Cristallizzazione e determinazione strutturale di un enzima:complesso di substrati mediante cristallografia seriale in un chip microfluidico versatile

Riepilogo

Viene descritto un dispositivo microfluidico versatile che consente la cristallizzazione di un enzima utilizzando il metodo di contro-diffusione, l'introduzione di un substrato nei cristalli mediante ammollo e la determinazione della struttura 3D del complesso enzima:substrato mediante un'analisi seriale dei cristalli all'interno del chip a temperatura ambiente.

Abstract

La preparazione di cristalli ben diffratti e la loro manipolazione prima della loro analisi a raggi X sono due fasi critiche degli studi biocristalografici. Descriviamo un versatile chip microfluidico che consente la produzione di cristalli con l'efficiente metodo di contro-diffusione. L'ambiente privo di convezione fornito dai canali microfluidici è ideale per la crescita del cristallo e utile per diffondere un substrato nel sito attivo dell'enzima cristallino. Qui abbiamo applicato questo approccio all'enzima che aggiunge il CCA del batterio psicrofilo Planococcus halocryophilus nell'esempio presentato. Dopo la cristallizzazione e la diffusione/ammollo del substrato, la struttura cristallina del complesso enzima:substrato è stata determinata a temperatura ambiente dalla cristallografia seriale e dall'analisi di più cristalli direttamente all'interno del chip. L'intera procedura preserva le proprietà di diffrazione autentiche dei campioni perché non richiede alcuna manipolazione del cristallo.

Introduzione

La cristallografia è un metodo per decifrare l'architettura 3D delle macromolecole biologiche. Quest'ultimo è importante per capire come un enzima seleziona ed elabora i suoi substrati. La determinazione di una struttura cristallina richiede la cristallizzazione della macromolecola bersaglio e il condizionamento dei cristalli per la loro analisi mediante diffrazione a raggi X¹. Sia la preparazione che la movimentazione dei cristalli sono passaggi cruciali ma delicati che possono influire sulla qualità cristallina e sulle proprietà di diffrazione e, quindi, sulla risoluzione (cioè la precisione) della struttura 3D risultante. Per facilitare la preparazione di cristalli di alta qualità ed eliminare la maneggevolezza non necessaria per preservarne le proprietà di diffrazione, abbiamo progettato un dispositivo microfluidico intuitivo e versatile chiamato ChipX^2,3,4.

In questo articolo, dimostreremo come caricare la soluzione proteica nei canali ChipX utilizzando materiale di laboratorio convenzionale per preparare i cristalli mediante contro-diffusione. Questo metodo di cristallizzazione fornisce un efficace screening della supersaturazione e delle potenziali condizioni di nucleazione lungo i canali microfluidici contenenti la soluzione enzimatica dovuta al gradiente di concentrazione generato dalla diffusione dell'agente^{cristallizzante 5,6}.

La configurazione del chip è semplice, utilizza solo pipette di laboratorio standard e non richiede apparecchiature costose. Quando i cristalli sono cresciuti in ChipX, i ligandi dell'enzima possono essere introdotti per diffusione. I dati di diffrazione vengono quindi raccolti a temperatura ambiente su una serie di cristalli contenuti nei canali del chip utilizzando una sorgente di raggi X di sincrotrone. Lo studio strutturale qui descritto ha portato alla determinazione delle strutture di un enzima di maturazione del tRNA nella sua forma apo e in complesso con un analogo del suo substrato CTP introdotto dall'ammollo. Questa proteina chiamata enzima che aggiunge CCA polimerizza la coda trinucleotide CCA all'estremità 3 ' delle tRNA. Il confronto delle due immagini 3D ottenute per cristallografia seriale rivela i cambiamenti conformazionali locali legati al legame del ligando in condizioni più fisiologiche di quelle utilizzate nella criocristografia. Il protocollo descritto in questo video è generalmente applicabile a qualsiasi biomolecola, che si tratta di una proteina, di un acido nucleico o di un complesso multicomponente.

Protocollo

1. Impostazione di saggi di cristallizzazione in ChipX

NOTA: Il dispositivo microfluidico ChipX può essere ottenuto dagli autori. Una descrizione del chip è fornita nella figura 1. Le soluzioni contenenti l'agente cristallino (o cristallizzante) utilizzato per innescare la cristallizzazione possono essere di origine commerciale o preparate dallo sperimentatore.

