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Resumen

Se han utilizado varios métodos para analizar lipoproteínas plasmáticas; sin embargo, ultracentrifugación sigue siendo uno de los métodos más populares y confiables. Aquí, describimos un método con respecto a cómo aislar las lipoproteínas del plasma utilizando ultracentrifugación de densidad secuencial y cómo analizar las apolipoproteínas con fines diagnósticos y de investigación.

Resumen

El análisis de lipoproteínas plasmáticas y apolipoproteínas es una parte esencial para el diagnóstico de dislipidemia y estudios de metabolismo lipídico y aterosclerosis. Aunque hay varios métodos para analizar lipoproteínas plasmáticas, ultracentrifugación sigue siendo uno de los métodos más populares y fiables. Debido a su procedimiento de separación intacto, las fracciones de lipoproteína aisladas por este método se pueden utilizar para el análisis de lipoproteínas, apolipoproteínas, proteomas, y estudio funcional de lipoproteínas con células cultivadas in vitro. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para aislar siete fracciones de lipoproteína incluyendo VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), PMA (d=1.04 y 1.06 g/mL), HDL (d=1.08, 1.10, y 1.21 g/mL) de plasma de conejo utilizando ultracentrifugación flotante secuencial. Además, presentamos a los lectores cómo analizar apolipoproteínas como apoA-I, apoB y apoE por SDS-PAGE y Western blotting y mostrar resultados representativos de perfiles de lipoproteína y apolipoproteína utilizando modelos de conejo hiperlipidémico. Este método puede convertirse en un protocolo estándar para que tanto los médicos como los científicos básicos analicen las funciones de lipoproteína.

Introducción

La dislipidemia es el principal factor de riesgo de la enfermedad aterosclerótica en el mundo. Los altos niveles de lipoproteínas de baja densidad (PMA) y los bajos niveles de lipoproteínas de alta densidad (HDL) están estrechamente asociados con un alto riesgo de enfermedad coronaria (CHD)1,2. En el entorno clínico, tanto el colesterol LDL (LDL-C) como el colesterol HDL (HDL-C) se miden rutinariamente utilizando un analizador automatizado en un laboratorio clínico3,4. A pesar de esto, es esencial analizar los perfiles de lipoproteína en detalle para el diagnóstico de dislipidemia y el estudio del metabolismo lipídico y la aterosclerosis en animales humanos y experimentales. Se han notificado varios métodos para analizar lipoproteínas plasmáticas como ultracentrifugación, cromatografía de exclusión de tamaño [cromatografía líquida de proteína rápida (FPLC) y cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)], electroforesis por agarose y geles de poliacrilamida, resonancia magnética nuclear y precipitación química selectiva utilizando polianiones y cálculos divalentes u otros productos químicos. En la década de 1950, el grupo de Havel propuso por primera vez el concepto de lipoproteínas definidas por densidades utilizando ultracentrifugación y las clasificó en chylomicrons (CM), lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), lipoproteínas de densidad intermedia (IDL), LDL y HDL5 y posteriores, el método fue modificado por otros grupos6,7. Hasta ahora, ultracentrifugación es el método más popular y fiable, mientras que el protocolo práctico todavía no está disponible. En este artículo, intentamos describir un protocolo fácil de usar para aislar una pequeña escala de plasma utilizando ultracentrifugación flotante de densidad secuencial descrita originalmente anteriormente8. Aislamiento de siete fracciones plasmáticas de lipoproteína [VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), PMA (d=1.04 y 1.06 g/mL), HDLs (d=1.08, 1.10, y 1.21 g/mL)] permite a los investigadores hacer un análisis exhaustivo de las lipoproteínas y sus apolipoproteínas composicionales9,10,11. Las lipoproteínas intactas de siete densidades consecutivas se pueden utilizar para analizar las funciones de lipoproteína y también servir para estrategias in vitro basadas en células. Este protocolo debe ser útil tanto para el diagnóstico clínico como para la investigación básica. Aquí usamos plasma de conejo como ejemplo para demostrar esta técnica, mientras que el plasma de otras especies se puede aplicar de la misma manera.

