Studio della dinamica delle proteine tramite spettroscopia eco-spin neutronica

Riepilogo

Il presente protocollo descrive i metodi per studiare la struttura e la dinamica di due proteine modello che hanno un ruolo importante nella salute umana. La tecnica combina la caratterizzazione biofisica da banco con la spettroscopia eco-spin neutronica per accedere alla dinamica alle scale di tempo e lunghezza rilevanti per i movimenti interdominio delle proteine.

Abstract

L'attività e la funzionalità della maggior parte delle proteine del corpo umano sono correlate ai cambiamenti configurazionali di interi sottodomini all'interno della struttura cristallina della proteina. Le strutture cristalline costruiscono la base per qualsiasi calcolo che descriva la struttura o la dinamica di una proteina, il più delle volte con forti restrizioni geometriche. Tuttavia, queste restrizioni dalla struttura cristallina non sono presenti nella soluzione. La struttura delle proteine nella soluzione può differire dal cristallo a causa di riarrangiamenti di loop o sottodomini sulla scala temporale da pico a nanosecondi (cioè il regime temporale della dinamica proteica interna). Il presente lavoro descrive come è possibile accedere a slow motion su scale temporali di diverse decine di nanosecondi utilizzando lo scattering neutronico. In particolare, la caratterizzazione dinamica di due principali proteine umane, una proteina intrinsecamente disordinata che manca di una struttura secondaria ben definita e una proteina anticorpale classica, è affrontata mediante spettroscopia eco-spin neutronica (NSE) combinata con una vasta gamma di metodi di caratterizzazione di laboratorio. Ulteriori approfondimenti sulla dinamica del dominio proteico sono stati ottenuti utilizzando la modellazione matematica per descrivere i dati sperimentali dei neutroni e determinare il crossover tra i moti diffusivi combinati e i movimenti proteici interni. L'estrazione del contributo dinamico interno alla funzione di scattering intermedio ottenuto da NSE, compresa la scala temporale dei vari movimenti, consente un'ulteriore visione delle proprietà meccaniche delle singole proteine e della morbidezza delle proteine nel loro ambiente quasi naturale nella soluzione proteica affollata.

Introduzione

Sondare la dinamica della materia soffice con neutroni
Studiare le proprietà dinamiche di proteine e peptidi è una parte importante della ricerca biofisica e oggi esistono molti metodi ben sviluppati per accedere a una vasta gamma di paesaggi energetici¹. Mettere in relazione la dinamica sperimentalmente rivelata delle proteine con la loro funzione biologica è un compito molto più difficile, che richiede complessi modelli matematici e simulazioni dinamiche assistite da computer. L'importanza della spettroscopia neutronica per l'analisi dei moti proteici è stata sottolineata in diversi studi ben accolti e ampiamente riconosciuti 1,2,3,4,5. Prima di esplorare il variegato panorama energetico della dinamica proteica interna, è necessaria una breve panoramica dei processi dinamici nella materia soffice e di come i neutroni possono accedervi.

La sensibilità dei neutroni alla configurazione isotopica e il tipo di interazioni che mostrano con la materia soffice rende lo scattering neutronico una delle tecniche di indagine più versatili⁶. Esiste un ampio spettro di scale di lunghezza di correlazione e tempi di correlazione a cui i neutroni possono accedere, dalle eccitazioni nucleari e dalle vibrazioni atomiche ai moti collettivi e ai processi di rilassamento lento come le rotazioni isotrope e i moti diffusivi. Quando si studiano i neutroni sparsi per il loro trasferimento di energia, si possono distinguere tre interazioni principali: lo scattering elastico, in cui non vi è scambio di energia tra neutrone in arrivo e particella nel campione; lo scattering anelastico, con un ampio scambio di energia quantificabile tra neutrone e particella; e il caso peculiare dello scattering quasi-elastico che designa un trasferimento di energia molto piccolo rispetto all'energia neutronica incidente ^1,7. Queste interazioni forniscono informazioni precise sul materiale studiato e costituiscono la base teorica di un'ampia varietà di tecniche di scattering neutronico.