1. Caricamento del campione di biomolecole
   NOTA: Il volume del campione effettivamente richiesto per eseguire un singolo saggio di contro-diffusione nella sezione retta di ogni canale di ChipX è di 300 nL. Tuttavia per comodità si consiglia di caricare 5 μL per riempire completamente gli otto canali tenendo conto della lunghezza variabile della loro sezione curva e dei volumi morti di ingresso.
   1. Pipetta 5 μL di soluzioni enzimatica utilizzando pipetta e punta standard da 10 μL.
   2. Introdurre la punta verticalmente nell'ingresso del campione e iniettare la soluzione fino a quando gli otto canali non vengono riempiti fino all'estremità opposta (ingresso del serbatoio cristallino).
   3. Iniettare 1 μL di olio di paraffina nell'ingresso del campione per scollegare i canali l'uno dall'altro.
   4. Recuperare la soluzione extra nel serbatoio cristallino all'estremità di ogni canale utilizzando una pipetta standard da 10 μL.
   5. Sigillare l'ingresso del campione con un pezzo di nastro da 1 cm x 1 cm.
2. Caricamento delle soluzioni di cristallizzazione
   1. Pipetta 5 μL di soluzione di cristallizzazione utilizzando pipetta e punta standard da 10 μL. Il volume del serbatoio è di 10 μL, ma il caricamento di solo la metà evita il traboccamento durante la sigillatura con nastro adesivo e facilita l'ulteriore aggiunta di ligando per gli esperimenti di ammollo. Se le condizioni iniziali di cristallizzazione sono state ottenute per diffusione del vapore, aumentare la concentrazione cristallina di un fattore 1,5 - 2. Le soluzioni possono essere diverse in ogni serbatoio (nel caso presentato, 1 M fosfato di idrogeno diammonio, acetato di sodio da 100 mM, pH 4,5 è stato utilizzato in tutto).
   2. Orientare la punta del tubo verso l'ingresso del canale nella parte a forma di imbuto del serbatoio per evitare la formazione di una bolla d'aria al momento della deposizione della soluzione. Impedirebbe il contatto tra le due soluzioni e la diffusione cristallina nel canale.
   3. Iniettare la soluzione cristallina nel serbatoio.
   4. Sigillare i serbatoi con un pezzo di nastro da 2,5 cm x 1 cm.
   5. Incubare il truciolo a 20 °C (la temperatura può essere regolata a seconda del bersaglio, in genere tra 4 e 37 °C ⁴).

2. Etichettatura proteica con carboxyrhodamine per il rilevamento della fluorescenza

NOTA: questo passaggio è facoltativo. Deve essere eseguito prima del caricamento del campione per facilitare il rilevamento dei cristalli nel chip utilizzando la fluorescenza. Il metodo dettagliato di etichettatura fluorescente in traccia è stato descritto da Pusey e dai colleghi^7. Tutti i passaggi vengono eseguiti a temperatura ambiente.

1. Sciogliere 5 mg di polvere di estere carboxyrhodamina in 1 mL dimetil-formamide anidro, dividere la soluzione in aliquote da 0,6 μL da conservare a -20 °C.
2. Preparare una soluzione stock di na-borato da 1 M pH 8,75.
3. Diluire il titolo per preparare il tampone di reazione a 0,05 M Na-borato pH 8,75.
4. Risciacquare una colonna di desalinizzazione (7 kDa MWCO, 0,5 mL) con 800 μL di tampone di reazione.
5. Centrifugare la colonna per 1 minuto a 1400 x g, rimuovere il filtrato.
6. Ripetere questa operazione due volte (passaggi 2.4-2.5) per lavare la colonna.
7. Depositare 80 μL di proteine nel suo tampone di stoccaggio sulla colonna (la proteina può essere diluita fino a 1 mg /mL per aumentare il volume se necessario).
8. Centrifugare la colonna per 1 min a 1400 x g. Questo passaggio ha lo scopo di trasferire la proteina dal suo buffer di stoccaggio al tampone di reazione.
9. Recuperare il flusso attraverso (contenente la proteina nel tampone di reazione) e mescolarlo con 0,6 μL di soluzione di carboxyrhodamina.
10. Incubare 5 minuti a temperatura ambiente.
11. Nel frattempo, sciacquare la colonna 3 x con il tampone di stoccaggio, centrifugare la colonna per 1 min a 1400 x g e scartare il filtrato.
12. Depositare la soluzione di reazione sulla colonna.
13. Centrifugare la colonna per 1 min a 1400 x g e recuperare il flusso (cioè la soluzione di proteine etichettate nel suo tampone di stoccaggio).
14. Integrare la soluzione proteica stock con lo 0,1-1 % (w/w) di proteine etichettate.
15. Impostare i test di cristallizzazione ChipX come descritto nella sezione 1.
16. Verificare la presenza di cristalli proteici nei test eccitanti la sonda fluorescente con una sorgente luminosa a lunghezza d'onda di 520 nm.

