חקר דינמיקת חלבונים באמצעות ספקטרוסקופיה של הד ספין נויטרונים

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות לחקר המבנה והדינמיקה של שני חלבוני מודל שיש להם תפקיד חשוב בבריאות האדם. הטכניקה משלבת אפיון ביופיזי עם ספקטרוסקופיה של הד ספין נויטרונים כדי לגשת לדינמיקה בזמן ובקני המידה של האורך הרלוונטיים לתנועות אינטרדומיין של חלבונים.

Abstract

הפעילות והתפקוד של רוב חלבוני גוף האדם קשורים לשינויים קונפיגורטיביים של תת-דומיינים שלמים בתוך המבנה הגבישי של החלבון. המבנים הגבישיים בונים את הבסיס לכל חישוב המתאר את המבנה או הדינמיקה של חלבון, רוב הזמן עם מגבלות גיאומטריות חזקות. עם זאת, הגבלות אלה מהמבנה הגבישי אינן קיימות בתמיסה. מבנה החלבונים בתמיסה עשוי להיות שונה מהגביש עקב סידור מחדש של לולאות או תת-דומיינים בסולם הזמן של פיקו לננו-שניות (כלומר, משטר הזמן הפנימי של דינמיקת חלבונים). העבודה הנוכחית מתארת כיצד ניתן לגשת להילוך איטי על צירי זמן של כמה עשרות ננו-שניות באמצעות פיזור נויטרונים. בפרט, האפיון הדינמי של שני חלבונים אנושיים עיקריים, חלבון בעל הפרעה פנימית חסר מבנה משני מוגדר היטב וחלבון נוגדן קלאסי, מטופל על ידי ספקטרוסקופיית הד ספין נויטרונים (NSE) בשילוב עם מגוון רחב של שיטות אפיון מעבדה. תובנות נוספות על הדינמיקה של תחום החלבונים הושגו באמצעות מודלים מתמטיים כדי לתאר את נתוני הנייטרונים הניסיוניים ולקבוע את ההצלבה בין תנועות חלבונים מפוזרות ופנימיות משולבות. מיצוי התרומה הדינמית הפנימית לפונקציית פיזור הביניים המתקבלת מ-NSE, כולל ציר הזמן של התנועות השונות, מאפשר ראייה נוספת של התכונות המכניות של חלבונים בודדים ורכות החלבונים בסביבתם הכמעט טבעית בתמיסת החלבון הצפופה.

Introduction

בדיקת דינמיקה של חומר רך עם נויטרונים
חקר התכונות הדינמיות של חלבונים ופפטידים הוא חלק מרכזי במחקר הביופיזי, ושיטות מפותחות רבות קיימות כיום כדי לגשת למגוון רחב של נופי אנרגיה¹. הקשר בין הדינמיקה הניסיונית של החלבונים לתפקודם הביולוגי היא משימה קשה הרבה יותר, הדורשת מודלים מתמטיים מורכבים וסימולציות דינמיקה בעזרת מחשב. החשיבות של ספקטרוסקופיית נויטרונים לניתוח תנועות חלבונים הודגשה במספר מחקרים שהתקבלו היטב ומוכרים באופן נרחב ^1,2,3,4,5. לפני שנחקור את נוף האנרגיה ....

Protocol

העבודה הנוכחית מאפיינת שני חלבונים: חלבון נוגדן אנושי רגיל IgG, ו- MBP המופרע במהותו. הצורה הליופילית של החלבונים התקבלה ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים).

1. הכנת דגימת חלבון

1. הכינו חיץ נתרן פוספט של 50 mM + 0.1 M NaCl על ידי שקילה והמסה של הריאגנטים המוצקים המתאימים במים כבדים (D₂O) (ראו טבלת חומרים). זהו ממס המאגר המנוקד עבור IgG.
   1. התאם את ה- pH של פתרון המאגר ל- 6.6.
2. הכן חיץ נתרן פוספט + 6 MM 20 mM אוריאה על ידי שקילה והמסה של הרכיבים המוצקים המתאימים במים כבדים (D₂O). זהו ממס המאגר המנוקד עבור MBP.
   1. התאם את ה- pH של פת....

