A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות לחקר המבנה והדינמיקה של שני חלבוני מודל שיש להם תפקיד חשוב בבריאות האדם. הטכניקה משלבת אפיון ביופיזי עם ספקטרוסקופיה של הד ספין נויטרונים כדי לגשת לדינמיקה בזמן ובקני המידה של האורך הרלוונטיים לתנועות אינטרדומיין של חלבונים.

Abstract

הפעילות והתפקוד של רוב חלבוני גוף האדם קשורים לשינויים קונפיגורטיביים של תת-דומיינים שלמים בתוך המבנה הגבישי של החלבון. המבנים הגבישיים בונים את הבסיס לכל חישוב המתאר את המבנה או הדינמיקה של חלבון, רוב הזמן עם מגבלות גיאומטריות חזקות. עם זאת, הגבלות אלה מהמבנה הגבישי אינן קיימות בתמיסה. מבנה החלבונים בתמיסה עשוי להיות שונה מהגביש עקב סידור מחדש של לולאות או תת-דומיינים בסולם הזמן של פיקו לננו-שניות (כלומר, משטר הזמן הפנימי של דינמיקת חלבונים). העבודה הנוכחית מתארת כיצד ניתן לגשת להילוך איטי על צירי זמן של כמה עשרות ננו-שניות באמצעות פיזור נויטרונים. בפרט, האפיון הדינמי של שני חלבונים אנושיים עיקריים, חלבון בעל הפרעה פנימית חסר מבנה משני מוגדר היטב וחלבון נוגדן קלאסי, מטופל על ידי ספקטרוסקופיית הד ספין נויטרונים (NSE) בשילוב עם מגוון רחב של שיטות אפיון מעבדה. תובנות נוספות על הדינמיקה של תחום החלבונים הושגו באמצעות מודלים מתמטיים כדי לתאר את נתוני הנייטרונים הניסיוניים ולקבוע את ההצלבה בין תנועות חלבונים מפוזרות ופנימיות משולבות. מיצוי התרומה הדינמית הפנימית לפונקציית פיזור הביניים המתקבלת מ-NSE, כולל ציר הזמן של התנועות השונות, מאפשר ראייה נוספת של התכונות המכניות של חלבונים בודדים ורכות החלבונים בסביבתם הכמעט טבעית בתמיסת החלבון הצפופה.

Introduction

בדיקת דינמיקה של חומר רך עם נויטרונים
חקר התכונות הדינמיות של חלבונים ופפטידים הוא חלק מרכזי במחקר הביופיזי, ושיטות מפותחות רבות קיימות כיום כדי לגשת למגוון רחב של נופי אנרגיה1. הקשר בין הדינמיקה הניסיונית של החלבונים לתפקודם הביולוגי היא משימה קשה הרבה יותר, הדורשת מודלים מתמטיים מורכבים וסימולציות דינמיקה בעזרת מחשב. החשיבות של ספקטרוסקופיית נויטרונים לניתוח תנועות חלבונים הודגשה במספר מחקרים שהתקבלו היטב ומוכרים באופן נרחב 1,2,3,4,5. לפני שנחקור את נוף האנרגיה המגוון של דינמיקת חלבונים פנימית, נדרשת סקירה קצרה של התהליכים הדינמיים בחומר רך וכיצד נויטרונים יכולים לגשת אליהם.

הרגישות של נויטרונים לתצורה איזוטופית וסוג האינטראקציות שהם מציגים עם חומר רך הופכים את פיזור הנייטרונים לאחת מטכניקות החקירה הרב-תכליתיות ביותר6. יש ספקטרום רחב של קני מידה של אורך קורלציה וזמני מתאם שנייטרונים יכולים לגשת אליהם, החל מעירורים גרעיניים ותנודות אטומיות ועד לתנועות קולקטיביות ותהליכי הרפיה איטיים כמו סיבובים איזוטרופיים ותנועות דיפוזיביות. כאשר חוקרים את הנייטרונים המפוזרים לצורך העברת האנרגיה שלהם, ניתן להבחין בין שלוש אינטראקציות עיקריות: הפיזור האלסטי, שבו אין חילופי אנרגיה בין נויטרון נכנס לחלקיק בדגימה; הפיזור הלא אלסטי, עם חילופי אנרגיה גדולים הניתנים לכימות בין נויטרונים לחלקיקים; והמקרה המוזר של פיזור מעין אלסטי שמייעד העברת אנרגיה קטנה מאוד בהשוואה לאנרגיית הנייטרונים המקרית 1,7. אינטראקציות אלה מספקות מידע מדויק על החומר הנחקר ומהוות את הבסיס התיאורטי למגוון רחב של טכניקות פיזור נויטרונים.

בפיזור אלסטי, הגלאי מתעד את כיווני הנייטרונים כדפוס עקיפה, המציג את מיקום אטומי הדגימה ביחס זה לזה. מידע על המתאמים של עמדות אטומיות נרכש (כלומר, עוצמה משולבת S(Q) לגבי העברת התנע Q, הנוגעת למידע מבני בלבד). עיקרון זה מהווה את הבסיס לעקירת הנייטרונים8.

המורכבות נוצרת כאשר העברת האנרגיה כבר אינה אפס עקב עירורים ותנודות פנימיות בחומר המדגם. זה מהווה את הבסיס לספקטרוסקופיית הנייטרונים, שבה הנייטרונים המפוזרים נחקרים כפונקציה הן של העברת האנרגיה E והן של העברת התנע Q. מתקבל מידע דינמי ומבני. ספקטרוסקופיית הנייטרונים מודדת את אותה עוצמה משולבת S(Q) להעברת אנרגיה (כלומר, שינוי מהירות של הנייטרונים עקב פיזור דגימות, S(Q,ω) = S(Q, E), המכונה גם גורם המבנה הדינמי)9.