Nello scattering elastico, il rivelatore registra le direzioni dei neutroni come un modello di diffrazione, che mostra la posizione degli atomi campione l'uno rispetto all'altro. Vengono acquisite informazioni sulle correlazioni delle posizioni atomiche (cioè l'intensità integrata S(Q) relativa al trasferimento di quantità di moto Q, che riguarda solo le informazioni strutturali). Questo principio costituisce la base della diffrazione neutronica⁸.

La complessità sorge quando il trasferimento di energia non è più zero a causa di eccitazioni e fluttuazioni interne nel materiale campione. Questo costituisce la base della spettroscopia neutronica, in cui i neutroni sparsi sono studiati in funzione sia del trasferimento di energia E che del trasferimento di quantità di moto Q. Si ottengono informazioni dinamiche e strutturali. La spettroscopia neutronica misura la stessa intensità integrata S(Q) per il trasferimento di energia (cioè la variazione di velocità dei neutroni dovuta allo scattering del campione, S(Q,ω) = S(Q, E), che è anche indicato come fattore di struttura dinamica)⁹.

Per calcolare lo scattering da un materiale, è più appropriato utilizzare la funzione di correlazione di coppia ^7,10. Nel caso della diffrazione, la funzione di correlazione della coppia statica G(r) dà la probabilità di trovare il centro di una particella ad una data distanza r dal centro di un'altra particella. La spettroscopia generalizza la funzione di correlazione della coppia statica e include energia/frequenza/tempo nell'equazione di scattering. La funzione di correlazione di coppia G(r) diventa una funzione del tempo G(r, t), che può essere scomposta in una distinta funzione di correlazione della coppia atomica G_D(r, t), e una funzione di auto-correlazione G_S(r, t). Questi descrivono due tipi di correlazioni: i moti correlati alle coppie degli atomi che governano lo scattering coerente e l'auto-correlazione che governa lo scattering incoerente¹⁰.

Lo scattering coerente è lo scattering da "la media" e dipende dalla fase relativa delle onde sparse. Nel regime di scattering a piccolo angolo, le onde di neutroni sparse da diversi centri di scattering (atomi diversi) interferiscono in modo costruttivo (hanno fasi simili) e il movimento collettivo degli atomi viene osservato con un forte aumento dell'intensità. Lo scattering coerente descrive essenzialmente lo scattering di un singolo neutrone da tutti i nuclei del campione¹⁰.

Quando non si verifica alcuna interferenza costruttiva tra le onde di neutroni sparse da centri diversi, un singolo atomo viene seguito nel tempo e si osserva l'auto-correlazione tra la posizione dell'atomo al tempo t = 0 e lo stesso atomo al tempo t. Pertanto, le informazioni sulle posizioni relative degli atomi vengono perse e l'attenzione si concentra solo sulle fluttuazioni locali. La dispersione da fluttuazioni locali governa lo scattering incoerente. Lo scattering incoerente è isotropo, contribuisce al segnale di fondo e degrada il segnale-rumore^10,11.

Combinando tutto quanto sopra, distinguiamo quattro principali processi di scattering neutronico¹⁰: (1) coerente elastico (misura le correlazioni delle posizioni atomiche), (2) coerente anelastico (misura i moti collettivi degli atomi), (3) elastico incoerente (contribuisce allo sfondo, riduce l'intensità di scattering mediante il fattore di Debye-Waller (DWF) e misura il fattore di struttura incoerente elastica (EISF), descrivendo la geometria dei moti diffusivi in geometria confinata, e (4) incoerente anelastico (misura la dinamica del singolo atomo e l'auto-correlazione).

