Un semplice metodo di sessatura a secco per ottenere una sezione di resina di dimensioni intere e le sue applicazioni

Riepilogo

Questa tecnica consente la preparazione rapida e semplice di una sezione di resina delle dimensioni di semi interi per l'osservazione e l'analisi di cellule, granuli di amido e corpi proteici in diverse regioni del seme.

Abstract

La morfologia, le dimensioni e la quantità di cellule, granuli di amido e corpi proteici nei semi determinano il peso e la qualità dei semi. Sono significativamente diversi tra le diverse regioni di seme. Per visualizzare chiaramente le morfologie delle cellule, dei granuli di amido e dei corpi proteici e analizzare quantitativamente i loro parametri morfologici con precisione, è necessaria la sezione delle dimensioni di un seme intero. Sebbene la sezione di paraffina delle dimensioni di un seme intero possa studiare l'accumulo di materiali di stoccaggio nei semi, è molto difficile analizzare quantitativamente i parametri morfologici delle cellule e dei materiali di stoccaggio a causa della bassa risoluzione della sezione spessa. La sottile sezione in resina ha un'alta risoluzione, ma il metodo di sessatura della resina di routine non è adatto a preparare l'intera sezione di semi maturi delle dimensioni di semi con un grande volume e un alto contenuto di amido. In questo studio, presentiamo un semplice metodo di sessatura a secco per preparare l'intera sezione di resina delle dimensioni di un seme. La tecnica può preparare le sezioni trasversali e longitudinali di semi interi di semi in via di sviluppo, maturi, germinati e cotti incorporati nella resina LR White, anche per semi di grandi dimensioni ad alto contenuto di amido. La sezione di dimensioni di semi interi può essere macchiata con illuminante fluorescente 28, iodio e Coomassie blu brillante R250 per mostrare specificamente la morfologia di cellule, granuli di amido e corpi proteici chiaramente, rispettivamente. L'immagine ottenuta può anche essere analizzata quantitativamente per mostrare i parametri morfologici di cellule, granuli di amido e corpi proteici in diverse regioni di seme.

Introduzione

I semi vegetali contengono materiali di stoccaggio come amido e proteine e forniscono energia e nutrizione alle persone. La forma, le dimensioni e la quantità di materiali cellulari e di stoccaggio determinano il peso e la qualità dei semi. Le cellule e i materiali di stoccaggio in diverse regioni di seme hanno morfologie significativamente diverse, specialmente per alcune colture di cereali ad alto amilosio con inibizione dell'enzima di ramificazione^dell'amidoIIb 1^,2,3. Pertanto, è molto importante indagare le morfologie delle cellule e dei materiali di stoccaggio in diverse regioni di seme.

La sessatura della paraffina è un buon metodo per preparare la sezione di dimensioni di semi interi e può mostrare la struttura tissutale del seme e l'accumulo di materiale di stoccaggio in^{diverse regioni di seme 4,5,6}. Tuttavia, le sezioni di paraffina di solito hanno uno spessore di 6-8 μm con bassa risoluzione; pertanto, è molto difficile osservare e analizzare quantitativamente la morfologia delle cellule e dei materiali di stoccaggio. Le sezioni in resina hanno solitamente uno spessore di 1-2 μm e un'alta risoluzione e sono molto adatte ad osservare e analizzare la morfologia dei materiali cellulari e di^{stoccaggio 7.} Tuttavia, il metodo di sessatura della resina di routine ha difficoltà a preparare l'intera sezione delle dimensioni di un seme, specialmente per i semi con un grande volume e un alto contenuto di amido; pertanto, non c'è modo di osservare e analizzare la morfologia delle cellule e dei materiali di stoccaggio in diverse regioni del seme. La resina LR White è una resina acrilica e presenta bassa viscosità e forte permeabilità, portando alle sue buone applicazioni nella preparazione della sezione di resina dei semi, in particolare per chicchi maturi di cereali ad alto volume e alto contenuto di amido. Inoltre, il campione incorporato nella resina LR White può essere colorato facilmente con molti coloranti chimici per mostrare chiaramente la morfologia delle cellule e dei materiali di stoccaggio al microscopio leggero o fluorescente^7. Nel nostro precedente articolo, abbiamo segnalato un metodo di sessatura a secco per preparare le sezioni di cereali maturi delle dimensioni di semi interi incorporate nella resina LR White. Il metodo può anche preparare l'intera sezione delle dimensioni di semi di nocciolo di cereali in via di sviluppo, germinato e cotto⁸. La sezione ottenuta di dimensioni intere di semi ha molte applicazioni nell'osservazione e nell'analisi della micromorfologia, specialmente per visualizzare e analizzare quantitativamente chiaramente le differenze morfologiche delle cellule e dei materiali di stoccaggio in diverse^{regioni del seme 8,9}.