לחישוב הפיזור מחומר, מתאים יותר להשתמש בפונקציית המתאם הזוגי 7,10. במקרה של עקיפה, פונקציית המתאם הזוגי הסטטי G(r) נותנת את ההסתברות למצוא את מרכז החלקיק במרחק נתון r ממרכזו של חלקיק אחר. הספקטרוסקופיה מכלילה את פונקציית המתאם הזוגי הסטטי וכוללת אנרגיה/תדר/זמן במשוואת הפיזור. פונקציית המתאם הזוגי G(r) הופכת לפונקציה של זמן G(r, t), אשר ניתן לפרק אותה לפונקציית מתאם זוג אטומים מובחנת GD(r, t), ולפונקציית מתאם עצמי GS(r, t). אלה מתארים שני סוגים של קורלציות: תנועות מתואמות-זוגיות של אטומים השולטות בפיזור הקוהרנטי, ומתאם עצמי השולט בפיזור הלא קוהרנטי10.

פיזור קוהרנטי הוא הפיזור מ"הממוצע" ותלוי בפאזה היחסית של הגלים המפוזרים. במשטר הפיזור בזווית קטנה, גלי הנייטרונים המפוזרים ממרכזי פיזור שונים (אטומים שונים) מתערבים באופן קונסטרוקטיבי (בעלי פאזות דומות), והתנועה הקולקטיבית של האטומים נצפית בהגברת עוצמה חזקה. פיזור קוהרנטי מתאר למעשה פיזור של נויטרון יחיד מכל הגרעינים בדגימה10.

כאשר לא מתרחשת התאבכות קונסטרוקטיבית בין גלי הנייטרונים המפוזרים ממרכזים שונים, מתקיים אטום יחיד בזמן, ונצפה המתאם העצמי בין מיקום האטום בזמן t = 0 לבין אותו אטום בזמן t. לפיכך, המידע על מיקומם היחסי של האטומים הולך לאיבוד, וההתמקדות היא רק בתנודות מקומיות. פיזור מתנודות מקומיות שולט בפיזור לא קוהרנטי. פיזור לא קוהרנטי הוא איזוטרופי, תורם לאות הרקע ומפרק את האות לרעש10,11.

בשילוב כל האמור לעיל, אנו מבחינים בארבעה תהליכי פיזור נויטרונים עיקריים10: (1) קוהרנטי אלסטי (מודד את המתאמים של מיקומי אטומים), (2) קוהרנטי לא אלסטי (מודד תנועות קולקטיביות של אטומים), (3) לא קוהרנטי אלסטי (תורם לרקע, מפחית את עוצמת הפיזור על ידי גורם דבי-וולר (DWF) ומודד גורם מבנה לא קוהרנטי אלסטי (EISF), המתאר את הגיאומטריה של תנועות דיפוזיביות בגאומטריה מוגבלת, ו-(4) אי-קוהרנטי לא-אלסטי (מודד דינמיקה של אטום יחיד ומתאם עצמי).

תהליכים דינמיים שנייטרונים יכולים לגשת אליהם בביולוגיה נעים בין דעיכה של תנודות אטומיות ומולקולריות בתדר נמוך, אינטראקציה של מולקולות ממס עם משטחים ביולוגיים, ותהליכי דיפוזיה בשכבת ההידרציה של מקרומולקולות וגיאומטריה מוגבלת, ועד לתנועות דיפוזיביות תרגומיות, סיבוביות ומטלטלות קצרות טווח, ותחומי חלבונים ותנועות אלוסטריות1 . המגוון הרחב של שיטות ומכשירים של נויטרונים למדידת דינמיקה של חלבונים מבוסס על האופן שבו מושגת הכרומטיזציה של האירוע או קרן הנייטרונים היוצאת וכיצד מתבצע ניתוח האנרגיה של הנייטרונים המפוזרים. מ-triple-axis ל-time-of-flight,backscattering וספקטרומטרים של ספין-הד, ניתן לחקור תהליכים דינמיים עם זמנים אופייניים בין 1 x 10-14 s ו-1 x 10-6 s (femtoseconds למיקרו-שניות)12.

המעבדה הלאומית אוק רידג', עם שני מקורות הנייטרונים הנודעים שלה, מקור הנייטרונים של Spallation - SNS13 וכור השטף האיזוטופי הגבוה - HFIR14, כוללת את אחת החבילות הטובות ביותר של ספקטרומטרים לחקר דינמיקה בחומרים ביולוגיים. כמה מהדוגמאות הרהוטות ביותר כוללות את השימוש בספקטרומטר מסוק הנויטרונים הקר (CNCS) ב- SNS15 כדי לחקור את ההפרעה הדינמית של מי הידרציה סביב חלבון פלואורסצנטי ירוק בתמיסה16 או את התנודות הקולקטיביות של תת-פיקוז-שניות של מספר חלבונים17. בעיה חוזרת ונשנית של חקירות פיזור נויטרונים לא אלסטיות היא שחלק מהתהליכים הביולוגיים איטיים מכדי שניתן יהיה לצפות בהם. ללא הגדרות קיצוניות המובילות לאובדן עצום של עוצמת הנייטרונים, ספקטרומטרים של זמן טיסה מוגבלים לרזולוציה של אנרגיה של 10 μeV, המתאימה לסולם זמן מרבי של ~ 200 ps10,11. זה לא מספיק כדי לצפות בתנועות בקנה מידה גדול בחלבונים. לכן, מכשירים עם רזולוציית אנרגיה גבוהה יותר כמו הספקטרומטרים האחוריים נדרשים לעתים קרובות. השילוב של טכניקות זמן הטיסה וההתרסקות האחורית הוכיח את עצמו כבעל עוצמה לחקר השינוי בדינמיקה הפנימית של ציטוכרום P450cam (CYP101), אנזים המזרז את קמפור ההידרוקסילציה18.