I processi dinamici a cui i neutroni possono accedere in biologia vanno dallo smorzamento delle vibrazioni atomiche e molecolari a bassa frequenza, all'interazione delle molecole di solvente con le biosuperfici e ai processi di diffusione nello strato di idratazione delle macromolecole e della geometria confinata, ai movimenti diffusivi traslazionali, rotazionali e di burattatura a corto raggio, ai domini proteici e ai moti allosterici¹ . L'ampia diversità dei metodi e degli strumenti di neutroni per misurare la dinamica delle proteine si basa su come si ottiene l'acromatizzazione del fascio di neutroni incidente o in uscita e su come viene eseguita l'analisi energetica dei neutroni sparsi. Dagli spettrometri a triplo asse a time-of-flight, backscattering e spin-echo, si possono esplorare processi dinamici con tempi caratteristici compresi tra 1 x ^10-14 s e 1 x ^10-6 s (da femtosecondi a microsecondi)¹².

L'Oak Ridge National Laboratory, con le sue due rinomate sorgenti di neutroni, la Spallation Neutron Source - SNS¹³ e l'High Isotope Flux Reactor - HFIR¹⁴, ha una delle migliori suite di spettrometri per lo studio della dinamica nei biomateriali. Alcuni degli esempi più eloquenti includono l'uso dello spettrometro chopper a neutroni freddi (CNCS) a SNS¹⁵ per studiare la perturbazione dinamica dell'acqua di idratazione intorno alla proteina fluorescente verde nella soluzione¹⁶ o le vibrazioni collettive sub-picosecondi di diverse proteine¹⁷. Un problema ricorrente delle indagini anelastiche sullo scattering dei neutroni è che alcuni processi biologici sono troppo lenti per essere osservati. Senza configurazioni estreme che portano a un'enorme perdita di intensità neutronica, gli spettrometri a tempo di volo sono limitati a una risoluzione di energia di 10 μeV, corrispondente a una scala temporale massima di ~ 200 ps^10,11. Questo non è sufficiente per osservare movimenti su larga scala nelle proteine. Pertanto, sono spesso necessari strumenti con una risoluzione energetica più elevata come gli spettrometri backscattering. La combinazione del tempo di volo e delle tecniche di backscattering si è dimostrata efficace per studiare il cambiamento nella dinamica interna del citocromo P450cam (CYP101), un enzima che catalizza l'idrossilazione della canfora¹⁸.

La diffusività microscopica misurata dallo spettrometro retrodiffusante di SNS-BASIS¹⁹ era sorprendentemente ben definita e poteva essere separata nella diffusività dell'acqua (idratazione, citoplasmatica e acqua simile alla massa) e nella diffusività dei costituenti cellulari nei platelminti planari, il primo animale vivente ad essere studiato mediante scattering neutronico²⁰ . Il backscattering è una tecnica spettroscopica ad alta risoluzione, ma è anche limitata a diversi μeV = diversi nanosecondi, mentre la dinamica lenta nei biomateriali si manifesta anche come il tempo di sopravvivenza della correlazione tra posizione atomica o orientamenti di spin (ad esempio, processi di rilassamento, che si verificano regolarmente nell'intervallo di tempo da dieci a centinaia di nanosecondi).

La spettroscopia eco di spin neutronico (NSE) è l'unica tecnica di scattering neutronico a raggiungere una risoluzione così elevata. A differenza di altre tecniche neutroniche, NSE non richiede l'acromatizzazione del fascio poiché utilizza la fase meccanica quantistica dei neutroni, che è i loro momenti magnetici. La manipolazione dei momenti magnetici consente l'uso di un'ampia distribuzione della lunghezza d'onda del fascio di neutroni, mentre la tecnica è sensibile a variazioni di velocità di neutroni molto piccole nell'ordine di 1 x ^10-4. NSE è stato utilizzato con successo per studiare la lenta dinamica delle proteine in soluzione per molte proteine. Tra questi numerosi studi pionieristici, riconosciamo lo studio della flessibilità segmentale dell'immunoglobulina²¹ suina; i moti del dominio accoppiato nella Taq polimerasi²²; i moti di dominio nel tetramero del lievito alcol deidrogenasi²³; il cambiamento di conformazione della fosfoglicerato chinasi in base al legame del substrato³; l'attivazione dei moti di dominio e la propagazione dinamica dei segnali allosterici nella proteina ^4,24,25) di regolazione dello scambio Na⁺/H+⁽NHERF1); la dinamica di uno stato compatto di ione reduttasi mercurico²⁶; e la diffusione dell'emoglobina nei globuli rossi²⁷. Due studi più recenti sulla dinamica delle proteine hanno esposto la flessibilità dell'anticorpo umano Immunoglobulina G (IgG) come molla entropica²⁸ e le caratteristiche del contributo del solvente alla dinamica della proteina basica della mielina intrinsecamente disordinata (MBP)⁵.