Questa tecnica è appropriata per i ricercatori che vogliono osservare la microstruttura del tessuto e la forma e le dimensioni delle cellule, dei granuli di amido e dei corpi proteici in diverse regioni del seme utilizzando il microscopio leggero. Le immagini di sezioni di dimensioni intere macchiate appositamente per l'esposizione di cellule, granuli di amido e corpi proteici possono essere analizzate da software di analisi morfologica per misurare quantitativamente i parametri morfologici di cellule, granuli di amido e corpi proteici in diverse regioni di seme. Al fine di dimostrare l'applicabilità tecnica e le applicazioni di sezioni di dimensioni intere, abbiamo studiato i semi maturi di mais e colza e i chicchi di riso in via di sviluppo, germinati e cotti in questo studio. Il protocollo contiene quattro processi. Qui, usiamo il chicchi di mais maturo, che è il più difficile nella preparazione delle sezioni di dimensioni di semi interi a causa del grande volume e dell'alto contenuto di amido, come campione per mostrare i processi passo dopo passo.

Protocollo

1. Preparazione di sementi incorporate in resina (figura 1)

1. Fissare sei chicchi maturi di mais in 10 mL del 2,5% di glutaraldeide tamponata da fosfati (0,1 M, pH7,2) a 4 °C per 48 h. I ricercatori possono scegliere altre miscele fissive, concentrazioni fissive e condizioni di fissazione in base ai loro obiettivi di ricerca e tipi di tessuto.
2. Esettare i chicchi e tagliarli longitudinalmente o trasversalmente a 2-3 mm di spessore utilizzando una lama affilata a doppia lato, e fissarli in 10 mL di glutaraldeide tamponata da fosfati al 2,5% (0,1 M, pH 7,2) di nuovo per 48 ore.
3. Lavare i campioni tre volte con 10 mL di tampone fosfato da 0,1 M (pH 7,2) per 30 minuti ogni volta.
4. Disidratare i campioni in gradi crescenti di soluzione acquosa di etanolo (10 mL) dal 30% al 50%, 70%, 90% una volta e 100% tre volte per 30 minuti ogni volta.
5. Infiltrarsi nei campioni in gradi crescenti di 10 mL di soluzione di resina bianca LR diluita con etanolo dal 25% al 50%, 75% una volta e 100% due volte a 4 °C per 12 h ogni volta.
6. Preparare i piedistalli per i campioni prima dell'incorporamento. Aggiungere 0,25 ml di resina bianca 100% LR in un tubo di centrifuga da 2 ml e polimerizzarlo a 60 °C per 48 ore.
7. Aggiungere successivamente la resina LR White pura (0,5 mL) e il campione infiltrato nel tubo di centrifuga con un piedistallo. Raddrizzare i campioni con l'ago anatomico e polimerizzarli a 60 °C in forno per 48 ore.

2. Sessatura a secco per la preparazione di una sezione di dimensioni intere(figura 1)

1. Eserti i chicchi incorporati dal tubo di centrifuga e tagliare la resina in eccesso intorno al campione usando una lama affilata.
2. Bloccare il blocco di resina nel portacampioni dell'ultramicrotoma (EM UC7) e tagliare la resina superflua sulla superficie del campione e intorno al campione con una lama.
3. Lucidare finemente la superficie del campione con un coltello di vetro fino a formare una sezione completa.
4. Mettere un piccolo gancio di rame circa 2 mm sopra il bordo della lama prima di tagliare e tagliare il campione in una sezione di 2 μm. Il ruolo del gancio è quello di evitare il curling verso l'alto della sezione.
5. Metti il gancio sotto la sezione per sostenerlo quando la sezione diventa lunga.
6. Aggiungere 100 μL di acqua su uno scivolo non pretrattato e trasferire con cura la sezione completa e ininterrotta nell'acqua con le pinzette.
7. Per levigare la sezione rugosa, scaldare e asciugare il campione sul tavolo appiattito a 50 °C durante la notte.
   1. Se la sezione si sbriciola o si strappa, prolungare il tempo per ogni infiltrazione di resina del campione da 12 h a 24 h o 48 h.
   2. Se la sezione ha alcune linee parallele al coltello, bloccare saldamente il blocco del campione. Se la sezione ha alcune linee verticali al coltello, si prega di utilizzare un nuovo coltello.