דיפוזיה מיקרוסקופית שנמדדה על ידי הספקטרומטר האחורי ב-SNS-BASIS19 הוגדרה היטב באופן מפתיע וניתן היה להפריד אותה לפיזור המים (הידרציה, ציטופלסמית ומים דמויי תפזורת) ולפיזור המרכיבים התאיים בתולעים שטוחות פלנריות, החיה החיה הראשונה שנחקרו על ידי פיזור נויטרונים20 . Backscattering היא טכניקה ספקטרוסקופית ברזולוציה גבוהה, אך היא מוגבלת גם למספר μeV = מספר ננו-שניות, בעוד שהדינמיקה האיטית בביו-חומרים מתבטאת גם בזמן ההישרדות של המתאם בין מיקום אטומי או כיווני ספין (למשל, תהליכי הרפיה, המתרחשים באופן קבוע בטווח הזמן של עשר עד מאות ננו-שניות).

ספקטרוסקופיה של הד ספין נויטרונים (NSE) היא טכניקת פיזור הנייטרונים היחידה שהגיעה לרזולוציה כה גבוהה. שלא כמו טכניקות נויטרונים אחרות, NSE אינו דורש אכרומטיזציה של הקרן מכיוון שהוא משתמש בפאזה המכנית הקוונטית של הנייטרונים, שהיא המומנטים המגנטיים שלהם. המניפולציה של מומנטים מגנטיים מאפשרת שימוש בהתפלגות רחבה של אורכי גל של קרן נויטרונים, בעוד שהטכניקה רגישה לשינויים קטנים מאוד במהירות הנייטרונים בסדר גודל של 1 x 10-4. NSE שימש בהצלחה כדי לחקור את הדינמיקה האיטית של חלבונים בתמיסה עבור חלבונים רבים. בין המחקרים החלוצים הרבים הללו, אנו מכירים בחקר הגמישות המגזרית של אימונוגלובולין חזיר21; תנועות התחום המצומדות בטאק פולימראז22; תנועות התחום בטטרמר של אלכוהול שמרים דהידרוגנאז23; שינוי הקונפורמציה בפוספוגליצראט קינאז על המצע המחייב3; הפעלת תנועות תחום וההתפשטות הדינמית של אותות אלוסטריים בחלבון 4,24,25; הדינמיקה של מצב קומפקטי של יון כספית רדוקטאז26; והפצת המוגלובין בתאי דם אדומים27. שני מחקרים עדכניים יותר בדינמיקה של חלבונים חשפו את הגמישות של הנוגדן האנושי אימונוגלובולין G (IgG) כמעיין אנטרופי28 ואת המאפיינים של תרומת הממסים לדינמיקה של חלבון בסיסי מיאלין (MBP)5 בעל הפרעה פנימית.

המאמר הנוכחי מסביר את העקרונות הבסיסיים של NSE, את שיטות ההכנה המרובות המומלצות לחקירה יסודית של דינמיקת חלבונים, כמו גם את המתודולוגיה ואת הפרוטוקול הניסיוני לרכישת נתוני NSE בספקטרומטר NSE ב- SNS, SNS-NSE. הפרוטוקול מאפיין שני חלבונים: IgG, חלבון נוגדן אנושי רגיל, וחלבון MBP בעל הפרעה פנימית. ההשלכות הביופיזיות, הרלוונטיות המחקרית של הדוגמאות ומגבלות הטכניקה נדונים בקצרה.

ספקטרוסקופיה של NSE, השיטה למדידות דינמיקה איטית
NSE היא טכניקה מקוטבת המשתמשת בזמן טיסה של נויטרונים כדי למדוד את חילופי האנרגיה (אובדן הקיטוב) עקב האינטראקציה המעין-אלסטית בין נויטרונים ואטומים בדגימה. בליבת הספקטרוסקופיה של NSE מסתתרים שני עקרונות בסיסיים: (1) יכולתו של ספין הנייטרונים להקדים בשדה המגנטי בתדר פרופורציונלי לעוצמה figure-introduction-9600מגנטית , כלומר תדר לרמור29, ו-(ב) הספין-הד או הד האן, המייצגים את המניפולציה וההתמקדות מחדש של אות הקיטוב בעת הפעלת סדרה של פולסים בתדרי רדיו30.