Protocolo

Todos los procedimientos para los estudios de conejo se realizaron con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Yamanashi (Número aprobado: A28-39).

1. Separación plasmática de sangre de conejo

  1. Preparar microtubos de 1,5 ml que contengan 15 μL de 0,5 M EDTA (pH 8,0) para la recolección de sangre.
  2. Ponga un conejo en un retenedador y pinche una arteria intermedia auricular usando una aguja del calibre 22 y recoja sangre en un tubo. Mezcle la sangre con EDTA suavemente y colócalos en hielo.
  3. Centrífuga los tubos sanguíneos a 1.500 x g durante 20 minutos a 4 °C y recoge plasma en un nuevo microtubo.
    NOTA: 3 ml de sangre es suficiente para recolectar plasma de 1 ml. Si recoges sangre de ratones u otros animales pequeños, necesitas juntarlas.

2. Aislamiento de lipoproteínas plasmáticas

NOTA: El procedimiento esquemático se muestra en la figura 1. El método de preparación de las soluciones de densidad de bromuro de potasio (KBr) se muestra en la Tabla 1.

  1. Transferir 1 ml de plasma a un tubo ultracentrífuga de policarbonato(Figura 2A).
  2. Cargue estos tubos en un rotor de ángulo fijo y centrífuga el plasma a 356.000 x g durante 2,5 h a 4 °C (Figura 2B).
    NOTA: Para Beckman TLA 120.2 rotor, 356,000 x g (campo centrífugo relativo promedio, Av RCF) corresponde a 100,000 rpm.
  3. Corte los tubos con una cortadora y luego recoja la fracción superior [VLDL (d<1.006 g/mL)], aproximadamente 200 μL en un nuevo microtubo (Figura 2C). Recoja la fracción inferior restante en un nuevo tubo ultracentrífuga de policarbonato para la siguiente separación (Figura 2D). Mida el volumen y haga el volumen total a 800 μL añadiendo la misma solución de densidad (d=1.006 g/mL).
    NOTA: Configure una cuchilla en la cortadora de tubos. Ajuste la posición de la hoja a un nivel entre la fracción superior (200 μL) y la fracción inferior (800 μL). El precipitante viscoso en la fracción inferior debe recogerse cuidadosamente y completamente pipeteando en todos los pasos siguientes. Si se detiene, hazlo después de separar la fracción superior e inferior en todos los pasos. Guarde la muestra a 4°C hasta la siguiente centrifugación.
  4. Ajuste la fracción inferior (total 800 μL) a d=1,02 g/ml añadiendo 58,9 μL de solución d=1,21 g/ml y 141,1 μL de solución d=1,02 g/ml (el volumen total es de 1 ml).
  5. Cargue estos tubos en rotor de ángulo fijo y centrífuga a 356.000 x g durante 2,5 h a 4 °C.
  6. Corte los tubos usando una cortadora y luego recoja la fracción superior [IDL (d=1.02 g/mL)] aproximadamente 200 μL en un nuevo microtubo. Recoge la fracción inferior restante en un nuevo tubo ultracentrífuga de policarbonato para la siguiente separación. Mida el volumen y haga el volumen total a 800 μL añadiendo la misma solución de densidad (d=1,02 g/mL).
  7. Ajuste la fracción inferior (total 800 μL) a d=1,04 g/ml añadiendo 94,1 μL de solución d=1,21 g/ml y 105,9 μL de solución d=1,04 g/ml (el volumen total es de 1 ml).
  8. Cargue estos tubos en un rotor de ángulo fijo y centrífuga a 356.000 x g durante 2,5 h a 4 °C.
  9. Corte los tubos usando una cortadora y luego recoja la fracción superior [LDL (d=1.04 g/mL)] aproximadamente 200 μL en un nuevo microtubo. Recoge la fracción inferior restante en un nuevo tubo ultracentrífuga de policarbonato para la siguiente separación. Mida el volumen y haga el total a 800 μL añadiendo la misma solución de densidad (d=1,04 g/mL).
  10. Ajuste la fracción inferior (total 800 μL) a d=1,06 g/ml añadiendo 106,7 μL de solución d=1,21 g/ml y 93,3 μL de solución d=1,06 g/ml (el volumen total es de 1 ml).
  11. Cargue estos tubos en un rotor de ángulo fijo y centrífuga a 356.000 x g durante 2,5 h a 4 °C.
  12. Corte los tubos usando una cortadora y luego recoja la fracción superior [LDL (d=1.06 g/mL)] aproximadamente 200 μL en un nuevo microtubo. Recoge la fracción inferior restante en un nuevo tubo ultracentrífuga de policarbonato para la siguiente separación. Mida el volumen y haga el total a 800 μL añadiendo la misma solución de densidad (d=1,06 g/mL).
  13. Ajuste la fracción inferior (total 800 μL) a d=1,08 g/ml añadiendo 123,1 μL de solución d=1,21 g/ml y 76,9 μL de solución d=1,08 g/ml (el volumen total es de 1 ml).
  14. Cargue estos tubos en un rotor de ángulo fijo y centrífuga a 356.000 x g durante 2,5 h a 4 °C.
  15. Corte los tubos usando una cortadora y luego recoja la fracción superior [HDL2 (d=1.08 g/mL)] aproximadamente 200 μL en un nuevo microtubo. Recoge la fracción inferior restante en un nuevo tubo ultracentrífuga de policarbonato para la siguiente separación. Mida el volumen y haga el total a 800 μL añadiendo la misma solución de densidad (d=1,08 g/mL).
  16. Ajuste la fracción inferior (total 800 μL) a d=1,10 g/ml añadiendo 145,5 μL de solución d=1,21 g/ml y 54,5 μL de solución d=1,10 g/ml (el volumen total es de 1 ml).
  17. Cargue estos tubos en un rotor de ángulo fijo y centrífuga a 356.000 x g durante 2,5 h a 4 °C.
  18. Corte los tubos usando una cortadora y luego recoja la fracción superior [HDL2 (d=1.10 g/mL)] aproximadamente 200 μL en un nuevo microtubo. Recoge la fracción inferior restante en un nuevo tubo ultracentrífuga de policarbonato para la siguiente separación. Mida el volumen y haga el total a 800 μL añadiendo la misma solución de densidad (d=1.10 g/mL).
  19. Ajuste la fracción inferior (total 800 μL) a d=1,21 g/ml añadiendo 0,140 g de bromuro de potasio (KBr) en polvo y disuelva por completo. Mida el volumen y consédelos a 1 mL añadiendo solución d=1.21 g/mL.
  20. Cargue estos tubos en rotor de ángulo fijo y centrífuga a 513.000 x g durante 4 h a 4 °C.
    NOTA: Para el rotor Beckman TLA 120.2, 513.000 x g (Av RCF) corresponde a 120.000 rpm.
  21. Cortar los tubos usando una cortadora y luego recoger la fracción superior [HDL3 (d = 1.21 g / mL)] aproximadamente 200 μL en un nuevo microtubo. Este es el último paso para la ultracentrorifugación.