3. Osservazione del cristallo

NOTA: Il dispositivo ChipX può essere maneggiato senza particolari cure, anche con cristalli all'interno, tranne se la temperatura deve essere controllata.

1. Utilizzare qualsiasi stereomicroscopio per verificare l'esito dei test di cristallizzazione in ChipX. Il suo ingombro ha le dimensioni standard delle diapositive del microscopio ed è compatibile con qualsiasi sistema e porta scorrevole.
2. Controllare il contenuto dei canali microfluidici a partire dal serbatoio in cui la concentrazione cristallina è la più alta all'ingresso del campione dove la concentrazione cristallina è la più bassa. Il materiale ChipX è trasparente alla luce visibile, compatibile con l'uso di polarizzatori, nonché con l'illuminazione UV per l'identificazione del cristallo proteico mediante fluorescenza del triptofano^{intrinseco 8.}
3. Registrare le posizioni dei cristalli utilizzando le etichette goffrate lungo i canali o contrassegnare le posizioni dei cristalli con un marcatore permanente disegnando punti di colore accanto ad essi sulla superficie del truciolo.

4. Cristallo in ammollo con ligandi

NOTA: questa procedura è facoltativa. Viene utilizzato per introdurre ligandi, substrati enzimatici o atomi pesanti nei cristalli e deve essere effettuato almeno 24-48 ore prima dell'analisi a raggi X per consentire la diffusione del composto lungo i canali e nei cristalli.

1. Rimuovere delicatamente il nastro di tenuta dai serbatoi.
2. Aggiungere fino a 5 μL di soluzione di ligando in uno o più serbatoi utilizzando un micropipeto da 10 μL (nell'esempio, sono stati aggiunti 3 μL di 10 mM di citidina-5'-[(α,β)-metilleno] trifosfato (CMPcPP) per raggiungere una concentrazione finale di 3,75 mM). CMPcPP è un analogo non idrolabile del CTP, un substrato naturale dell'enzima.
3. Sigillare i serbatoi con un pezzo di nastro da 2,5 cm x 1 cm.
4. Incubare il chip a temperatura controllata per 24-48 ore per consentire la diffusione del ligando lungo i canali del chip.

5. Analisi dei cristalli mediante cristallografia seriale

NOTA: Questa parte del protocollo deve essere adattata a seconda della configurazione della linea di fascio e delle proprietà di diffrazione dei cristalli. Vengono fornite solo indicazioni generali per l'analisi cristallografica basata su esperimenti eseguiti sulla linea di fascio X06DA (SLS, Villigen, Svizzera).

