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  • Reimpressões e Permissões

Resumo

O objetivo geral deste protocolo é fornecer instruções sobre como medir a capacidade dos anticorpos presentes no soro ou plasma de indivíduos, naturalmente expostos à infecção por Plasmodium falciparum, para opsonizar e induzir fagocitose dos eritrócitos infectados por parasitas (IEs).

Resumo

O protocolo descreve como configurar e executar um ensaio de fagocitose baseado em citometria de fluxo de plasmodium falciparum-infectado eritrócitos (IEs) opsonizados por anticorpos IgG naturalmente adquiridos específicos para VAR2CSA. VAR2CSA é o antígeno parasita que media o sequestro seletivo de IEs na placenta que pode causar uma forma grave de malária em gestantes, chamada malária placentária (PM). A proteção contra PM é mediada por anticorpos específicos var2CSA que se acredita funcionar inibindo o sequestro placentário e/ou opssonizando IEs para fagocitose. O ensaio emprega IEs sincronizados em estágio final que foram selecionados in vitro para expressar VAR2CSA, plasma/soro-anticorpos de mulheres com imunidade específica de PM adquirida naturalmente, e a linha de células fagocíticas THP-1. No entanto, o protocolo pode ser facilmente modificado para avaliar a funcionalidade de anticorpos para qualquer antígeno parasita presente na superfície do IE, seja induzido pela exposição natural ou pela vacinação. O ensaio oferece avaliação simples e de alto rendimento, com boa reprodutibilidade, de um importante aspecto funcional da imunidade mediada por anticorpos na malária. É, portanto, útil na avaliação da imunidade clínica à malária P. falciparum, uma das principais causas de morbidade e mortalidade nos trópicos, particularmente na África subsaariana.

Introdução

A malária é uma doença transmitida por vetores causada em humanos após infecção com cinco espécies diferentes do gênero Plasmodium. A espécie mais prevalente é a P. falciparum,que também é responsável pela maior morbidade e mortalidade1. A apresentação clínica da malária varia de infecções assintomáticas ou benignas a doenças complicadas/graves, esta última ocorrendo principalmente em crianças menores de cinco anos. A exposição ao P. falciparum não induz imunidade estéril, mas indivíduos que vivem em áreas endêmicas lentamente desenvolvem imunidade contra a doença clínica. A proteção é dependente de idade/exposição e a imunidade é adquirida normalmente durante os primeiros 5-10 anos de vida2. As mulheres adultas são uma exceção importante, pois a malária grave pode ocorrer durante a gravidez em uma apresentação clínica conhecida como malária placentária (PM). A PM é uma importante causa de aborto, natimorto, parto prematuro, baixo peso ao nascer, morte fetal e anemia materna. A resistência à PM se desenvolve ao longo de sucessivas gestações3. A proteção contra a PM está associada à aquisição de anticorpos contra o PfEMP14,5, um antígeno de superfície eritrócito infectado (IE) que se liga ao sulfato de condroitina A (CSA) que permite o sequestro de IE na placenta. Anticorpos mediam a proteção realizando diversas atividades funcionais (revisadas em6,7) incluindo a opsonização das EIs para induzir a fagocitose. Estudos in vitro in vitro mostraram que os anticorpos podem limitar o crescimento de P. falciparum na presença de monócitos via fagocitose8,9. Estudos mais recentes têm demonstrado que níveis mais elevados de anticorpos indutores de fagocitose estão associados a melhores desfechos de gravidez (no contexto da co-infecção pelo HIV)10,11, indicando a relevância dessa função efetiva na resposta imune adquirida naturalmente.

Aqui apresentamos um protocolo para medir essa função de anticorpos presentes no plasma/soro humano, utilizando IEs in vitro cultivados expressando VAR2CSA juntamente com a linha de monócitoS THP-1. O ensaio foi usado anteriormente11,12,13,14,15,16,17,18 e é considerado uma abordagem melhorada e mais fácil em comparação com os protocolos anteriores baseados em microscópio8, uma vez que permite o teste de um número maior de amostras de anticorpos em uma única corrida usando volumes menores de anticorpos e evitando a contagem de microcópia tediosa e tendenciosa. Embora o ensaio tenha sido usado por vários laboratórios e sua execução seja bastante simples, requer um planejamento e preparação cuidadosos, portanto, um protocolo detalhado permitiria sua aplicação por laboratórios e pesquisadores sem experiência prévia. Usamos, como exemplo, IEs sincronizados em estágio final expressando VAR2CSA opssonizado com anticorpos presentes em soro coletados de mulheres com imunidade específica de PM adquirida naturalmente. No entanto, o protocolo pode ser facilmente modificado para avaliar a funcionalidade de anticorpos para qualquer antígeno parasita presente na superfície do IE, seja induzido pela exposição natural ou pela vacinação.