Il presente articolo spiega i principi di base dell'NSE, i molteplici metodi preparatori raccomandati per un'indagine approfondita della dinamica delle proteine, nonché la metodologia e il protocollo sperimentale per l'acquisizione dei dati NSE presso lo spettrometro NSE di SNS, SNS-NSE. Il protocollo caratterizza due proteine: IgG, una normale proteina anticorpale umana, e la proteina intrinsecamente disordinata MBP. Le implicazioni biofisiche, la rilevanza della ricerca degli esempi e i limiti della tecnica sono discussi brevemente.

Spettroscopia NSE, il metodo per le misure di dinamica lenta
NSE è una tecnica polarizzata che utilizza il tempo di volo dei neutroni per misurare lo scambio di energia (perdita di polarizzazione) dovuto all'interazione quasi elastica tra neutroni e atomi in un campione. Al centro della spettroscopia NSE si trovano due principi di base: (1) la capacità dello spin neutronico di precedere nel campo magnetico con una frequenza proporzionale alla forza magnetica, vale a dire la frequenza di Larmor²⁹, e (b) l'eco di spin o eco di Hann, che rappresenta la manipolazione e la rifocalizzazione del segnale di polarizzazione quando si applica una serie di impulsi a radiofrequenza³⁰.

Le basi del processo NSE possono essere riassunte in pochi semplici passaggi ^6,11 utilizzando la Figura 1. (1) Il fascio di neutroni prodotto dalla sorgente (posizione 1) è polarizzato (posizione 2), guidato e trasportato (posizione 3) e arriva all'ingresso dello spettrometro NSE, dove viene ruotato di 90° dal primo pi-mezzo flipper (posizione 4). (2) Il fascio polarizzato (ad esempio, momenti magnetici di neutroni) diventa perpendicolare alle linee del campo magnetico del primo magnete (prima zona di precessione, posizione 5) e inizia a precedere. (3) Alla fine del magnete, gli spin dei neutroni accumulano un certo angolo di precessione proporzionale all'intensità del campo magnetico e al tempo di volo trascorso all'interno (fondamentalmente inversamente proporzionale alla velocità del neutrone). Le singole velocità dei neutroni sono codificate all'interno del loro angolo di precessione alla fine della prima zona di precessione. (4) Vicino alla posizione del campione, il pi-flipper (posizione 6) inverte l'orientamento dello spin di 180°, cambiando il segno dell'angolo di precessione. (5) I neutroni interagiscono con le molecole del campione (posizione 7) e si disperdono. (6) I neutroni sparsi entrano e precedono nella seconda zona di precessione (posizione 8) ma diventano orientati inversamente. (7) Un'altra pinna pi-mezza (posizione 9) viene utilizzata per ruotare l'orientamento dello spin dalla direzione perpendicolare a quella orizzontale. Questo fermerà la precessione, traducendo l'angolo di precessione φ in polarizzazione proporzionale a cos(φ). (8) L'analizzatore (posizione 10) seleziona i neutroni in base a un orientamento. Se l'interazione con il campione è elastica, la velocità del neutrone non cambierà. I neutroni trascorreranno una quantità identica di tempo volando nella prima e nella seconda zona di precessione e gli angoli di precessione accumulati saranno completamente recuperati. La polarizzazione completa viene ripristinata sul rivelatore (posizione 11) come eco della polarizzazione originale (cioè spin-echo). (9) Tuttavia, in NSE, lo scattering è quasi elastico, quindi un piccolo scambio di energia tra neutroni e molecole campione porta a diverse velocità di neutroni dopo la dispersione da parte del campione. A causa delle diverse velocità, i neutroni trascorreranno un ulteriore tempo volando attraverso la seconda zona di precessione e non avranno recuperato correttamente il loro angolo di precessione. Una polarizzazione parziale viene recuperata sul rivelatore e la perdita di polarizzazione dovuta al rilassamento dello spin è proporzionale alla trasformata cos-Fourier della funzione spettrale S(Q, ω), alla funzione di scattering intermedia F(Q, t). (10) Il parametro temporale della funzione F(Q, t) è proporzionale all'intensità del campo magnetico di precessione. La scansione della perdita di polarizzazione in funzione dell'intensità del campo magnetico produce, quindi, una funzione di rilassamento che dipende dai processi dinamici all'interno del campione.