1. Montaggio ChipX sul goniometro beamline
   NOTA: Il file per la stampa 3D del supporto ChipX è fornito in ref⁴.
   1. Spegnere il crio-getto della linea di fascio. L'analisi qui viene eseguita a temperatura ambiente.
   2. Montare il ChipX su un supporto dedicato con il canale contenente i cristalli da analizzare posizionati al centro del supporto. Il supporto ChipX⁴ non richiede alcuna vite o parte aggiuntiva, in quanto è stato progettato per fornire una vestibilità perfetta per ChipX.
   3. Attaccare il supporto al goniometro.
2. Raccolta dati
   1. Orientare lo strato più spesso (strato superiore, Figura 1) di ChipX (in questo orientamento le etichette lungo i canali sono leggibili direttamente utilizzando la telecamera di centraggio della linea di fascio), verso il fascio diretto e la faccia più sottile dietro il cristallo per ridurre al minimo l'attenuazione del segnale diffratta come descritto nell'arbitro³.
   2. Per evitare collisioni di ChipX con il materiale circostante (beamstop, collimatore), limitare i movimenti del goniometro nell'intervallo ±30° (0° corrispondente ai canali perpendicolari al fascio di raggi X).
   3. Trova la posizione dei cristalli con l'aiuto delle etichette goffrate lungo i canali.
   4. Selezionare una posizione di cristallo.
   5. Centrare il cristallo mediante griglia standard a bassa dose/screening raster o procedura con 1 clic (il video mostra un esempio di screening della griglia).
   6. Raccogliere dati di diffrazione nell'intervallo -30° / +30°.
   7. Riavviare la procedura ai passaggi 5.2.4-5.2.6 su un altro cristallo nello stesso canale dopo la traduzione del chip.
   8. Riallineare manualmente un altro canale ChipX al centro del supporto e portare avanti la raccolta dei dati sui cristalli presenti in questo canale.
   9. Utilizzare pacchetti e procedure cristallografiche standard per elaborare e unire i dati, quindi per risolvere e perfezionare la struttura.

Risultati

Il chip microfluidico qui descritto è stato progettato per consentire una facile configurazione dei saggi di cristallizzazione e l'analisi dei cristalli a temperatura ambiente. La procedura sopra descritta e nel video è stata applicata nel quadro della caratterizzazione strutturale dell'enzima che aggiunge cca dal batterio Planococcus halocryophilus adattato a freddo. Questo enzima appartiene a una famiglia essenziale della polimerasi che catalizza l'aggiunta sequenziale della sequenza CCA 3' su tRNA utilizzando CTP e ATP^9,10.

Il chip è stato utilizzato per la prima volta per preparare cristalli dell'enzima per l'analisi strutturale con il metodo della contro-diffusione. A tal fine, la soluzione enzimatica è stata caricata negli otto canali microfluidici (camere di cristallizzazione) da una singola iniezione nell'ingresso del campione del chip (cfr. figura 1). L'enzima è stato utilizzato a 5,5 mg/mL nel suo tampone di stoccaggio contenente 20 mM Tris/HCl pH 7,5, 200 mM NaCl e 5 mM MgCl₂. Questo passaggio è stato eseguito manualmente con un micropipetto standard da 10 μL. Le soluzioni di cristallizzazione (100 mM di acetato di sodio pH 4,5,1 M fosfato di idrogeno diammonio) sono state quindi depositate nei serbatoi all'altra estremità dei canali.

La procedura di caricamento è semplice e non richiede più di cinque minuti (Figura 2). Il cristallizzatore si diffonde quindi nei canali, crea un gradiente di concentrazione che innesca nucleazione cristallina e crescita. Questo gradiente si evolve dinamicamente ed esplora un continuum di stati di supersaturazione^{5,6 fino} a raggiungere un equilibrio di concentrazione cristallina tra i canali e il serbatoio. I test di cristallizzazione sono tipicamente controllati sotto il micoscopio per un periodo di 2 - 4 settimane per tenere traccia della crescita dei cristalli. Cristalli bipiracidi dell'enzima che aggiunge il CCA sono apparsi su tutti i canali dopo alcuni giorni di incubazione a 20 °C (Figura 3). L'etichettatura fluorescente^{opzionale 7} della proteina facilita notevolmente l'identificazione dei cristalli proteici e la loro discriminazione dai cristalli di sale (Figura 4).

Abbiamo sfruttato l'ambiente diffusivo nei canali dei chip per fornire un substrato all'enzima che costruisce i cristalli. Nel caso di specie, il CMPcPP, un analogo CTP, è stato aggiunto alle soluzioni del serbatoio ad una concentrazione finale di 3,75 mM(figura 5). Questa aggiunta è stata eseguita due giorni prima dell'analisi cristallografica per consentire a CMPcPP di raggiungere e occupare il sito catalitico dell'enzima, come successivamente confermato dalla struttura cristallina (vedi sotto).