Protocolo

As amostras de soro humano utilizadas para os resultados aqui apresentados foram coletadas em estudo separado19. A coleta foi aprovada pelo Conselho de Revisão Institucional do Noguchi Memorial Institute for Medical Research, Universidade de Gana (estudo 038/10-11), e pelos Comitês Regionais de Ética em Pesquisa, Região capital da Dinamarca (protocolo H-4-2013-083).

1. Cultura de parasitas

NOTA: Siga as normas locais para o manuseio de patógenos humanos.

  1. Manter os parasitas de P. falciparum de acordo com o protocolo padrão descrito antesdos 20 anos no meio da cultura parasita (ver Tabela de Materiais).
  2. Mantenha os parasitas bem sincronizados usando o tratamento sorbitol como descrito anteriormente21.
  3. Para garantir a expressão VAR2CSA na superfície do IE, realize rodadas repetidas de seleção imuno-magnética usando um anticorpo anti-VAR2CSA (por exemplo, anticorpo PAM1.4, um IgG22monoclonal humano monoclonal 22 ) acoplado a contas g-magnéticas proteicas23.
    1. Em suma, incubar trophozoite-IEs em estágio final com contas magnéticas acoplado a um anticorpo anti-VAR2CSA e selecionar positivamente usando um ímã.
    2. Expandir os parasitas selecionados na cultura por alguns ciclos até que a parasitamia seja de pelo menos 5%.
    3. Alternativamente, selecione parasitas que se ligam ao CSA imobilizado de plástico (o receptor para VAR2CSA) como descrito anteriormente24.
  4. Para verificar a expressão VAR2CSA nos parasitas selecionados, a citometria de fluxo é descrita anteriormente25.
    1. Resumindo, rotule os trophozoite-IEs em estágio final com o mesmo anticorpo usado para a seleção magnética (etapa 1.3) seguido de um anticorpo secundário rotulado fluorescentemente.
    2. Meça a reatividade da superfície IE por citometria de fluxo. A seleção bem sucedida de anticorpos normalmente resulta em uma população de parasitas que expressa VAR2CSA na maioria dos parasitas (≈80%).
  5. Para o ensaio de fagocitose, use trophozoite-IEs purificado de meio a final. Realize a purificação utilizando separação magnética como descrito anteriormente26.
    NOTA: Para determinar com precisão o estágio dos parasitas, realize a coloração de Giemsa em manchas de sangue seguidas de observação de microscopia leve. Seguir procedimentos padrão e diretrizes morfológicas conforme descrito antesdo dia 27. A purificação em estágio tardio também pode ser realizada usando o meio gradiente de densidade. O rendimento do IE, no entanto, em nossa experiência é menor e, portanto, a purificação magnética é preferível.
    1. Para a separação magnética, gire a cultura do parasita (5-10% parasitamia) a 500 x g por 10 minutos à temperatura ambiente. Remova o supernasce e suspenda a pelota celular em 10 mL de meio de cultura parasita.
    2. Adicione a suspensão do parasita em uma coluna CS acoplado a um ímã (ver Tabela de Materiais) e deixe passar lentamente pela coluna. Os trophozoite-IEs são paramagnéticos (devido à presença de hemozoína) e permanecerão na malha da coluna.
    3. Lave a coluna com 50 mL de cultura parasita média e elute os IEs da coluna magnética usando 50 mL de meio de cultura parasita.
  6. Gire o eluato de 1,5,3 a 500 x g por 10 min a temperatura ambiente. Descarte cuidadosamente o supernaspe e suspenda-se em 1 mL de meio de cultura parasita.
  7. Utilizando um hemocitômetro, conte o número de IEs (facilmente identificados por microscopia leve como eritrócitos com pigmento de hemozoína escura) e número total de células para calcular a parasitamia final (porcentagem de IEs).
    NOTA: Use apenas parasitas com pelo menos 80% de pureza (80% de IEs).
  8. Com base no número de amostras de soro/anticorpos planejadas para testes, estimar a quantidade total de IEs necessária e dimensionar as culturas de parasitas em conformidade. Um frasco de cultura de 75 cm2 com 25 mL de cultura a 5% de hematócrito e 5-10% de parasitamia deve render IEs suficientes para executar uma placa de 96 poços completa. Para uma placa completa (42 amostras mais 6 controles em duplicata), é necessário um mínimo de suspensão de parasita de 1,5 mL a 3,3 x 107 IEs/mL.