ניתן לסכם את היסודות של תהליך NSE בכמה שלבים פשוטים 6,11 באמצעות איור 1. (1) קרן הנייטרונים המיוצרת על ידי המקור (מיקום 1) מקוטבת (מיקום 2), מונחית ומובלת (מיקום 3), ומגיעה לכניסה לספקטרומטר NSE, שם היא מסתובבת ב-90° על ידי סנפיר ה-pi-half הראשון (מיקום 4). (2) הקרן המקוטבת (למשל, מומנטים מגנטיים של נויטרונים) הופכת בניצב לקווי השדה המגנטי של המגנט הראשון (אזור הקדם הראשון, מיקום 5) ומתחילה להקדים. (3) בקצה המגנט, ספיני נויטרונים צוברים זווית קדימה מסוימת ביחס לחוזק השדה המגנטי ולזמן הטיסה המושקע בתוכו (בעצם ביחס הפוך למהירות הנייטרונים). מהירויות הנייטרונים האינדיבידואליות מקודדות בזווית הקדימה שלהן בסוף אזור הקדימה הראשון. (4) קרוב למיקום המדגם, ה-pi-flipper (מיקום 6) הופך את כיוון הספין ב-180°, ומשנה את הסימן של זווית הקדם-זווית. (5) הנייטרונים מתקשרים עם המולקולות של הדגימה (מיקום 7) ומתפזרים. (6) הנייטרונים המפוזרים נכנסים ומקודמים לאזור הקדימה השני (מיקום 8) אך הופכים להיות בעלי אוריינטציה הפוכה. (7) סנפיר פי-חצי נוסף (מיקום 9) משמש לסיבוב כיוון הספין מהניצב לכיוון האופקי. פעולה זו תעצור את הקדימה, ותתרגם את זווית הקדם-φ לקיטוב פרופורציונלי ל-cos(φ). (8) המנתח (עמדה 10) בוחר את הנייטרונים על סמך כיוון אחד. אם האינטראקציה עם הדגימה היא אלסטית, מהירות הנייטרונים לא תשתנה. הנייטרונים יבלו פרק זמן זהה בטיסה באזורי הקדם הראשון והשני, וזוויות הקדימה המצטברות יתאוששו במלואן. הקיטוב המלא משוחזר על הגלאי (מיקום 11) כהד לקיטוב המקורי (כלומר, ספין-הד). (9) עם זאת, ב-NSE, הפיזור הוא מעין אלסטי, ולכן חילופי אנרגיה קטנים בין נויטרונים למולקולות דגימה מובילים למהירויות נויטרונים שונות לאחר פיזור על ידי הדגימה. בשל המהירויות השונות, הנייטרונים יבלו זמן נוסף בטיסה דרך אזור הקדם השני ולא יתאוששו כראוי מזווית הקדימה שלהם. קיטוב חלקי נשלף על הגלאי, ואובדן הקיטוב עקב הרפיית הספין פרופורציונלי להתמרת קוס-פורייה של הפונקציה הספקטרלית S(Q, ω), פונקציית פיזור הביניים F(Q, t). (10) פרמטר הזמן של הפונקציה F(Q, t) פרופורציונלי לחוזק השדה המגנטי של הקדם-קדם-חזה. סריקת אובדן הקיטוב כפונקציה של עוצמת השדה המגנטי מניבה, אם כן, פונקציית הרפיה התלויה בתהליכים הדינמיים בתוך המדגם.

figure-introduction-12092
איור 1: תצלום של הספקטרומטר NSE ב-SNS (SNS-NSE) ושל סכמת נתיב זבוב הנייטרונים עם הרכיבים הפונקציונליים החשובים ביותר. מימין לשמאל: 1 = מקור נויטרונים; 2 = מסוקים-בנדר-מקטב-מערכת תריסים משנית; 3 = מדריכי הובלת קרן; 4 = סנפיר pi/2 לסיבוב-סיבוב ספין 90° ראשון; 5 = אזור הקדם הראשון; 6 = סנפיר pi עבור סיבוב ספין 180°; 7 = אזור המדגם וסביבת הדגימה (כאן מוצג תנור הקריו); 8 = אזור הקדם השני; 9 = סנפיר pi/2 עבור סיבוב ספין 90° שני; 10 = מנתח; 11 = גלאי. (שימו לב שחלקים של 3, כמו גם 2 ו-1, ממוקמים מאחורי הקיר הכחול בתוך המיגון; המסוקים מוחלפים בבורר מהירות עבור NSE מבוסס כור). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Protocol

העבודה הנוכחית מאפיינת שני חלבונים: חלבון נוגדן אנושי רגיל IgG, ו- MBP המופרע במהותו. הצורה הליופילית של החלבונים התקבלה ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים).

1. הכנת דגימת חלבון

  1. הכינו חיץ נתרן פוספט של 50 mM + 0.1 M NaCl על ידי שקילה והמסה של הריאגנטים המוצקים המתאימים במים כבדים (D2O) (ראו טבלת חומרים). זהו ממס המאגר המנוקד עבור IgG.
    1. התאם את ה- pH של פתרון המאגר ל- 6.6.
  2. הכן חיץ נתרן פוספט + 6 MM 20 mM אוריאה על ידי שקילה והמסה של הרכיבים המוצקים המתאימים במים כבדים (D2O). זהו ממס המאגר המנוקד עבור MBP.
    1. התאם את ה- pH של פתרון המאגר ל- 4.7.
  3. סנן את ממסי המאגר באמצעות מסנני גודל נקבוביות של 0.2 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים).
  4. שקלו והמיסו את האבקות המטוהרות של החלבון ליופיליזציה בממסים המומתים עבור החלבונים המתאימים (שלבים 1.1.-1.2.) בריכוז גבוה של חלבונים (כ-50 מ"ג/מ"ל).
  5. טען את תמיסת החלבון בסלסלות דיאליזה עם ממברנות דיאליזה של 3.5 K MWCO, ודיאליזה כנגד המאגר המסונן למשך 24 שעות ב- 10 °C עבור MBP ו- 25 °C עבור IgG (ראה טבלת חומרים) על ידי ניעור קל של הצינורות כדי ליצור שיפוע דיפוזיה.
  6. דיללו את תמיסת החלבון באמצעות מאגר הדיאליזה בסדרת ריכוזים: 1, 2, 5, 10 ו-50 מ"ג/מ"ל.
  7. קבע את הריכוזים המדויקים באמצעות ספקטרופוטומטר ננו-טיפה (ראה טבלת חומרים).

2. אפיון מדגם ראשוני על ידי פיזור אור דינמי (DLS)

  1. טען 80 μL של כל תמיסת חלבון מסדרת הריכוזים שהוכנה לעיל (שלב 1.6.) לתוך התא החד-פעמי DLS (ראה טבלת חומרים) וקבע את מקדמי הדיפוזיה, בממוצע מעל 10 רכישות.
  2. שרטטו את מקדמי הדיפוזיה התרגומיים כפונקציה של ריכוז חלבונים והתמחו בריכוז אפסי.
  3. טען כל תמיסת חלבון מסדרת הריכוזים לצינורות הנימיים של ויסקומטר (ראה טבלת חומרים) ומדוד את הצמיגות הדינמית.
  4. התווה את הצמיגות הדינמית הנמדדת כפונקציה של ריכוז החלבון והתאמץ לריכוז אפסי.
    הערה: האקסטרפולציה של דיפוזיה DLS לריכוז אפס מניבה את הערך של דיפוזיה תרגומית עבור חלבון אחד בודד. האקסטרפולציה של צמיגות דינמית לריכוז אפס חייבת להניב את ערך הצמיגות הדינמי שנמדד באופן ניסיוני עבור תמיסת החיץ.