Abbiamo prodotto un portachip (Figura 6) in acido polilattico utilizzando una stampante 3D. Il supporto consente il montaggio del truciolo sui goniometri utilizzando testine magnetiche standard. Quindi il chip può essere facilmente posizionato e tradotto nel fascio di raggi X per portare i cristalli in posizione di diffrazione. La strategia di raccolta dei dati deve essere adattata a seconda delle caratteristiche della linea di fascio e delle proprietà cristalline. Nel caso dell'enzima che aggiunge cca, i dati sono stati raccolti rispettivamente alle linee di fascio X06DA e X10SA, Swiss Light Source (SLS), con una lunghezza d'onda a raggi X di 1,0 Å e Pilatus 2M-F e 6M pixel detector. 30-60° di rotazione sono stati raccolti su ciascun cristallo a temperatura ambiente con immagini di esposizione di 0,1° o 0,2° e 0,1 s (cfr. tabella 1). I set di dati parziali sono stati elaborati individualmente e tagliati quando la risoluzione dei modelli di diffrazione ha iniziato a decadere a causa di danni da radiazioni (rilevati dalla diminuzione del rapporto segnale-rumore e CC_1/2e da un aumento dei_mea Rnel guscio ad alta risoluzione). I set di dati completi sono stati ricostituiti unendo i dati provenienti da 5 cristalli (tabella 1). Le strutture cristalline sono state derivate mediante sostituzione molecolare utilizzando pacchetti cristallografici standard e procedure per^{l'elaborazione dei dati 11} e^{perfezionamento 12.} Il confronto delle strutture dell'enzima e del suo complesso con CMPcPP rivela l'adattamento conformazionale locale che accompagna il legame del substrato nel sito attivo dell'enzima che aggiunge CCA (Figura 7).

Figura 1: Progettazione chipx. Il chip è costituito da uno strato superiore in COC (spessore: 1 mm) in cui sono impressi otto canali e serbatoi microfluidici. L'intero chip è sigillato con uno strato di COC (spessore: 0,1 mm). Tutti i canali sono collegati ad una singola insenatura sul lato sinistro per l'iniezione simultanea del campione e a singoli serbatoi sul lato destro in cui vengono depositate soluzioni di cristallizzazione. I canali, che costituiscono le attuali camere di cristallizzazione del chip, sono lunghi 4 cm e hanno una sezione trasversale di 80 μm x 80 μm. ChipX ha le dimensioni di un vetrino da microscopio standard (7,5 cm x 2,5 cm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Impostazione di saggi di cristallizzazione in ChipX. 1) Depositare 5-6 μL di soluzioni enzimatici utilizzando pipetta e punta standard da 10 μL. 2) Introdurre la punta verticalmente nell'ingresso del campione e iniettare la soluzione negli otto canali. 3) Pipetta 1 μL di olio di paraffina. 4) Introdurre la punta verticalmente nell'ingresso del campione e iniettare l'olio per scollegare i canali l'uno dall'altro. 5) Sigillare l'ingresso con un pezzo di nastro adesivo. 6) Pipet 5 μL di soluzione di cristallizzazione utilizzando pipetta e punta standard da 10 μL. Le soluzioni possono essere diverse in ogni serbatoio (ad esempio, da un kit di screening). 7) Orientare la punta della pipetta verso l'ingresso del canale nella parte a forma di imbuto del serbatoio (per evitare la formazione di una bolla d'aria al momento della deposizione della soluzione) e iniettare la soluzione cristallina nel serbatoio. 8) Sigillare i serbatoi con un pezzo di nastro adesivo e incubare il truciolo a temperatura controllata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Cristalli di enzima che aggiunge cca coltivati per contro-diffusione nei canali microfluidici di ChipX. La barra di scala è di 0,1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Procedura di ammollo del cristallo. 1) Rimuovere delicatamente il nastro dai serbatoi. 2) Depositare fino a 5 μL di soluzione ligando utilizzando un micropipeto da 10 μL. 3) Aggiungere il ligando a uno o più serbatoi. 4) Sigillare nuovamente i serbatoi con un pezzo di nastro adesivo e incubare il truciolo a temperatura controllata per 24-48 ore prima della raccolta dei dati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: L'etichettatura fluorescente traccia discrimina le proteine (a sinistra) dai cristalli di sale (a destra). La soluzione enzimatica che aggiunge il CCA conteneva lo 0,4 % (w/w) di proteine etichettate con carboxyrhodamina. A destra, i cristalli sono illuminati con una sorgente luminosa a lunghezza d'onda di 520 nm e l'immagine viene scattata con un filtro passa basso a 550 nm (LP550); (insorgenza) struttura dell'estere carboxyrhodamine-succinimidil. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Disegno (a sinistra) del supporto ChipX e (a destra) ChipX montato sul goniometro della linea di fascio X06DA a SLS (Villigen, Svizzera) per l'analisi seriale dei cristalli. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.