2. Células THP-1

NOTA: A linha de células THP-1 é usada neste ensaio. Esta linha celular monocyte é derivada de um paciente com leucemia monocítica28 e pode ser adquirida da ATCC. Manter a linha celular de acordo com as instruções do provedor no meio de cultura THP-1 (ver Tabela de Materiais).

  1. Para manutenção regular, inicie a cultura celular THP-1 em 2-4 x 105 células/mL e subcultura quando a concentração celular atingir 8 x 105 células/mL.
    NOTA: Não permita que a concentração celular exceda 1 x 106 células/mL e acompanhe o número de passagem. Evite o uso de células que estão além da passagem 25. O tempo médio de duplicação da linha celular THP-1 varia entre 19-50 h. Determine o tempo de duplicação do lote celular antes de iniciar os experimentos de fagocitose. Isso ajudará a estimar aproximadamente a quantidade necessária de cultura necessária para um determinado número de amostras de soro a serem testadas (por exemplo, para uma placa de 96 poços completa, 10 mL de cultura em 5 x 105 células/mL são necessárias).
  2. Verifique periodicamente as células THP-1 para obter a expressão superficial dos receptores Fcγ I (CD64), II (CD32) e III (CD16) como descrito anteriormente15.
    1. Resumindo, colorir as células THP-1 (separadamente) com anticorpos anti-CD64, anti-CD32 e anti-CD16 fluorescentemente rotulados(Tabela de Materiais) por 30 minutos à temperatura ambiente (1:100 diluição preparada em 2% FBS em PBS).
    2. Lave três vezes com 2% de FBS em PBS e meça a coloração da superfície por citometria de fluxo.
      NOTA: As células THP-1 são negativas para CD16 e positivas para CD32 e CD64 conforme relatado anteriormente29,30 ( Figura1).
  3. Para o ensaio de fagocitose, configure um frasco de cultura celular THP-1 com 2,5 x 105 células/mL no dia anterior ao experimento para produzir cerca de 5 x 105 células/mL no dia do ensaio.
    NOTA: Certifique-se de que 4-6 x 105 células/mL estão presentes no dia do ensaio.