3. אוסף של פיזור בזווית קטנה (נויטרונים או רנטגן)

  1. מדוד פיזור נויטרונים בזווית קטנה (SANS) ו/או פיזור קרני רנטגן בזווית קטנה (SAXS) (ראו טבלת חומרים) על ארבעה ריכוזי חלבונים, רצוי 2 מ"ג/מ"ל, 5 מ"ג/מ"ל, 10 מ"ג/מ"ל ו-50 מ"ג/מ"ל.
  2. נרמלו את ספקטרום SANS ו-SAXS לפי ריכוז החלבון.
  3. התאם את גורם צורת החלבון P(Q) לספקטרום SANS ו-SAXS באמצעות תוכנת אופטימיזציה של אנסמבל31 ו/או SasView32 .
  4. חישוב גורם המבנה S(Q, c) על ידי חלוקת אות SANS ו-SAXS ב-P(Q) עבור כל ריכוז.
    הערה: קוראים המעוניינים כיצד למדוד ולפרש נתוני פיזור בזווית קטנה כתמיכה במדידות NSE מוזמנים לעיין ביסודיות בהפניות 23,28,31,32,33.

4. מדידת NSE

  1. הגדר לניסוי והרם את הדגימה בהתאם לשלבים הבאים.
    1. בחר את עובי התא לטעינת דגימה בהתבסס על ריכוז תמיסת החלבון, הטמפרטורה הדרושה למדידה וכמות התמיסה הזמינה.
      הערה: המחקר הנוכחי השתמש במיכלי קוורץ שקופים של מטעין עליון של 40 מ"מ x 30 מ"מ x 4 מ"מ.
    2. נקו את התא שוב ושוב, לסירוגין בין חומר ניקוי כלים ללא פוספט (ראו טבלת חומרים), מים שעברו דה-יוניזציה ו-70% אתנול.
    3. מייבשים את התא בתנור הסעה; אין לחרוג מ-80 מעלות צלזיוס עבור תאי הקוורץ.
    4. טען 4 מ"ל של תמיסת חלבון לתוך התא וסגור עם כובעים. השתמש בסרט שעווה או בחומר איטום כלשהו (ראה טבלת חומרים) כדי לאטום את תאי הדגימה.
      הערה: במחקר הנוכחי, נעשה שימוש ב-4.8 מ"ל של תמיסה במינון של כ-50 מ"ג/מ"ל כדי להשיג עוצמת פיזור מספקת.
    5. טען 4 מ"ל של מאגר דיאליזה לתוך מיכל זהה לזה של דגימת החלבון והאטימה.
    6. העבירו דגימות לקו הקרן, סגרו את התריס ונכנסו לאזור המערה של מתחם הספקטרומטר34.
    7. הרכיבו את תא הדגימה על מחזיק דגימת האלומיניום על ידי הידוק הברגים ולוחות האחיזה (איור 2, לוח שמאלי).
      הערה: ניתן להרכיב שני תאי דגימה בו-זמנית, בהתחשב בכך שאותו פרוטוקול מדידה נחוץ עבור כל הדגימות.
    8. הרכיבו את דגימת הגרפיט ו/או דגימת אבקת Al2O3 המועמסת במיכל זהה לזה של דגימת החלבון. אלה הם תקנים המסופקים על ידי התמיכה בקו הקרן SNS-NSE.
    9. מקם את מחזיק הדגימה על ידי החלקה עדינה שלו לתוך פחית מערכת כפיית הטמפרטורה (TFS, ראה טבלת חומרים).
      הערה: TFS היא סביבת הדגימה הנפוצה ביותר ב-SNS-NSE, והיא מזרימה אוויר יבש לתוך מיכל הדגימה כדי להשיג את הטמפרטורה הרצויה (איור 2, לוחות אמצעיים וימניים).
    10. סגור את מכסה ה- TFS והגדר את הטמפרטורה לערך הרצוי על-ידי גישה למסך האינטראקטיבי של ה- TFS.
    11. הרכיבו את מצלמת הנייטרונים (ראו טבלת חומרים) ליישור הדגימות לקרן.
    12. טאטאו את מתחם המכשירים, התפנו, סגרו את הדלתות ופתחו את תריס הקורה.
      הערה: תאים לדוגמה מסופקים על-ידי התמיכה בקו הקרן של SNS-NSE. לתאי דגימה זמינים ולספריית סביבת הדגימה, עיין בדף האינטרנט של קו הקרן SNS-NSE 7,35.
  2. אסוף את נתוני NSE בהתאם לשלבים הבאים.
    1. יישר את הדגימה בקרן הנייטרונים באמצעות מצלמת הנייטרונים וארבעת מפתחי הצמצם של הדגימה הבלתי תלויה.
    2. פתח את תוכנת איסוף הנתונים SNS-NSE36 ואסוף נתונים סטטיסטיים לדוגמה על ידי הפעלת סריקות עקיפה עבור זוויות הפיזור ואורך הגל הרצויים.
    3. הגדר את פרמטרי המדידה בהתבסס על הנתונים הסטטיסטיים שנאספו עבור כל דגימה על-ידי עריכת פקודות המאקרו של המדידה שסופקו על-ידי מדען המכשירים המסייע.
    4. התחל לסרוק על-ידי הקלדת שם הפרוטוקול במבקש הפקודה וקבל הדים עבור הדגימה.
    5. התחל לסרוק ולרכוש הדים גם עבור הייחוס האלסטי והממס האגור. בצע פעולת תריס קרן לסירוגין עבור שינוי הדגימה.