3. Diálisis

NOTA: Debido a que las fracciones de densidad (excepto d<1.006 g/mL fracción) contienen altas concentraciones de KBr, es necesario eliminarlas por diálisis.

  1. Transfiera las fracciones de densidad a un tubo de diálisis y recorte ambos extremos con cierres.
  2. Diabólico contra 2 L de tampón de diálisis como PBS/ 1 mM EDTA durante 6 h a 4 °C con agitación usando un agitador magnético.
  3. Sustitúyalo por un nuevo búfer y diabólico de nuevo durante otras 6 h a 4 °C.
  4. Recopile las fracciones de densidad y mida el volumen. Ajuste todas las fracciones de densidad al mismo volumen (por ejemplo, 250 μL).
    NOTA: Puede calcular el factor concentrado a partir de 1 ml de plasma original (por ejemplo, 250 μL de fracción de densidad corresponde a cuatro veces la concentración).

4. Análisis de lipoproteínas

NOTA: Después de la diálisis, estas lipoproteínas están listas para diferentes análisis. Las lipoproteínas se pueden evaluar midiendo lípidos o apolipoproteínas o ambas. Para medir contenidos lipídicos como colesterol total (TC), triglicéridos (TG), fosfolípidos (PL) y colesterol libre (FC) en cada fracción, utilizamos kits de ensayo colorimétricos enzimáticos comerciales. Para el análisis de apolipoproteínas, utilizamos SDS-PAGE visualizado con tinción CBB o hinchazón occidental.

