採取することを可能にする。これは、回復時間の延長に起因する可能性のあるカテーテルの詰まりを避けながら、生存率を向上させるので、動物が脳外科手術から回復したら、このようなカテーテルを配置することをお勧めします。

6. テトロドトキシンの取り扱いとソリューションの調製

注意:TTXは、知られている最も有毒な物質の一つです。それは骨格筋および神経組織に作用する。接触による中毒はありそうもないが、開いた傷は体内への接種の潜在的な経路である。TTXを扱う際の主な問題は、毒素に接触した鋭い器具を持つ皮膚の穿刺と、口、目、粘膜に到達する可能性のあるエアロゾルの生成です。用量に応じて、TTXは、皮膚によって吸入、飲み込まれたり、接種したりすると致死的である可能性があります。それは目の強い刺激を引き起こすでしょう。LD50は経口投与および静脈内投与によりマウスで試験され、それぞれ334μg/kgおよび7.3μg/kgである。現時点では、利用可能な抗毒素はありません。

注:不活性化物質は、0.25 N NaOH、または10%漂白剤溶液の有無にかかわらず1.0%NaOClです。完全な不活性化は30分露光後に起こる。TTXは、10%未満の濃度で、500°F未満の温度でのオートクレーブや乾燥熱殺菌によって、いかなる塩化物誘導体によっても完全に不活性化することはできません。 TTXに関するすべての手順は、ニトリル手袋の内側と外側のペア、専用のラボコート、安全メガネ、使い捨て可能なフェイスマスク、クローズドシューズ、フルレングスパンツを着用した2人の知識豊富な個人によって行われなければなりません。

1. ストックソリューションの準備
   1. 不活性物質を浸したパッドをヒュームフードに入れ、流出時の汚染を防ぎます。発煙フードが正しく動作していることを確認してから、起動してください。ピペットチップを廃棄するために不活性化溶液でレセプタクルを準備します。
   2. 滅菌人工脳脊髄液による非常に慎重かつ遅い滴定によって製造業者の指示に従って滅菌TTXクエン酸凍結乾燥粉末を再懸濁し、その過程でバイアルの壁をすすいで下がる。発泡体とエアロゾルの形成を避けてください。TTX溶液は生きている動物の脳に注入されるので、TTX溶液の汚染を避けるために無菌技術に従ってください。TTXバイアルにエアロゾル形成を防ぐための外膜がある場合は、マイクロピペットの代わりに針付きの注射器を使用してください。
   3. 無菌マイクロチューブにストック溶液をアリコート。凍結/解凍サイクルは分子の安定性を変える可能性があるため、アリコートをできるだけ小さくしてください。凍結すると水量が増加し、蓋の開口やチューブや容器に保管されている他のサンプルの汚染につながる可能性があるため、チューブの半分以上を満たしないでください。
   4. チューブの外面とTTXが不活性化物質と一緒に使用された表面を除染します。チューブを-20°Cでバイアルボックス内に保管します。
2. ストック溶液を働く濃度に希釈する
   1. 希釈した溶液の安定性が低いため、使用日に希釈した溶液を準備します。ヒュームフードに不活性化物質を浸したパッドと、その上にマイクロチューブラックを置きます。ピペットチップを廃棄するために不活性化溶液でレセプタクルを準備します。
   2. 無菌マイクロチューブの底部にストック液をピペットし、計算された量の人工脳脊髄液を加えて10 ng/μLの濃度を達成します。TTX粉末の再懸濁液については説明したように、非常に慎重かつ遅い滴定を行い、バイアルの壁をすすいで発泡し、エアロゾルの形成を避けます。
   3. 冷凍庫に入ったサンプルをマイクロインジェクションに使用する場合は、実験の少なくとも1時間前に室温で平衡化する必要があります。