תוצאות

חלבון IgG מסרום אנושי וחלבוני MBP בקר הוכנסו מחדש בריכוזים גבוהים (כ-50 מ"ג/מ"ל) במאגרי בסיס O D₂. מכיוון שהחלבונים הומסו בריכוזים גבוהים, התמיסות שהתקבלו היו תמיסות חלבונים צפופות. הדינמיקה שנחשפה באמצעות NSE סובלת מהסביבה הצפופה שבה שוכנים החלבונים (אינטראקציות של גורמי מבנה והשפעות הידרו.......

Discussion

ספקטרוסקופיית NSE מספקת תצוגה ייחודית ומפורטת של הדינמיקה של חלבונים, שטכניקות ספקטרוסקופיות אחרות אינן יכולות לייצר. מדידות על פני סולם זמן ממושך מספקות תצפיות הן על הדיפוזיה התרגומית והן על הדיפוזיה הסיבובית של החלבונים, כפי שמוצג כאן. הדינמיקה הסגמנטלית ותנודות פנימיות אחרות חושפות את.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine MBP protein solution	Sigma-Aldrich	M1891	lyophilized powder reconstituted in  D2O
D2O - heavy water	Sigma-Aldrich	Product No. 151882	liquid
Dionized water	in house	-	for washing / cleanning cells
DLS instrument	Zetasizer Nano ZS, FZ-Jülich	-	dynamic light scattering instrument
Elastic scattering standards	SNS-NSE, ORNL	-	Al2O3  and Graphite powders
Ethanol	Sigma-Aldrich	65350-M	70% ethanol for cleaning cells
IgG protein solution	Sigma-Aldrich	I4506	lyophilized powder reconstituted in  D2O
KWS-2 instrument	JCNS outstation at the MLZ,  Garching, Germany	-	small angle neutron instrument
Liquinox dish detergent	Alconox	-	Phosphate-free liquid lab glassware cleaner
Na2HPO4·7H2O	Sigma-Aldrich	Product No.S9390	disodium phosphate heptahydrate salt
NaCl	Sigma-Aldrich	Product No.S9888	sodium chloride salt
NaH2PO4·H2O	Sigma-Aldrich	Product No. S9638	monosodium phosphate monohydrate salt
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Scientific	Catalog number: ND-2000	NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer
Neutron alignment camera	NeutronOptics, Grenoble	NOG210222	100 x 100 mm camera with Sony IMX249 CMOS sensor
Parafilm M - wax parafilm	Bemis	Parafilm M - 5259-04LC PM996	all-purpose laboratory film in cardboard dispenser
Phoenix-J-NSE Spectrometer	JCNS outstation at the MLZ,  Garching, Germany	-	neutron spectrometer
SasView	https://www.sasview.org/
SAXSpace, Anton Paar instrument	FZ-Jülich	-	small angle x-ray instrument
Slide-A-Lyzer dialysis membranes	Thermo Scientific	88400-88405	Slide-A-Lyzer mini dialysis devices tubes of 3.5 K MWCO
SNS Remote Analysis Cluster	Neutron Science Remote Analysis (sns.gov)	https://analysis.sns.gov
SNS-NSE spectrometer	ORNL, Oak Ridge, TN, USA	-	neutron spectrometer
Sterile syringe filters	VWR	N.A. PN:28145-501	0.2 µm pore size filters
Temperature Forcing System (TFS)	SP Scientific	Part Number 100004055	sample environment equipment
Urea -d4	Sigma-Aldrich	Product No. 176087	deuterated Urea salt
Viscometer	FZ-Jülich	-	falling ball viscometer