Figura 7: Confronto del sito attivo enzimatico con aggiunta di CCA nella forma apo (in rosa) e nel complesso con un analogo CTP (in verde). Sebbene la conformazione complessiva dell'enzima non sia influenzata, il legame del ligando CMPcPP è accompagnato da una leggera riorganizzazione delle catene laterali nel sito attivo. La mappa didensità elettronica 2 Fo-Fc (in blu) è sagomata a 1,2 sigma. La mappa di densità elettronica della differenza sagomata a 4 sigma (in verde) conferma la presenza del ligando nel sito attivo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Campione cristallizzato	Enzima che aggiunge CCA	Enzima che aggiunge CCA + CMPcPP
Analisi dei cristalli
Beamline a raggi X	SLS - X06DA	SLS – X10SA
Lunghezza d'onda (Å)	1.000	1.000
Temperatura (K)	293	293
Rivelatore	Pilatus 2M-F	Pilatus 6M
Distanza rivelatore di cristalli (mm)	300	400
Cristalli raccolti	6	14
Cristalli selezionati	5	5
Intervallo di rotazione per immagine (°)	0.1	0.2
Tempo di esposizione per immagine (s)	0.1	0.1
No. delle immagini selezionate	1000	540
Intervallo di rotazione totale (°)	100	108
Gruppo spaziale	P43212	P43212
a, c (Å)	71.5, 293.8	71.4, 293.6
Mosaicità media (°)	0.04	0.04
Intervallo di risoluzione (Å)	46 – 2.54 (2.6 – 2.54)	48 – 2.3 (2.4 – 2.3)
N. totale di riflessioni	176105 (9374)	232642 (32937)
No. di riflessioni uniche	23922 (1598)	34862 (4066)
Completezza (%)	90.6 (84.6)	99.5 (100.0)
Ridondanza	7.5 (6.0)	6.7 (8.1)
	8.1 (1.3)	6.9 (0.7)
Rmea (%) §	18.6 (126.0)	18.0 (231.2)
CC1/2 (%) £	98.7 (55.0)	98.7 (46.9)
Fattore B complessivo della trama di Wilson (Å2)	57.4	60.6
Raffinatezza cristallografica
No. di riflessioni, working set /set di test	23583 / 1180	34840 / 3405
Rcryst finale (%) / Rlibero (%)	18.8 / 21.4	20.0 / 22.9
No. di atomi non H: complessivo / proteina / ligando / solvente	2998 / 2989 / 0 / 9	3057 / 2989 / 29 / 10
Deviazioni R.m.s. per obbligazioni (Å) / angoli (°)	0.009 / 1.23	0.010 / 1.22
Fattori B medi (Å2): complessivo / proteina / ligando / solvente	60.1 / 60.1 / 0 / 52.7	62.5 / 62.6 / 60.1 / 55.5
Trama di Ramachandran: più favorita (%) / consentita (%)	98.1 / 1.9	97.2 /  2.8
ID PDB	6IBP	6Q52

Tabella 1: Statistiche della raccolta e del perfezionamento dei dati

§ Rmeas indipendenti dalla ridondanza = Σ_hkl(N/N-1)^1/2Σ_i | I_i(hkl)- (hkl)>| / Σ_hklΣ_i I_i(hkl), dove N è la molteplicità dei dati ¹⁷.

£ I dati con basso nel guscio esterno (<2.0) sono stati inclusi in base al criterio CC1/2 (correlazione tra due metà casuali del set di dati > 50%) come proposto da Karplus & Diederichs ¹⁸.