Figura 1: Fotografia dello spettrometro NSE a SNS (SNS-NSE) e schema del percorso di volo dei neutroni con i componenti funzionali più importanti. Da destra a sinistra: 1 = sorgente di neutroni; 2 = choppers-bender-polarizer-sistema otturatore secondario; 3 = guide di trasporto del fascio; 4 = pi/2 flipper per il primo giro di 90°; 5 = prima zona di precessione; 6 = pi flipper per rotazione a 180°; 7 = area del campione e ambiente del campione (qui viene mostrato il crioforno); 8 = seconda zona di precessione; 9 = pi/2 flipper per secondo giro di 90°; 10 = analizzatore; 11 = rilevatore. (Si noti che porzioni di 3, così come 2 e 1, sono situate dietro la parete blu all'interno della schermatura; gli elicotteri sono sostituiti da un selettore di velocità per NSE basato su reattore). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

Il presente lavoro caratterizza due proteine: una proteina anticorpale umana regolare IgG e l'MBP intrinsecamente disordinata. La forma liofilizzata delle proteine è stata ottenuta da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali).

1. Preparazione del campione proteico

1. Preparare un tampone da 50 mM di fosfato di sodio + 0,1 M naCl pesando e sciogliendo i rispettivi reagenti solidi in acqua pesante (D₂O) (vedi Tabella dei materiali). Questo è il solvente tampone deuterato per IgG.
   1. Regolare il pH della soluzione tampone a 6,6.
2. Preparare un tampone di fosfato di sodio da 20 mM + urea da 6 M pesando e sciogliendo i rispettivi componenti solidi in acqua pesante (D₂O). Questo è il solvente tampone deuterato per MBP.
   1. Regolare il pH della soluzione tampone a 4,7.
3. Filtrare i solventi tampone utilizzando filtri di dimensioni dei pori da 0,2 μm (vedere Tabella dei materiali).
4. Pesare e sciogliere le polveri liofilizzate proteiche purificate nei solventi deuterati per le rispettive proteine (Fasi 1.1.-1.2.) ad alta concentrazione proteica (~50 mg/ml).
5. Caricare la soluzione proteica in cestelli dializzati con membrane di dialisi di 3,5 K MWCO e dializzare contro il tampone filtrato per 24 ore a 10 °C per MBP e 25 °C per IgG (vedi Tabella dei materiali) scuotendo leggermente i tubi per creare un gradiente di diffusione.
6. Diluire la soluzione proteica utilizzando il tampone di dialisi in una serie di concentrazioni: 1, 2, 5, 10 e 50 mg/ml.
7. Determinare le concentrazioni esatte utilizzando uno spettrofotometro Nanodrop (vedere Tabella dei materiali).