7. TTXまたは車両ソリューションを自由に動かすラットへのマイクロインジェクション

1. 実験に従って注入速度と注入の合計時間でマイクロインジェクションポンプを構成します。ターゲット構造が占める体積と注入する溶液の量を考慮して、これらのパラメータを事前に計算します。この実験では、4分間の全注入時間で1分間に50nLの速度で200nLの溶液を注入する。
2. 2つの10 μLハミルトン注射器を滅菌蒸留水で満たし、各マイクロインジェクターのチューブコネクタに滅菌テフロンチューブを挿入し、チューブの長さがラットの動きを制約しないことを保証します(チューブはエチレンオキシドを使用して滅菌することができます)。
3. 不活性物質とパラフィンフィルムの2cm x 2cm平方メートルを浸したパッドを上に置きます。ピペットは、フィルムの上にチューブの注射器および1cmの針を充填するのに十分な量のTTXをする。プランジャーを軽く引き込んでTTXドロップを吸収します。マイクロインジェクションポンプにシリンジを取り付け、各マイクロインジェクタの先端にTTXの低下が見えるまで、そのコントロールを使用してプランジャーを操作します。不活性化物質を浸したパッドに滴を捨てます。
4. マイクロインジェクションされるラットを選択します。手術後に少なくとも3回連続したサイクルを示したラットのみを使用する。サイクルの彼らの段階と一日の時間を考えてみましょう。時間と段階の両方は、この実験のために、この実験のために、この時点でパシックGnRH分泌を支配する神経前排前信号が発生するので選択されたプロエストラスの14:00時間に依存します。苦痛を避けるために、注射が自分の住宅ケージの中で行われる部屋にそれらを輸送します。
5. しっかりとしたグリップでラットを保持し、カニューラからキャップとオブチュレーターを取り外し、マイクロインジェクターをガイドカンヌラスに挿入し、動物をケージに戻します。
6. ポンプの電源を入れ、マイクロインジェクションが完了するまで待ちます。この期間中に、マイクロインジェクターの剥離の可能性を検出し、テフロン管のねじれを避けるために、この期間中に動物を観察してください。
7. マイクロインジェクターを2分間所定の位置に置いておき、溶液の逆流を避けます。それらを取り除き、眼管内の流れを避け、ヨドポビドネ防腐液でインプラントの表面をきれいにする。滅菌用オブチュレーターを挿入し、キャップを置き、コロニールームに動物を返します。定期的に動物を観察して、薬物の副作用を検出する。
8. マイクロインジェクション時と同じパラメータでポンプをオンにし、正しい流れを確認して、手順中にシステムの正気が保持されていることを確認します。
9. プランジャーを押して、TTX/車両をマイクロインジェクターから排出し、気泡が針の先端に届くまで押します。TTXをマイクロチューブで思い出してください。蒸留水でシリンジを充填し、チューブの内部をきれいにするためにそれを使用してください。不活性物質に水を捨て、このプロセスを少なくとも3回繰り返します。注射器、チューブ、マイクロインジェクターの外側を不活性化物質に浸した布で洗浄してください。

8. 安楽死と組織処理

1. 予測された、または膣で確認された発情の日に、ペントバルビタールナトリウム(75mg/kg)の腹腔内過剰摂取でラットを注入する。意識の喪失をチェックし、ステップ7.1〜7.9に記載されているようにガイドカニューレを介して0.5%メチレンブルー溶液の200 nLを注入します。つま先または尾ピンチテストを使用して痛みの兆候をチェックし、何も検出されない場合は、げっ歯類のギロチンを使用してラットの首を切ります。
2. はさみを使用して腹腔を開き、卵巣を見つけます。細かい虹彩はさみを使用して各卵巣を解剖し、虫眼鏡の助けを借りて子宮管の接合部で切断します。卵母細胞の損失をもたらすので、卵子を損傷を避ける.
3. 卵巣を実体顕微鏡で入れ、かみそりの刃を使って臓器を傷つけずにすべての脂肪組織を取り除きます。アンフィラ領域から可能な限りカミソリの刃で切断することにより、各卵巣から卵管を取り除きます。各卵性を別々のスライドに取り付け、水滴で覆います。ブインの溶液を含むバイアルに卵巣を保管する。
4. 吸収性のペーパータオルで卵管を軽く乾かし、実体顕微鏡でアンフィラを探します。非支配的な手で、23G針でアンプラから遠く離れてつまんで卵性を所定の位置に保持し、その後、アンプラの中央領域に1mmの切開を行うために支配的な手で別の23G針を使用します。積雲卵母細胞複合体は粘性流体の滴として切開から突き出る(図2D)。優れた針を使用して、卵管から遠く離れたドロップを優しくゆっくりと引っ張ります。アンペアの残骸を押して、卵母細胞が中に残らないようにします。卵子をできるだけ早く卵管から抽出し、卵子を内部に不可逆的にトラップします。
5. スライドから卵状を取り出し、卵母細胞を含む流体の滴が乾くまで待ちます。サンプルをヘマトキシリン-エオジンで染色する。取り付け媒体を使用してカバースリップします。顕微鏡(10x)で観察し、各卵巣によって流される卵母細胞の数を決定する。
   注:卵母細胞は卵子に閉じ込められ、したがって組織学的方法は排卵を評価するために必要であるので、心臓灌流による犠牲は、このプロトコルでは行われません。ユーザーが他の組織を分析するために穿ファーする必要がある場合は、最初に卵巣を取り除き、下降動脈を肝臓の下の厚い止血で締め付け、固定剤の漏れを避けることができます。
6. 頭の皮膚を取り除き、10%ホルマリン溶液でガラス容器に頭蓋骨を水没させます。組織の歪みを避けるためにカニューレを取り除く前に、少なくとも10日間頭の固定を許可します。カニューレを取り除くためには、はさみを使用して、それを取り囲む頭蓋骨の領域内のすべての筋肉を取り外します。鼻と前頭骨の間を骨トリマーで切り取り、後頭部の骨を取り除く。トリマーの先端を奥頭に入れ、鼻骨の残骸に達する矢状の紋章を切り始める。
7. 頭蓋骨の上部の孤立した領域は、前頭骨と頭頂骨を含んでいる必要があります。頭蓋骨の上部に取り付けられた埋め込まれたカニューレを、頭に垂直にゆっくりと引き上げて取り除きます。脳の変形を避けるために細かい虹彩はさみでメインの付属部分をカットします。
8. 髄液の前部後部カットを行い、頭蓋骨の基部から脳を取り除くためにそれらを脇に置きます。嗅球の下に鈍いピンセットを挿入し、視神経が見えるまで脳をそっと引き上げます。細かい虹彩はさみで神経を切り、脳を引き抜きます。固定溶液で脳を保存します。
9. ビブラートを使用して脳の50μmの厚い部分を得て、ポリL-リジンコーティングスライド(蒸留水で0.1%)に取り付け、Nissl技術で染色します。顕微鏡下のスライド(10x)を観察して、カニューレの最終的な位置(図2A-2C)と、ラットの脳アトラス²⁷の助けを借りて色素の広がりを決定する。