figure-protocol-6173
איור 2: מערכת מדידת NSE. לוח שמאלי: דגימות תמיסת חלבון במיכל קוורץ המורכבות עם ברגים ולוחות על מחזיק דגימת האלומיניום (Al). בעל דגימת Al מציע את האפשרות להרכיב שתי דגימות בו זמנית בתוך סביבת הדגימה. לוח אמצעי: ניתן להרכיב את דגימת מערכת כפיית הטמפרטורה (TFS) בשלב הדגימה שחלון קרן הנייטרונים נמצא בצד ימין, בעוד שמצלמת הנייטרונים המשמשת ליישור נראית בצד שמאל. לוח ימני: הצבת מחזיק הדגימה עם שתי דוגמאות לתוך הדגימה יכולה לעבוד עם חלונות סיליקון (Si). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

5. הפחתת נתוני NSE

הערה: SNS-NSE מצויד בתוכנה ייעודית בשם DrSpine (הפחתת נתונים עבור ספין-הד)37,38 הזמינה באשכול הניתוח מרחוק של ORNL Neutron Sciences, מדריך למשתמש מהיר ותמיכה מובנית בעזרה.

  1. היכנס לאשכול ניתוח מרחוק של מדעי הנייטרונים (ראה טבלת חומרים) עם אישורי המשתמש של ORNL, ולחץ על לחצן הפעל הפעלה .
  2. הגדר את תוכנת הפחתת הנתונים בהתאם לשלבים הבאים.
    1. בספריית המשתמש, פתח חלון מסוף והקלד: מקור / SNS / תוכנה / nse / וכו '/ setup_nse.sh.
    2. לאחר מכן, הקלד: drspine_create_env.sh.
  3. צור תיקיה להפחתת הנתונים בספריית הבית והעתק את קבצי ה- Script ופקודות המאקרו שסופקו מהספרייה המשותפת.
  4. ערוך, שנה את שמו ושמור את מאקרו ההפחתה המסופק בהתאם.
  5. הקלד drspine במנחה הפקודה והקש Enter כדי להפעיל את סביבת הפחתת התוכנה.
  6. הקלד "שם מאקרו ההפחתה" שנערך בשלב 5.4. במבקש הפקודות בסביבת התוכנה והקש Enter.

6. התאמת נתונים של NSE

  1. ערוך את סקריפט הפיתון "stapler-drspine.py", שסופק על ידי מדען המכשיר המסייע, עם שמות נתוני הקובץ המופחתים.
    הערה: סקריפט הפייתון זמין באופן חופשי למשתמשי הכלי.
  2. ערוך את הפונקציה כך שתתאים מהספריה שסופקה.
  3. הקלד את שם הסקריפט הערוך "stapler-drspine.py" במבקש הפקודות והקש Enter כדי לקרוא, להתאים ולהתוות נתוני NSE מופחתים.
    הערה: מדען המכשירים יספק תבנית למאקרו ההפחתה ולסקריפט הפיתון "stapler-drspine.py" שיכול לקרוא ולהתאים לנתונים המופחתים של NSE. נתוני ה- NSE המופחתים הסופיים הם בפורמט ASCII וניתן לקרוא אותם על ידי תוכנות מועדפות שונות.

תוצאות

חלבון IgG מסרום אנושי וחלבוני MBP בקר הוכנסו מחדש בריכוזים גבוהים (כ-50 מ"ג/מ"ל) במאגרי בסיס O D2. מכיוון שהחלבונים הומסו בריכוזים גבוהים, התמיסות שהתקבלו היו תמיסות חלבונים צפופות. הדינמיקה שנחשפה באמצעות NSE סובלת מהסביבה הצפופה שבה שוכנים החלבונים (אינטראקציות של גורמי מבנה והשפעות הידרו...

Discussion

ספקטרוסקופיית NSE מספקת תצוגה ייחודית ומפורטת של הדינמיקה של חלבונים, שטכניקות ספקטרוסקופיות אחרות אינן יכולות לייצר. מדידות על פני סולם זמן ממושך מספקות תצפיות הן על הדיפוזיה התרגומית והן על הדיפוזיה הסיבובית של החלבונים, כפי שמוצג כאן. הדינמיקה הסגמנטלית ותנודות פנימיות אחרות חושפות את...

Disclosures

המחבר מצהיר שאין אינטרסים כלכליים מתחרים ואין ניגודי עניינים. תוכן כתב היד מבוסס על ההרצאה שהציג המחבר בבית הספר לביולוגיה מבנית של HANDS-Neutron בין השנים 2019-2021.