3. Colorazione e osservazione della sezione

NOTA: Al fine di osservare la struttura tissutale e la morfologia di cellule, granuli di amido e corpi proteici, macchiare le sezioni con macchie specifiche in base allo scopo della ricerca. Qui, usiamo il illuminante fluorescente 28, soluzione di iodio e Coomassie blu brillante R250 per macchiare le pareti cellulari, i granuli di amido e i corpi proteici, rispettivamente.

1. Per osservare la morfologia delle cellule, dentare la sezione con 40 mL dello 0,1% (w/v) illuminante fluorescente 28 soluzione acquosa in un barattolo di colorazione in vetro compatto da 70 mL a 45 °C per 10 minuti, quindi sciacquarlo con acqua corrente per 5 minuti. Osservare e fotografare la sezione al microscopio a fluorescenza dotato di telecamera CCD.
2. Per osservare la morfologia dei granuli di amido, macchiare la sezione con 40 μL di soluzione di iodio (0,07% (w/v) I₂ e 0,14% (w/v) KI nel 25% (v/v) glicerolo) per 1 min e coprire il campione contenente soluzione di iodio con un coverslip. Visualizza e fotografa il campione al microscopio luminoso dotato di una fotocamera CCD.
3. Per osservare la morfologia dei corpi proteici, immergere la sezione con 40 mL di acido acetico 10% (v/v) in un barattolo di colorazione in vetro compatto da 70 mL per 10 min a 45 °C, e poi macchiarlo in 40 mL di 1% (w/v) Coomassie blu brillante R250 nel 25% (v/v) isopropanolo e 10% (v/v) acido acetico per 15 min a 45 °C. Lavare le sezioni macchiate con acqua corrente per 5 minuti e asciugarla. Osservare e fotografare la sezione al microscopio luminoso dotato di una telecamera CCD.

4. Analisi quantitativa dei parametri morfologici

1. Elaborare e analizzare quantitativamente le immagini fotografate per area, asse lungo /corto e rotondità di cellule, granuli di amido e corpi proteici in diverse regioni di seme utilizzando software di analisi morfologica (software Image-Pro Plus 6.0) seguendo esattamente le procedure di Zhao et^al.

Risultati

Semplice metodo di sessatura a secco per ottenere una sezione di dimensioni di semi interi
Stabiliamo un semplice metodo di sessatura a secco per preparare una sezione di semi di dimensioni intere incorporata nella resina LR-bianca (Figura 1). Il metodo è in grado di preparare sezioni trasversali e longitudinali di dimensioni intere con spessore di 2 μm(Figura 2-5, Figura supplementare 1-4). Ad...

Discussione

Le sementi sono la risorsa rinnovabile più importante per alimenti, foraggi e materie prime industriali e sono ricche di materiali di stoccaggio come amido e proteine. La morfologia e la quantità delle cellule e il contenuto e la configurazione dei materiali di stoccaggio influiscono sul peso e sulla qualità dei^{semi 7,12}. Sebbene la tecnologia di stereologia e analisi delle immagini possa misurare le dimensioni e la quantità delle cellule in una regione tissu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A501931
Compact glass staining jar (5-Place)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	E678013
Coomassie brilliant blue R-250	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A100472
Coverslip	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	F518211
Double-sided blade	Gillette Shanghai Co., Ltd.	74-S
Ethanol absolute	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A500737
Flattening table	Leica	HI1220
Fluorescence microscope	Olympus	BX60
Fluorescent brightener 28	Sigma-Aldrich	910090
Glass strips	Leica	840031
Glutaraldehyde 50% solution in water	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A600875
Glycerol	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A600232
Iodine	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A500538
Isopropanol	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A507048
Light microscope	Olympus	BX53
LR White resin	Agar Scientific	AGR1281A
Oven	Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.,Ltd.	9023A
Potassium iodide	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A100512
Slide	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	F518101
Tweezers	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	F519022
Sodium phosphate dibasic dodecahydrate	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A607793
Sodium phosphate monobasic dihydrate	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A502805
Ultramicrotome	Leica	EM UC7