Discussione

Gli attuali protocolli in biocristallografia prevedono la preparazione di cristalli con metodi come la diffusione del vapore o il lotto^13,14, e il loro trasferimento in un microloop per il crioraffreddamento^{15,16 prima} di eseguire l'analisi di diffrazione in un getto di azoto in condizioni criogeniche. Al contrario, il crioraffreddamento diretto del cristallo non è possibile in ChipX³ e i cristalli non possono essere estratti dal loro canale microfluidico, che può essere visto come limitazioni di questa configurazione. Tuttavia, il protocollo descritto nell'articolo fornisce una tubazione completamente integrata per la determinazione delle strutture cristalline a temperatura ambiente (cioè in condizioni più fisiologiche). Anche se la raccolta dei dati a temperatura ambiente causa un aumento dei danni da^{radiazioni 19}, questo effetto è controbilanciato da un rapido tempo di acquisizione dei dati (un massimo di 60 ° di rotazione viene raccolto su ogni cristallo) e dalla fusione di diversi set di dati parziali. Sia il design ChipX che il materiale sono stati ottimizzati per ridurre la dispersione dello sfondo e l'attenuazione del segnale di diffrazione³e la raccolta dei dati può essere eseguita su cristalli con dimensioni equivalenti alla metà delle dimensioni dei canali (40 μm)⁴.

Per riassumere, i principali vantaggi del protocollo sono i seguenti. I cristalli sono prodotti in un ambiente privo di convezione (canali microfluidici), che è molto favorevole alla crescita di cristalli di alta qualità. Il metodo di contro-diffusione implementato in ChipX è molto efficiente nello screening del panorama della supersaturazione; la diffusione dei cristallizzatori nel canale del chip crea un'onda di concentrazione e supersaturazione che aiuta a determinare le condizioni appropriate di nucleazione e^{crescita 5}. I cristalli non vengono mai maneggiati direttamente, ma vengono analizzati in situ, all'interno del chip, che conserva le loro reali proprietà di diffrazione (cioè, non altera la mosaicità cristallina per interazione fisica o crioraffreddamento)²⁰. L'analisi di diffrazione viene eseguita su una serie di cristalli distribuiti lungo i canali del chip con bassa esposizione alla dose per ridurre al minimo i danni da radiazioni, e un set di dati completo viene assemblato unendo dati parziali della serie. L'ingombro standard e il design semplice di ChipX consentiranno in futuro una completa automazione della raccolta dei dati in situ utilizzando impianti synchrotron o XFEL. Tutte le fasi del protocollo vengono eseguite in ChipX. Dal punto di vista dello sperimentatore, la configurazione del chip è semplice e facile da eseguire con i tubi standard e non richiede alcuna apparecchiatura aggiuntiva. La connessione del canale ad albero nell'ingresso del campione riduce al minimo i volumi morti nel sistema, il che è importante quando si lavora con campioni difficili da purificare o disponibili solo in quantità limitata.

In conclusione, l'approccio lab-on-a-chip implementato in ChipX semplifica e miniaturizza in modo efficiente il processo di cristallizzazione mediante contro-diffusione e determinazione della struttura cristallina, consentendo di passare dal campione alla sua struttura 3D in un unico dispositivo. È ampiamente applicabile e offre una soluzione intuitiva ed economica per le indagini seriali di biocristollography di routine a temperatura ambiente.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axioscope A1 stereomicroscope	Zeiss		Crystal observation  (step 3)
Carboxyrhodamine succinimidyl ester	Invitrogen	C-6157	Protein labeling (step 2)
CMPcPP	Jena Bioscience	NU-438	Crystal soaking (step 4)
Crystal clear sealing tape	Hampton research	HR3-511	ChipX sealing  (step 1)
Parafin oil	Hampton research	HR3-411	ChipX loading  (step 1)
Ultimaker 2 extended+	Ultimaker		3D printer - Representative results
UV light source	Xtal Concepts Gmbh	XtalLight100c	Crystal observation  (step 3)
Zeba spin desalting column 7K MWCO	ThermoFisher Scientific	89882	Protein labeling  (step 2)