  1. Análisis lipídico
    NOTA: Los lípidos como TC, TG, PL y FC en la fracción de lipoproteína se pueden medir utilizando kits de medición disponibles comercialmente. Los procedimientos dependen de los reactivos utilizados, así que siga las instrucciones de cada kit utilizado. Aquí mostramos un ensayo típico de microplacas usando un kit de ensayo enzimático comercial.
    1. Aplique 8 μL de muestra de lipoproteína y sustancia de calibración estándar en microplaca de 96 pozos.
    2. Añadir 240 μL de reactivo de ensayo y mezclar por pipeteo.
    3. Incubar a 37 °C durante 10 min.
    4. Mida el sistema operativo con un lector de microplacas y calcule las concentraciones de lípidos.
  2. Análisis de Apolipoprotein
    1. Manchas SDS-PAGE y CBB
      1. Preparación de la muestra: Añadir 10 μL de 2x buffer de muestra a 10 μL de fracción de lipoproteína. Caliente la mezcla a 80 °C durante 5 minutos utilizando un bloque de calor seco.
      2. Prepare un gel SDS-poliacrilamida de gradiente del 4-20% y configure el gel en la cámara de electroforesis llena de amortiguador de funcionamiento.
      3. Cargue la muestra de lipoproteína (10 μL/carril) y los estándares proteicos (5 μL/carril) en el gel de apilamiento.
        NOTA: Si las muestras se concentran dos veces, se analizará una cantidad equivalente de plasma de 20 μL por carril.]
      4. Ejecute la electroforesis a una corriente constante de 20-40 mA.
      5. Tinción CBB: Remoje el gel dos veces en solución de fijación con agitación suave durante 10 minutos. Manchar el gel con solución de tinción CBB durante 30 min. Enjuague el gel en agua destilada para eliminar el exceso de manchas. El gel está listo para fotografiar.
    2. Hinchazón occidental
      1. Realice la electroforesis en el mismo procedimiento descrito anteriormente.
        NOTA: El volumen de lipoproteínas cargadas para la hinchazón occidental es menor que para las manchas de CBB descritas anteriormente (por ejemplo, 1-5 μL).
      2. Coloque el gel y la membrana PVDF entre el papel filtrante empapado en búfer de transferencia y la almohadilla de formulario. Coloque el sándwich en un casete de soporte y colóquelo en un tanque lleno de búfer de transferencia.
      3. Realice el electroblotting a una corriente constante de 100 mA durante 3 h a 4 °C.
      4. Bloqueo: Incubar la membrana en amortiguador de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C.
      5. Reacción ab primaria: Incubar las membranas en los abdominales primarios diluidos con amortiguador de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C con temblores leves.
        NOTA: La dilución primaria sugerida ab se muestra en la tabla de materiales. Tres tipos de abs primarios contra apolipoproteínas se pueden utilizar individualmente o en cócteles.
      6. Lave la membrana tres veces en búfer de lavado con agitación, 5 minutos por lavado.
      7. Reacción ab secundaria: Incubar la membrana en los abdominales secundarios diluido con amortiguador de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente con agitación.
        NOTA: La dilución ab secundaria sugerida se muestra en la tabla de materiales.
      8. Lave la membrana tres veces en búfer de lavado con agitación, 5 minutos por lavado.
      9. Detección de ECL: Coloque la membrana sobre una envoltura de plástico. Agregue reactivos de detección de ECL e incuba durante 1 min. Escurrir el exceso de líquido y sellar la membrana en una bolsa.
      10. Visualice las señales mediante un analizador de imágenes.

Resultados

Usando este protocolo, aislamos lipoproteínas de conejo usando 1 ml de plasma y obtuvimos siete fracciones de densidad. Las fracciones aisladas de densidad son suficientes para medir lípidos y apolipoproteínas como se describió anteriormente para la mayoría de los propósitos de investigación. El mismo procedimiento también se puede utilizar para aislar lipoproteínas plasmáticas de especies humanas y de otras especies. Para animales pequeños como ratones, se requiere plasma agrupado. Figura...