2. Caratterizzazione preliminare del campione mediante diffusione dinamica della luce (DLS)

1. Caricare 80 μL di ciascuna soluzione proteica della serie di concentrazioni preparata sopra (Fase 1.6.) nella cella monouso DLS (vedere Tabella dei materiali) e determinare i coefficienti di diffusione, con una media di oltre 10 acquisizioni.
2. Tracciare i coefficienti di diffusione traslazionale in funzione della concentrazione proteica ed estrapolare a concentrazione zero.
3. Caricare ogni soluzione proteica della serie di concentrazioni nei tubi capillari di un viscosimetro (vedere Tabella dei materiali) e misurare la viscosità dinamica.
4. Tracciare le viscosità dinamiche misurate in funzione della concentrazione proteica ed estrapolare a concentrazione zero.
   NOTA: L'estrapolazione della diffusione dls a concentrazione zero produce il valore della diffusione traslazionale per una singola proteina. L'estrapolazione della viscosità dinamica a concentrazione zero deve produrre il valore di viscosità dinamica misurato sperimentalmente per la soluzione tampone.

3. Raccolta di scattering a piccolo angolo (neutroni o raggi X)

1. Misurare lo scattering neutronico a piccolo angolo (SANS) e/o lo scattering a raggi X a piccolo angolo (SAXS) (vedere Tabella dei materiali) su quattro concentrazioni proteiche, preferibilmente 2 mg/mL, 5 mg/mL, 10 mg/mL e 50 mg/mL.
2. Normalizzare gli spettri SANS e SAXS in base alla concentrazione proteica.
3. Adatta il fattore di forma proteico P(Q) agli spettri SANS e SAXS utilizzando l'ottimizzazione dell'insieme³¹ e/o il software SasView³² .
4. Calcola il fattore di struttura S(Q, c) dividendo il segnale SANS e SAXS con P(Q) per ogni concentrazione.
   NOTA: I lettori interessati a misurare e interpretare i dati di scattering a piccolo angolo come supporto per le misurazioni NSE sono invitati a consultare accuratamente i riferimenti 23,28,31,32,33.

4. Misurazione delle NSE

1. Impostare l'esperimento e montare il campione seguendo i passaggi seguenti.
   1. Selezionare lo spessore della cella per il carico del campione in base alla concentrazione della soluzione proteica, alla temperatura necessaria per la misurazione e alla quantità di soluzione disponibile.
      NOTA: Il presente studio ha utilizzato contenitori di quarzo trasparente caricatore dall'alto di 40 mm x 30 mm x 4 mm.
   2. Pulire ripetutamente la cella, alternando detersivo per piatti privo di fosfati (vedi Tabella dei materiali), acqua deionizzata ed etanolo al 70%.
   3. Asciugare la cella nel forno a convezione; non superare gli 80 °C per le celle al quarzo.
   4. Caricare 4 ml di soluzione proteica nella cellula e chiudere con tappi. Utilizzare un film di cera o qualsiasi sigillante (vedere Tabella dei materiali) per sigillare le celle del campione.
      NOTA: Nel presente studio, sono stati utilizzati 4,8 mL di soluzione a ~50 mg/mL per ottenere un'intensità di dispersione sufficiente.
   5. Caricare 4 mL di tampone per dialisi in un contenitore identico a quello del campione proteico e del sigillo.
   6. Trasportare i campioni alla beamline, chiudere l'otturatore ed entrare nell'area³⁴ della grotta dell'involucro dello spettrometro.
   7. Montare la cella campione sul portacampioni in alluminio stringendo le viti e le piastre di tenuta (Figura 2, pannello di sinistra).
      NOTA: è possibile montare due celle campione contemporaneamente, dato che è necessario lo stesso protocollo di misurazione per tutti i campioni.
   8. Montare il campione di grafite e/o il campione di polvere di Al₂O₃ caricati in un contenitore identico al campione proteico. Questi sono gli standard forniti dal supporto della beamline SNS-NSE.
   9. Posizionare il portacampioni facendolo scorrere delicatamente nella lattina del sistema di forzatura della temperatura (TFS, vedere Tabella dei materiali).
      NOTA: TFS è l'ambiente di campionamento più utilizzato presso SNS-NSE e pompa aria secca nel contenitore del campione per raggiungere la temperatura desiderata (Figura 2, pannelli centrale e destro).
   10. Chiudere il coperchio TFS e impostare la temperatura sul valore desiderato accedendo alla schermata interattiva del TFS.
   11. Montare la telecamera a neutroni (vedi Tabella dei materiali) per l'allineamento dei campioni al fascio.
   12. Spazzare l'involucro dello strumento, evacuare, chiudere le porte e aprire l'otturatore a fascio.
       NOTA: le celle campione sono fornite dal supporto della beamline SNS-NSE. Per le celle campione disponibili e la libreria dell'ambiente di esempio, fare riferimento alla pagina Web della beamline SNS-NSE ^7,35.
2. Raccogli i dati NSE seguendo i passaggi seguenti.
   1. Allineare il campione nel fascio di neutroni usando la telecamera a neutroni e le quattro aperture di campionamento indipendenti.
   2. Aprire il software di raccolta dati SNS-NSE³⁶ e raccogliere statistiche di esempio eseguendo scansioni di diffrazione per gli angoli di diffusione e la lunghezza d'onda desiderati.
   3. Impostare i parametri di misura in base alle statistiche raccolte per ciascun campione modificando le macro di misura fornite dallo scienziato dello strumento di assistenza.
   4. Avviare la scansione digitando il nome del protocollo nel prompt dei comandi e acquisire echi per l'esempio.
   5. Avviare la scansione e acquisire echi anche per il riferimento elastico e il solvente tamponato. Eseguire il funzionamento intermittente dell'otturatore del fascio per il cambio del campione.