結果

上述のプロトコルは、単一のTTXまたは車両(人工脳脊髄液)の効果を評価することによってテストされた。ACSF)ラットの排卵調節に関与することが知られている2つの異なる核のうちの1つへのマイクロインジェクション:対症核および円弧核。この二大円球核は、哺乳類の中央概日ペースメーカーが含まれているために選択された。これは、ゴナドトロピンの分泌として周期的なイベントの規制に...

ディスカッション

この記事では、一時的に不活性化する方法について説明します, 任意の時点で, 目を覚ますと、拘束されていないラットの脳内の離散領域.彼らのエストルースサイクルを追跡し、排卵を評価するための簡単な方法も提供されています。このプロトコルは、TTX処理動物の排卵結果と車両処理動物の排卵結果を比較することによって排卵を促進するメカニズムに対する特定の脳領域の寄与を簡単?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 μL Hamilton syringes	Hamilton	80314
21 G x 1" stainless steel hypdermic needle	BD	305165
23 G x 1" stainless steel hypdermic needle	BD	305145
30 G x 1/2" stainless steel hypdermic needle	BD	305106
Artificial cerebrospinal fluid	BASi	MD-2400
Bone trimer	Fine Science Tools	16152-12
Burr for micro drill	Fine Science Tools	19007-05
Clipper	Wahl
Cut-off disc	Dremel	SM5010
Cutting tweezers	Truper	17367
Cyanocrylate glue	Kola loka	K-1
Dental cement	Nic Tone
Enrofloxasin	Senosiain
Eosin	Sigma	E4009
Estereoscope	Zeiss
Extra fine Bonn scissors	Fine Science Tools	14084-08
Face mask	Lanceta HG	60036
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11050-10
Hematoxilin	Sigma	H3136
Hemostats	Fine Science Tools	13008-12
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Hydrochloric acid	Sigma	320331
Hypromelose artificial tears	Sophia Labs	8950015
Isoflurane	Pisa Agropecuaria
Meloxicam	Aranda	1183
Microinjection pump	KD Scientific	788380
Monomer	Nic Tone
Mototool	Dremel	3000
Nitrile gloves	Lanceta HG	69028
Non-Rupture Ear Bars	David Kopf Instruments	855
Poly-L lysine	Sigma	P4707
Povidone-iodine	Dermo Dine
Povidone-iodine with soap	Germisin espuma
Pressure tweezers	Truper	17371
Rat anesthesia mask	David Kopf Instruments	Model 906
Saline solution	PISA
Scalpel	Fine Science Tools	10004-13
Scalpel blade	Fine Science Tools	10015-00
Sodium pentobarbital	Pisa Agropecuaria
Standard electrode holder	David Kopf Instruments	1770
Stainless steel wire	American Orthodontic	856-612
Stereotaxic apparatus	David Kopf Instruments	Model 900LS
Surgical Sissors	Fine Science Tools	14001-12
Teflon connectors	Basi	MD-1510
Teflon tubing	Basi	MF-5164
Tetrodotoxin	Alomone labs	T-500
Vaporizer	Kent scientific	VetFlo