Discusión

La hiperlipidemia es uno de los factores de riesgo más importantes de la enfermedad aterosclerótica. Por lo tanto, el análisis de lipoproteínas plasmáticas no sólo es esencial para el diagnóstico de pacientes con dislipidemia, sino también importante para la investigación de mecanismos moleculares del metabolismo de la lipoproteína y la aterosclerosis. En este estudio, describimos el protocolo de aislamiento y análisis de lipoproteínas plasmáticas que se pueden aplicar en los laboratorios donde hay ultracent...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado en parte por una beca de investigación de JSPS KAKENHI Grant Number JP 20K08858, la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 81941001 y 81770457), JSPS-CAS bajo el Programa Cooperativo de Investigación Japón-China.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
22-gauge needleTerumoNN-2232SFor blood collection
96-well microplategreiner bio-one655101For lipids measurment
Anti-apolipoprotein A-I antibodyLifeSpan BioSciencesLS-C314186For Western blottng, use 1:1,000
Anti-apolipoprotein B antibodyROCKLAND600-101-111For Western blottng, use 1:1,000
Anti-apolipoprotein E antibodyMerck MilliporeAB947For Western blottng, use 1:1,000
CBB staining kitFUJIFILM Wako Pure Chemical299-50101For apolipoprotein analysis
CentrifugeHITACHIhimac CF15RN
ClosureSpectrum132736For lipoprotein dialysis
Dialysis tubingFUJIFILM Wako Pure Chemical043-30921For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000
Dry heat blockMajor ScienceMD-01NFor SDS-PAGE sample preparation
ECL Western blotting detection reagentsGE HealthcareRPN2209For Western blotting
Electrophoresis ChamberBIO-RADMini-PROTEAN Tetra Cell
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrateFUJIFILM Wako Pure Chemical345-01865For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM)
Filter paperADVANTEC590For Western blotting
Fixed angle ultracentrifuge rotorBECKMAN COULTER357656TLA-120.2
Fixing solutionFor SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid)
Immun-Blot PVDF menbraneBIO-RAD1620177For Western blotting
Lumino image analyzerGE HealthcareFor Western blotting, ImageQuant LAS 4000
Magnetic stirrerADVANTECSR-304For lipoprotein dialysis
Microplate reader iMARKBIO-RADFor lipids measurment
MicrotubeINA-OPTIKASC-0150
Orbital agitator USBDboStovall Life Science
Peroxidase congugated anti goat IgG antibodyJackson ImmunoResearch705-035-003For Western blotting, use 1:2,000
Peroxidase congugated anti mouse IgG antibodyJackson ImmunoResearch715-035-150For Western blotting, use 1:2,000
Phospholipids assay kitFUJIFILM Wako Pure Chemical433-36201For lipids measurment
Polycarbonate ultracentrifuge TubesBECKMAN COULTER343778
Potassium BromideFUJIFILM Wako Pure Chemical168-03475For density solution
Power SupplyBIO-RADFor SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC
Protein standards Precidion Plus Protein Dual XtraBIO-RAD161-0377For SDS-PAGE and Western blotting
Rabbit restrainerNatsume SeisakushoKN-318For blood collection
RotorHITACHIT15A43
SDS-PAGE running buffer25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS
SDS-PAGE sample buffer (2x)0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol
SDS-polyacrylamide gel4-20% gradient polyacrylamide gel
Skim milk powderFUJIFILM Wako Pure Chemical190-12865For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS)
Total cholesterol assay kitFUJIFILM Wako Pure Chemical439-17501For lipids measurment
Triglyicerides assay kitFUJIFILM Wako Pure Chemical432-40201For lipids measurment
Tube slicer for thick-walled tubeBECKMAN COULTER347960For lipoprotein isolation
Tween 20SIGMA-ALDRICHP1379For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS)
UltracentrifugeBECKMAN COULTERA95761Optima MAX-TL
Western blotting wet transfer systemBIO-RADMini Trans-Blot Cell

Referencias

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