Figura 2: Sistema di misurazione NSE. Pannello di sinistra: campioni di soluzione proteica in contenitore di quarzo montato con viti e piastre sul portacampioni in alluminio (Al). Il portacampioni Al offre la possibilità di montare due campioni contemporaneamente all'interno dell'ambiente campione. Pannello centrale: il campione del sistema di forzatura della temperatura (TFS) può essere montato nella fase del campione, la finestra del fascio di neutroni è sulla destra, mentre la telecamera a neutroni utilizzata per l'allineamento è visibile sul lato sinistro. Pannello di destra: posizionare il portacampioni con due campioni nel campione può funzionare con finestre in silicio (Si). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. Riduzione dei dati NSE

NOTA: SNS-NSE è dotato di un software dedicato denominato DrSpine (riduzione dei dati per spin-echo)^37,38 disponibile sul cluster di analisi remota ORNL Neutron Sciences, una guida rapida per l'utente e supporto di aiuto integrato.

1. Accedere a Neutron Sciences Remote Analysis Cluster (vedere Tabella dei materiali) con le credenziali utente ORNL e premere il pulsante Avvia sessione .
2. Configurare il software di riduzione dei dati seguendo i passaggi seguenti.
   1. Nella directory utente, apri una finestra del terminale e digita: source/SNS/software/nse/etc/setup_nse.sh.
   2. Quindi, digitare: drspine_create_env.sh.
3. Creare una cartella per la riduzione dei dati nella home directory e copiare gli script e le macro forniti dalla directory condivisa.
4. Modificare, rinominare e salvare la macro di riduzione fornita di conseguenza.
5. Digitare drspine al prompt dei comandi e premere invio per avviare l'ambiente di riduzione del software.
6. Digitare "il nome della macro di riduzione" modificato al passaggio 5.4. nel prompt dei comandi all'interno dell'ambiente software e premere Invio.