3. Ensaio de fagocitose (Figura S1)

  1. Antes de iniciar o ensaio, bloqueie (>1 h) duas placas de 96 poços de fundo redondo (uma para a opsonização e outra para a fagocitose) utilizando 150 μL por poço de FBS estéril de 2% em PBS.
    NOTA: Rotular a placa 1 como placa de opssonização e usá-la tanto para coloração de brometo de ethidium (EtBr) quanto para opssonização. Rotular a placa 2 como placa de fagocitose e usar tanto para revestimento de células THP-1 quanto para a etapa de fagocitose.
  2. Coloração e opssonização de parasitas
    1. Pegue a suspensão IE preparada em 1,6 e ajuste a contagem celular para 3,3 x 107 IEs/mL adicionando cultura parasita média e EtBr para alcançar uma concentração final de 2,5 μg/mL (diluição de 1:40, de um estoque de 0,1 mg/mL).
      NOTA: O ETBr mancha o DNA do parasita, permitindo a detecção por citometria de fluxo.
      ATENÇÃO: O EtBr é um mutagênico e irritação respiratória. Use proteção adequada e descarte resíduos de acordo com as regulamentações locais.
    2. Remova a solução de bloqueio de uma das 96 placas do poço (placa de opsonização), apertando a placa e removendo o excesso de líquido sobre um pedaço de papel toalha.
    3. Adicione 30 μL por poço da suspensão IE preparada acima na metade superior da placa. Deixe um bem vazio e adicione 30 μL de cultura parasita meio (sem IEs para o controle thp-1 sozinho). (Figura S2A). Incubar por 10 minutos à temperatura ambiente e protegido contra a luz.
    4. Adicione 170 μL por poço de meio de cultura parasita. Gire a placa a 500 x g por 3 minutos à temperatura ambiente e remova o sobrenante, movendo a placa sobre um recipiente de resíduos apropriado.
    5. Lave as IEs rotuladas por EtBr mais duas vezes usando 200 μL por poço de cultura parasita girando a placa a 500 x g por 3 min à temperatura ambiente. O supernatante da primeira lavagem pode ser removido apertando a placa. Remova cuidadosamente o supernatante da segunda lavagem usando uma pipeta multicanal para garantir que todo o volume do meio de lavagem seja removido. Não perturbe a pelota.
    6. Suspenda des suspendida as IEs rotuladas por EtBr em 30 μL de solução de anticorpos/plasma/soro preparadas nas concentrações desejadas no meio da cultura parasita.
    7. Inclua sempre os seguintes controles(Figura S2B): um controle sem controle de células IEs/THP-1 (meio de cultura de parasitas); um controle sem qualquer anticorpo ou plasma/soro (controle não opssonizado); um controle positivo usando o anticorpo anti-ritrócito de coelho comercialmente disponível às 1:100 diluição (ver Tabela de Materiais); dois controles negativos de plasma/soro em diluição de 1:5 (uma piscina ingênua da malária e uma piscina de machos expostos à malária); e controle de soro positivo em diluição de 1:5 (piscina de mulheres expostas à malária, que já estiveram grávidas (preferencialmente multigravidae)).
      NOTA: Uma diluição de 1:100 para o controle positivo parece funcionar consistentemente em diferentes lotes de anticorpos comprados (dados não mostrados). No entanto, recomenda-se excluir variações entre os lotes testando várias diluições toda vez que um novo lote de anticorpos é usado.
    8. Incubar por 45 min no escuro a 37 °C.
  3. Preparação de células THP-1 e fagocitose
    1. Enquanto as IEs estão sendo opsonizadas (3.2.8), começam a preparar as células THP-1.
    2. Remova as células THP-1 do frasco de cultura, gire-as para baixo (500 x g por 5 min a temperatura ambiente), decante o supernante e suspenda a pelota no meio de cultura celular THP-1.
    3. Gire novamente (500 x g por 5 min à temperatura ambiente), decante o supernadante e suspenda novamente a pelota celular em 1 mL de meio de cultura celular THP-1.
    4. Determine a contagem celular na solução preparada acima e adicione mais meio para obter uma concentração final de 5 x 105 células/mL.
    5. Remova a solução de bloqueio da placa de 96 poços restantes (placa de fagocitose) apertando a placa e removendo o excesso líquido sobre um pedaço de papel toalha.
    6. Adicione 100 μL por poço da suspensão celular THP-1 preparada em 3.3.4 e coloque de volta na incubadora de cultura celular(Figura S2C).
    7. Uma vez que o tempo de incubação de anticorpos/plasma/soro tenha terminado, adicione 170 μL por poço de meio de cultura parasita. Gire a placa a 500 x g por 3 minutos à temperatura ambiente e remova o sobrenante, movendo a placa sobre um recipiente de resíduos apropriado.
    8. Lave as IEs opsonizadas mais duas vezes usando 200 μL por poço de meio de cultura parasita, girando a placa a 500 x g por 3 min a temperatura ambiente. O supernatante da primeira lavagem pode ser removido apertando a placa. Remova cuidadosamente o supernatante da segunda lavagem, usando uma pipeta multicanal para garantir que todo o volume do meio de lavagem seja removido. Não perturbe a pelota.
    9. Finalmente suspenda as IEs opsonizadas em 100 μL de meio de cultura celular THP-1 pré-aquecida. Transfira 50 μL de suspensão de IE opssonizada para cada poço na placa de fagocitose. Como há um total de 100 μL de IEs, cada diluição de anticorpos/soro pode ser executada em duplicatas na placa de fagocitose(Figura S2D)
      NOTA: A quantidade de IEs e células THP-1 utilizadas no ensaio corresponde a uma razão de 10:1.
    10. Incubar por 40 min no escuro a 37 °C, 5% DE CO2.
      NOTA: Não permita que a fagocitose prossiga por mais de 40 min.
    11. Pare a fagocitose por centrifugação a 4 °C (500 x g, 5 min) e descarte o supernatante apertando a placa. Adicione 150 μL de solução de cloreto de amônio de temperatura ambiente(Tabela de Materiais) e misture por pipetação, incubar por exatamente 3 min.
      NOTA: Esta etapa irá lise os eritrócitos que não foram fagocitados pelas células THP-1.
    12. Pare a lise adicionando 100 μL de FBS gelado 2% em PBS. Gire a placa a 4 °C (500 x g por 3 min) e remova o sobrenante, movendo a placa sobre um recipiente de resíduos apropriado.
    13. Lave três vezes usando 200 μL por poço de gelo frio 2% FBS em PBS girando a placa a 4°C (500 x g por 3 min). Após a lavagem final, suspenda em 200 μL de 2% de FBS gelado em PBS e analise imediatamente por citometria de fluxo.
      NOTA: Publicações anteriores utilizaram fixação celular em 2% paraformaldeído antes da citometria de fluxo31,mas os resultados aqui apresentados foram adquiridos imediatamente após a conclusão do ensaio. O adiamento da aquisição de dados de citometria de fluxo armazenando a placa a 4°C não é recomendado, uma vez que a porcentagem de células EtBr+ THP-1 decai rapidamente(Figura S3).
  4. Aquisição e análise de citometria de fluxo
    NOTA: Qualquer citómetro de fluxo que suporte o formato de placa de 96 poços e com os lasers/filtros apropriados para medir a fluorescência de EtBr pode ser usado.
    1. Para aquisição, o portão em células THP-1 usando um gráfico linear de dispersão para a frente (FSC) vs. linear side-scatter (SSC) usando os poços não foram adicionados IEs(Figura 2A) e adquirir 10.000 eventos neste portão.
    2. Meça a intensidade da fluorescência para EtBr (FL3-Log) no portão THP-1 usando um gráfico histograma.
    3. Para gating, primeiro portão em células THP-1 em um gráfico de densidade FSC vs. SSC, usando os poços não foram adicionados IEs(Figura 2A). Em seguida, configure um portão positivo em um histograma FL3 (EtBr), usando as células THP-1 (sem IEs adicionados) e o controle não opssonizado(Figura 2B).
    4. Copie esses portões em todas as outras amostras testadas na mesma placa e determine a porcentagem de células THP-1 positivas (células THP-1 que phagocytizaram pelo menos um IE). Para cada uma das amostras testadas, a fagocitose pode ser relatada como valores absolutos (percentual de células EtBr+ THP-1) ou como fagocitose relativa calculada como percentual utilizando o controle positivo como máximo.