Acknowledgements

מחקר זה השתמש במשאבים ב-Spallation Neutron Source (מעבדות BL-15, BL-6, ביולוגיה וכימיה), משרד DOE של מתקן משתמשי המדע המופעל על ידי המעבדה הלאומית אוק רידג'. מחקר זה השתמש גם במשאבים בכור MLZ-FRM2 גרצ'ינג (KWS-2, פיניקס-J-NSE) וב-JCNS1 ב-Forschungszentrum Jülich GmbH, גרמניה. המחבר מודה לד"ר ראלף ביהל ולד"ר אנדריאס שטדלר על עזרתם במידול ותרומתם למחקר חלבוני IgG ו-MBP, לד"ר פיוטר א. ז'ולניירצ'וק לתמיכה בהפחתת נתונים של NSE, לד"ר צ'אנגוו דו על התמיכה במדידות SANS, ולרונדה מודי וד"ר קווין לתמיכה במעבדת הביוכימיה של SNS.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Bovine MBP protein solutionSigma-AldrichM1891lyophilized powder reconstituted in  D2O
D2O - heavy waterSigma-AldrichProduct No. 151882liquid
Dionized waterin house-for washing / cleanning cells
DLS instrumentZetasizer Nano ZS, FZ-Jülich-dynamic light scattering instrument
Elastic scattering standardsSNS-NSE, ORNL-Al2O3  and Graphite powders
EthanolSigma-Aldrich65350-M70% ethanol for cleaning cells
IgG protein solutionSigma-AldrichI4506lyophilized powder reconstituted in  D2O
KWS-2 instrumentJCNS outstation at the MLZ,  Garching, Germany-small angle neutron instrument
Liquinox dish detergentAlconox-Phosphate-free liquid lab glassware cleaner
Na2HPO4·7H2OSigma-AldrichProduct No.S9390disodium phosphate heptahydrate salt
NaClSigma-AldrichProduct No.S9888sodium chloride salt
NaH2PO4·H2OSigma-AldrichProduct No. S9638monosodium phosphate monohydrate salt
Nanodrop spectrophotometerThermo ScientificCatalog number: ND-2000NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer
Neutron alignment cameraNeutronOptics, GrenobleNOG210222100 x 100 mm camera with Sony IMX249 CMOS sensor
Parafilm M - wax parafilmBemisParafilm M - 5259-04LC PM996all-purpose laboratory film in cardboard dispenser
Phoenix-J-NSE SpectrometerJCNS outstation at the MLZ,  Garching, Germany-neutron spectrometer
SasViewhttps://www.sasview.org/
SAXSpace, Anton Paar instrumentFZ-Jülich-small angle x-ray instrument
Slide-A-Lyzer dialysis membranesThermo Scientific88400-88405Slide-A-Lyzer mini dialysis devices tubes of 3.5 K MWCO
SNS Remote Analysis ClusterNeutron Science Remote Analysis (sns.gov)https://analysis.sns.gov
SNS-NSE spectrometerORNL, Oak Ridge, TN, USA-neutron spectrometer
Sterile syringe filtersVWRN.A. PN:28145-5010.2 µm pore size filters
Temperature Forcing System (TFS)SP ScientificPart Number 100004055sample environment equipment
Urea -d4Sigma-AldrichProduct No. 176087deuterated Urea salt
ViscometerFZ-Jülich-falling ball viscometer