6. Raccordo dati NSE

1. Modificare lo script python "stapler-drspine.py", fornito dallo scienziato dello strumento di assistenza, con i nomi dei dati del file ridotti.
   NOTA: Lo script python è disponibile gratuitamente per gli utenti dello strumento.
2. Modificare la funzione per adattarla alla libreria fornita.
3. Digitare il nome dello script modificato "stapler-drspine.py" nel prompt dei comandi e premere INVIO per leggere, adattare e tracciare dati NSE ridotti.
   NOTA: Lo Scienziato dello Strumento fornirà un modello per la macro di riduzione e lo script python "stapler-drspine.py" in grado di leggere e adattare i dati ridotti NSE. I dati NSE finali ridotti sono in formato ASCII e possono essere letti da vari software preferiti.

Risultati

Le proteine IgG provenienti da proteine MBP sieriche e bovine umane sono state ricostituite ad alte concentrazioni (~50 mg/mL) in tamponi D₂O-base. Poiché le proteine sono state disciolte in alte concentrazioni, le soluzioni ottenute sono state soluzioni proteiche affollate. Le dinamiche studiate con NSE soffrono dell'ambiente affollato in cui risiedono le proteine (interazioni fattoriali di struttura ed effetti idrodinamici)^5,28,39

Discussione

La spettroscopia NSE offre una visione unica e dettagliata della dinamica delle proteine, che altre tecniche spettroscopiche non possono produrre. Le misurazioni su una scala temporale estesa forniscono osservazioni della diffusione traslazionale e rotazionale delle proteine, come presentato qui. La dinamica segmentale e altre oscillazioni interne si rivelano come un forte decadimento della funzione di scattering coerente S(Q, t) su scala temporale breve e sono ben separate dai processi generali di rilassamento ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine MBP protein solution	Sigma-Aldrich	M1891	lyophilized powder reconstituted in  D2O
D2O - heavy water	Sigma-Aldrich	Product No. 151882	liquid
Dionized water	in house	-	for washing / cleanning cells
DLS instrument	Zetasizer Nano ZS, FZ-Jülich	-	dynamic light scattering instrument
Elastic scattering standards	SNS-NSE, ORNL	-	Al2O3  and Graphite powders
Ethanol	Sigma-Aldrich	65350-M	70% ethanol for cleaning cells
IgG protein solution	Sigma-Aldrich	I4506	lyophilized powder reconstituted in  D2O
KWS-2 instrument	JCNS outstation at the MLZ,  Garching, Germany	-	small angle neutron instrument
Liquinox dish detergent	Alconox	-	Phosphate-free liquid lab glassware cleaner
Na2HPO4·7H2O	Sigma-Aldrich	Product No.S9390	disodium phosphate heptahydrate salt
NaCl	Sigma-Aldrich	Product No.S9888	sodium chloride salt
NaH2PO4·H2O	Sigma-Aldrich	Product No. S9638	monosodium phosphate monohydrate salt
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Scientific	Catalog number: ND-2000	NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer
Neutron alignment camera	NeutronOptics, Grenoble	NOG210222	100 x 100 mm camera with Sony IMX249 CMOS sensor
Parafilm M - wax parafilm	Bemis	Parafilm M - 5259-04LC PM996	all-purpose laboratory film in cardboard dispenser
Phoenix-J-NSE Spectrometer	JCNS outstation at the MLZ,  Garching, Germany	-	neutron spectrometer
SasView	https://www.sasview.org/
SAXSpace, Anton Paar instrument	FZ-Jülich	-	small angle x-ray instrument
Slide-A-Lyzer dialysis membranes	Thermo Scientific	88400-88405	Slide-A-Lyzer mini dialysis devices tubes of 3.5 K MWCO
SNS Remote Analysis Cluster	Neutron Science Remote Analysis (sns.gov)	https://analysis.sns.gov
SNS-NSE spectrometer	ORNL, Oak Ridge, TN, USA	-	neutron spectrometer
Sterile syringe filters	VWR	N.A. PN:28145-501	0.2 µm pore size filters
Temperature Forcing System (TFS)	SP Scientific	Part Number 100004055	sample environment equipment
Urea -d4	Sigma-Aldrich	Product No. 176087	deuterated Urea salt
Viscometer	FZ-Jülich	-	falling ball viscometer