Resultados

Aqui apresentamos em detalhes um protocolo que já foi descrito31 e utilizado11,12,13,14,15,16,17,18 para medir a capacidade de anticorpos voltados para a superfície das IEs P. falciparum para induzir opsonização e fagoci...

Discussão

O protocolo aqui apresentado foi previamente descrito e utilizado12,,15,17,31 para medir a capacidade dos anticorpos voltados para a superfície das IEs de P. falciparum para induzir opsonização e fagocitose pelas células THP-1. Os resultados aqui apresentados focam em anticorpos específicos VAR2CSA adquiridos naturalmente no plasma/soro de mulheres residentes em uma região endêm...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Maiken Visti é grato por excelente assistência técnica. Este trabalho foi parcialmente financiado por uma subvenção (MAVARECA II; 17-02-KU) do Ministério das Relações Exteriores da Dinamarca e administrado pelo Danida Fellowship Centre. O financiador não teve papel na concepção do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou elaboração do manuscrito.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
96 well cell culture plates, round bottom with lidCorning3799Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use
AlbuMAX-IIGibco11021-037
AlbuMAX-II (5%)--5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886)
Anti-Red Blood Cells antibodyAbcamab34858Prepare 2μl aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment.
DPBSSigmaP8622
Dynabeads Protein GInvitrogen10003D
Ethidium bromide solutionSigmaE1510Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light
FC500 flow cytometerBeckman CoulterAny flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used.
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco10099-141Heat inactivate before use.
FITC mouse anti-human CD16BD Biosciences555406 or 556618
FITC mouse anti-human CD32BD Biosciences552883
FITC mouse anti-human CD64BD Biosciences555527
FlowLogic softwareInivai technologiesAny flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist
Gentamicin (10mg/mL)SigmaG1272
HypoxanthineSigmaH9377
L-glutamine (200mM)SigmaG7513
Lysing solution--15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA
MACS CS-column and accesoriesMiltenyi Biotec130-041-305
Parasite culture medium--2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886)
Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL)SigmaP0781
RPMI-1640 mediumSigmaR5886
THP-1 culture medium--10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886)
Vario MACS magnetMiltenyi Biotec

Referências

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