References

  1. Fitter, J., Gutberlet, T., Katsaras, J. . Neutron Scattering in Biology: Techniques and Applications. , (2006).
  2. Stadler, A., Monkenbusch, M., Biehl, R., Richter, D., Ollivier, J. Neutron spin-echo and TOF reveals protein dynamics in solution. Journal of the Physical Society of Japan. 82, (2013).
  3. Inoue, R. Large domain fluctuations on 50-ns timescale enable catalytic activity in phosphoglycerate kinase. Biophysical Journal. 99 (7), 2309-2317 (2010).
  4. Callaway, D. J. E., et al. Controllable activation of nanoscale dynamics in a disordered protein alters binding kinetics. Journal of Molecular Biology. 429 (7), 987-998 (2017).
  5. Stingaciu, L. R., Biehl, R., Changwoo, D., Richter, D., Stadler, A. M. Reduced internal friction by osmolyte interaction in intrinsically disordered myelin basic protein. Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (1), 292-296 (2020).
  6. Monkenbusch, M., Richter, D. High resolution neutron spectroscopy-a tool for the investigation of dynamics of polymers and soft matter. Comptes Rendus Physique. , (2007).
  7. Richter, D., Monkenbusch, M., Schwahn, D. Neutron Scattering. Polymer Science: A Comprehensive Reference, 10 Volume Set. , (2012).
  8. Wilson, C. C. . Single Crystal Neutron Diffraction From Molecular Materials. , (2000).
  9. Marshall, W. . Theory of thermal neutron scattering. , (1971).
  10. . Roger Pynn Introduction & Neutron Scattering "Theory" Available from: https://neutrons.ornl.gov/sites/default/files/intro_to_neutron_scattering.pdf (2004)
  11. Richter, D. Neutron scattering in polymer physics. Physica B: Condensed Matter. 276-278, 22-29 (2000).
  12. Harroun, T. A., Wignall, G. D., Katsaras, J. Neutron scattering for biology. Neutron Scattering in Biology. , (2006).
  13. . SNS Available from: https://neutrons.ornl.gov/sna (2020)
  14. . HFIR Available from: https://neutrons.ornl.gov/hfir (2020)
  15. . CNCS Available from: https://neutrons.ornl.gov/cncs (2020)
  16. Perticaroli, S., et al. Description of hydration water in protein (green fluorescent protein) solution. Journal of the American Chemical Society. 139 (3), 1098-1105 (2017).
  17. Perticaroli, S., Nickels, J. D., Ehlers, G., Sokolov, A. P. Rigidity, secondary structure, and the universality of the boson peak in proteins. Biophysical Journal. 106 (12), 2667-2674 (2014).
  18. Miao, Y., et al. Coupled flexibility change in cytochrome p450cam substrate binding determined by neutron scattering, NMR, and molecular dynamics simulation. Biophysical Journal. 103 (10), 2167-2176 (2012).
  19. Mamontov, E., Zamponi, M., Hammons, S., Keener, W. S., Hagen, M., Herwig, K. W. BASIS: A new backscattering spectrometer at the SNS. Neutron News. 19 (3), 22-24 (2008).
  20. Mamontov, E. Microscopic diffusion processes measured in living planarians. Scientific Reports. 9, 8708 (2018).
  21. Alpert, Y., Cser, L., Faragó, B., Franěk, F., Mezei, F., Ostanevich, Y. M. Segmental flexibility in pig immunoglobulin G studied by neutron spin-echo technique. Biopolymers. 24 (9), 1769-1784 (1985).
  22. Bu, Z., Biehl, R., Monkenbusch, M., Richter, D., Callaway, D. J. E. Coupled protein domain motion in Taq polymerase revealed by neutron spin-echo spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (49), 17646-17651 (2005).
  23. Biehl, R., et al. Direct observation of correlated interdomain motion in alcohol dehydrogenase. Physical Review Letters. 101, 138102 (2008).
  24. Farago, B., Li, J., Cornilescu, G., Callaway, D. J. E., Bu, Z. Activation of nanoscale allosteric protein domain motion revealed by neutron spin echo spectroscopy. Biophysical Journal. 99 (10), 3473-3482 (2010).
  25. Bu, Z., Callaway, D. J. E. Dynamic propagation of long-range allosteric signals by nanoscale protein domain motion revealed by neutron spin echo spectroscopy. Biophysical Journal. 100 (3), 223 (2011).
  26. Hong, L., et al. Structure and dynamics of a compact state of a multidomain protein, the mercuric ion reductase. Biophysical Journal. 107 (2), 393-400 (2014).
  27. Longeville, S., Stingaciu, L. -. R. Hemoglobin diffusion and the dynamics of oxygen capture by red blood cells. Scientific Reports. 7, 10448 (2017).
  28. Stingaciu, L. R., Ivanova, O., Ohl, M., Biehl, R., Richter, D. Fast antibody fragment motion: Flexible linkers act as entropic spring. Scientific Reports. 6, 22148 (2016).
  29. Hahn, E. L. Nuclear induction due to free larmor precession. Physical Review. 77, 297 (1950).
  30. Hahn, E. L. Spin echoes. Physical Review. 80, 580 (1950).
  31. Svergun, D. I., Koch, M. H. J. Small-angle scattering studies of biological macromolecules in solution. Reports on Progress in Physics. 66 (10), 1735-1782 (2003).
  32. . Sasview Available from: https://www.sasview.org (2020)
  33. Zhao, J. K., Gao, C. Y., Liu, D. The extended Q-range small-angle neutron scattering diffractometer at the SNS. Journal of Applied Crystallography. 43, 1068-1077 (2010).
  34. Ohl, M., et al. The high-resolution neutron spin-echo spectrometer for the SNS with τ ≥ 1 µs. Physica B: Condensed Matter. 350, 147-150 (2004).
  35. . SNS-NSE web page Available from: https://neutrons.ornl.gov/nse (2022)
  36. Ohl, M., et al. The spin-echo spectrometer at the Spallation Neutron Source (SNS). Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 696, 85-99 (2012).
  37. Zolnierczuk, P. A., Holderer, O., Pasini, S., Kozielewski, T., Stingaciu, L. R., Monkenbusch, M. Efficient data extraction from neutron time-of-flight spin-echo raw data. Journal of Applied Crystallography. 52 (5), 1022-1034 (2019).
  38. . Dr Spine hub Available from: https://jugit.fz-juelich.de/nse/drspine (2022)
  39. Stadler, A. M., et al. Internal nanosecond dynamics in the intrinsically disordered myelin basic protein. Journal of the American Chemical Society. 136 (19), (2014).
  40. . FZJ Available from: https://www.fz-juelich.de/portal/EN/AboutUs (2022)
  41. . KWS2 Available from: https://miz-garching.de/kws-2 (2022)
  42. Moorhouse, M., Barry, P. The protein databank. Bioinformatics Biocomputing and Perl. , (2005).
  43. Tria, G., Mertens, H. D. T., Kachala, M., Svergun, D. I. Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering. IUCrJ. 2 (2), 207-217 (2015).
  44. Holderer, O., Monkenbusch, M., Schätzler, R., Kleines, H., Westerhausen, W., Richter, D. The JCNS neutron spin-echo spectrometer J-NSE at the FRM II. Measurement Science and Technology. 90 (4), 043107 (2008).
  45. Biehl, R., Monkenbusch, M., Richter, D. Exploring internal protein dynamics by neutron spin echo spectroscopy. Soft Matter. 7 (4), 1299-1307 (2011).
  46. Stingaciu, L. R., Ivanova, O., Ohl, M., Biehl, R., Richter, D. Fast antibody fragment motion: Flexible linkers act as entropic spring. Scientific Reports. 6, 22148 (2016).
  47. Stadler, A. M., et al. Internal nanosecond dynamics in the intrinsically disordered myelin basic protein. Journal of the American Chemical Society. 136 (19), 6987-6994 (2014).
  48. Biehl, R., Richter, D. Slow internal protein dynamics in solution. Journal of Physics: Condensed Matter. 26 (50), 503103 (2014).
  49. Hinsen, K. The molecular modeling toolkit: A new approach to molecular simulations. Journal of Computational Chemistry. 21 (2), 79-85 (2000).
  50. Uhlenbeck, G. E., Ornstein, L. S. On the theory of the Brownian motion. Physical Review. 36 (5), 823 (1930).
  51. Wang, M. C., Uhlenbeck, G. E. On the theory of the Brownian motion II. Reviews of Modern Physics. 17, 323 (1945).
  52. Callaway, D. J. E., Bu, Z. Nanoscale protein domain motion and long-range allostery in signaling proteins-a view from neutron spin echo spectroscopy. Biophysical Reviews. 7 (2), 165-174 (2015).
  53. Liu, Y. Intermediate scattering function for macromolecules in solution probed by neutron spin echo. Physical Review E. 95, 020501 (2017).
  54. Liu, Y. Short-time dynamics of proteins in solutions studied by neutron spin echo. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 42, 147-156 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

182

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved