הכנת הומוגנטים של שרירי שלד חולדה למדידות חנקות וניטריט

Summary

אנו מציגים פרוטוקולים לשלוש שיטות שונות להומוגניזציה של ארבע קבוצות שרירים שונות של רקמת שריר שלד חולדה כדי למדוד ולהשוות את רמות החנקות והניטריט. יתר על כן, אנו משווים משקלים שונים של דגימות כדי לחקור אם גודל דגימת הרקמה משפיע על תוצאות ההומוגניזציה.

Abstract

יונים חנקתיים (NO₃^-) נחשבו בעבר לתוצרים סופיים אינרטיים של חילוף החומרים של תחמוצת החנקן (NO). עם זאת, מחקרים קודמים הראו כי יונים חנקתיים יכולים להיות מומרים בחזרה ל-NO ביונקים באמצעות מנגנון הפחתה דו-שלבי: ניטרט מופחת לניטריט (NO₂-) בעיקר על ידי חיידקי קומנסל דרך הפה, ואז ניטריט מופחת ^ל-NO על ידי מספר מנגנונים, כולל באמצעות חלבונים המכילים הם או מוליבדן. מסלול חנקתי רדוקטיבי זה תורם לשיפור מסלולי איתות ללא תיווך, במיוחד במערכת הלב וכלי הדם ובמהלך פעילות גופנית. רמות החנקות בגוף לפני ניצול כזה נקבעות על ידי שני מקורות שונים: חמצון NO אנדוגני וצריכת חנקות תזונתית, בעיקר מצמחים. כדי להבהיר את מחזור ה-NO המורכב בנסיבות פיזיולוגיות, בחנו עוד יותר את הדינמיקה של המטבוליטים, יוני החנקות והניטריטים שלו, שהם יציבים יחסית בהשוואה ל-NO. במחקרים קודמים זוהה שריר השלד כאיבר אחסון מרכזי ליוני חנקות ביונקים, וכן כמקור ישיר של NO במהלך פעילות גופנית. לכן, קביעת מתודולוגיה אמינה למדידת רמות החנקות והניטריטים בשרירי השלד חשובה ואמורה לסייע בהרחבת יישומה לדגימות רקמות אחרות. מאמר זה מסביר בפירוט את הכנת דגימות שרירי השלד, תוך שימוש בשלוש שיטות הומוגניות שונות, למדידות ניטראט וניטריט ודן בנושאים חשובים הקשורים לתהליכי הומוגניזציה, כולל גודל הדגימות. ריכוזי ניטראט וניטריט הושוו גם בארבע קבוצות שרירים שונות.

Introduction

תחמוצת החנקן (NO), מולקולת איתות גזית קטנה, ממלאת תפקיד קריטי בתהליכים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים¹. לא ניתן לייצר NO מ-L-ארגינין על-ידי אנזימים אנדוגניים ממשפחת הסינתאז של תחמוצת החנקן (NOS) לפני שהוא עובר חמצון מהיר לחנקות (NO 3-) וייתכן שגם ניטריט (NO 2^-) בדם וברקמות ^2,3. לאחרונה הוכח כי אניונים אלה מופחתים בחזרה ל-NO במערכות יונקים⁴. חנקה מומרת לניטריט, בעיקר על ידי רדוקטזות של חיידקים חנקתיים בחלל הפה הפועלות על יונים המופרשים על ידי בלוטות הרוק ונבלעים ישירות ⁵, ובמידה מסוימת, על ידי אנזימים של יונקים כגון קסנטין אוקסידורדוקטאז ^6,7. ניטריט יכול להיות מופחת עוד יותר ל-NO על ידי מספר מנגנונים, כולל דאוקסיהמוגלובין⁸, דאוקסימיוגלובין⁹, אנזימים המכילים מוליבדן 10, והפחתה לא אנזימטית בנוכחות פרוטונים^11,12.

מסלול ניטריט-ניטריט-NO זה משופר בתנאים היפוקסיים שבהם פעילות ה-NOS פוחתת מכיוון ש-NOS דורש חמצן עבור NO דור⁴. מחקרים רבים שנערכו לאחרונה דיווחו על השפעות מועילות של חנקות תזונתיות על ויסות לחץ הדם ועל הביצועים הגופניים, מה שמצביע על כך שמסלולי הפחתת חנקות תורמים להגברת האיתות NO^13,14,15. מחקרים קודמים הראו כי חלק משרירי השלד הם ככל הנראה מקומות אחסון החנקות העיקריים בגוף¹⁶. בהשוואה לדם או לאיברים פנימיים אחרים כגון כבד, שרירי השלד (gluteus maximus) מכילים רמות גבוהות משמעותית של חנקות ויש להם מסה משמעותית בגוף היונקים. הודגם כי תרגיל הליכון משפר את הפחתת החנקות לניטריט ול-NO בגלוטאוס בחולדה מדגם⁷. תוצאות אלה מרמזות על כך ששרירי שלד מסוימים עשויים להיות מקורות חשובים ל-NO באמצעות מסלולי הפחתת חנקות במצבים פיזיולוגיים. מחקרים עדכניים יותר מצביעים על כך שממצאים אלה, כולל שינויים ברמות החנקות בשרירים במהלך פעילות גופנית, מתרחשים גם בבני אדם¹⁷.

שניים מהמחברים הנוכחיים ביססו בעבר שיטה למדידת רמות חנקות וניטריט בדם ובדגימות נוזליות אחרות¹⁸. עם זאת, כאשר הרמות של אניונים אלה בהומוגנטים רקמה נותחו בתחילה, פרוטוקולים מפורטים לא היו זמינים. כדי להבין את הדינמיקה של ניטרט-ניטריט-NO בכמה איברים שונים, המטרה שלנו הייתה לפתח שיטה מדויקת ויעילה למדידת רמות החנקות והניטריטים ברקמות יונקים, כולל שרירי השלד. במחקרים קודמים, רקמות מכרסמים שימשו לפיתוח תהליכי הומוגניזציה אמינים ולאחר מכן לניתוח תכולת חנקות וניטריטים באותם הומוגנטים 7,16,19^. השימוש בשיטת הומוגניזציה זו הורחב לדגימות ביופסיה של שרירי שלד אנושיים, לפיהן אושרו הערכים, וחשוב מכך, הערכים שנצפו עבור שריר בהשוואה לדם/פלזמה היו בטווחים ויחסים דומים לאלה שנצפו במכרסמים¹⁷. בשנים האחרונות, גם קבוצות אחרות החלו למדוד את רמות החנקות והניטריטים אצל הומוגנאטים בשרירי השלד, ודיווחו על ערכים דומים לאלה שדווחו על ידי הקבוצה שלנו^20,21.

מטרת מאמר פרוטוקול זה היא לתאר בפירוט את הכנת הומוגנאטים בשרירי השלד באמצעות שלוש שיטות הומוגניזציה שונות למדידה עוקבת של רמות חנקות וניטריטים. בנוסף, נבדקו ההשפעות של משקל הרקמה המשמש להומוגניזציה על ערכים של חנקות וניטריט בדגימות שרירי השלד. אנו מאמינים כי ניתן ליישם שיטות אלה בקלות על סוגים אחרים של רקמות יונקים. לאחרונה, במיוחד בתחום הפיזיולוגיה של האימון, הוקדשה תשומת לב להבדלים האפשריים בפיזיולוגיה של ניטריט/ניטריט/NO בהתאם לקבוצות שרירים. אנו מדווחים גם על כמויות הניטראט והניטריט בארבעה שרירי מכרסמים שונים ומוצאים התפלגות לא אחידה של שני היונים בין השרירים השונים האלה; תצפית הדורשת מחקר נוסף.

Protocol

פרוטוקול בעלי חיים אושר על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של NIDDK (ASP K049-MMB-20). בעלי חיים טופלו וטופלו על פי המדריך הנוכחי לטיפול ושימוש בחיות מעבדה הזמין באופן חופשי באתר AAALAC.

1. אוסף שרירי שלד עכברושים

1. בזמן שחולדה נמצאת תחת הרדמה עמוקה (5% איזופלורן, שאושר על ידי תגובה נעדרת לצביטת זנב/רגל), התחילו זלוף עם מי מלח המכילים הפרין על ידי הכנסת מחט של 19 גרם לתוך קצה של החדר השמאלי ויצירת ניק באטריום הימני. אפשרו למלח עם הפרין לחלחל דרך האיברים הפנימיים עד שלפחות 1.5 ליטר/ק"ג זרמו דרך הרקמה. בשלב זה, בעלי חיים מתים מאקסנגווינציה ופגרים מוכנים לעיבוד לאיסוף דגימות.
   הערה: השגת זלוף טוב היא קריטית, במיוחד עבור מדידות מדויקות של ניטריט, מכיוון שניטריט מחומצן לחנקות על ידי כל המוגלובין שנותר.
2. זהה רקמות שריר מטרה וכרית אותן מהרגליים האחוריות²² באמצעות מכשירי ניתוח נקיים. הסר כמה שיותר שומן ורקמות חיבור מרקמות השריר.
3. הכניסו את כמות השרירים הרצויה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה ולאחר מכן הניחו על קרח יבש. אחסנו את הצינורות המלאים ברקמה במקפיא של -80 מעלות צלזיוס.
   הערה: במקרה של דגימות ביופסיה אנושיות, יש להכתים אותן ביסודיות מיד עם האיסוף עם גזה נקייה כדי להסיר עודפי דם.

2. הכנה להומוגניזציה

1. הכנת תמיסה משמרת ניטריט (תמיסת עצירה)
   1. הכינו תמיסה צהובה שקופה המכילה 890 mM אשלגן פריציאניד (K₃Fe(CN)₆) ו-118 mM NEM (N-ethylmaleimide) במים מזוקקים, כדי להבטיח שלא יהיו גבישים. הוסיפו חומרים פעילי שטח לא יוניים (חומרי ניקוי) ביחס של 1:9 (v/v, Table of Materials), וערבבו בעדינות כדי למנוע הקצפה.
   2. יש לדלל את תמיסת העצירה ביחס של 1:9 עם מים מזוקקים. מניחים את תמיסת העצירה המדוללת (יחס של 1:5 בין רקמת השריר לתמיסת עצירה מדוללת) בצינור ההומוגניזציה.
      הערה: עשרים מיליגרם של רקמה ידרשו 100 μL של תמיסת עצירה, ו 200 מ"ג של רקמה ידרוש 1000 μL של תמיסת עצירה בצינור. נוכחות של חומר ניקוי בתמיסה נוספת היא קריטית לשיבוש של קרומי התא. ניתן להשתמש בכל חומר ניקוי שאינו יוני, אך יש להקפיד על כך שהוא אינו מפריע לשיטת הכימילומינסנציה.
2. הכנת רקמות
   1. מוציאים את הרקמה מהמקפיא בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס ומפשירים לאט בקרח. הסר את השומן הנותר ורקמת החיבור משרירי השלד. חותכים חתיכות של שרירי השלד וכתם על גזה לייבוש.
   2. שוקלים את כמות הרקמה (20, 50 ו -200 מ"ג). הניחו את שרירי השלד שנשקלו מראש בתמיסת העצירה בצינורות ההומוגניזציה או הניחו את הרקמה הנשקלת מראש בצינור מיקרוצנטריפוגה נקי לשימוש מאוחר יותר.

3. הומוגניזציה

1. הומוגנייזר סיבובי (איור 1)
   1. הכניסו למכונה את הצינור מסוג M המכיל את שרירי השלד שנשקלו מראש ותמיסת עצירה שנמדדה מראש. הומוגניזציה של כל דגימה פעמיים (הגדרת מחזור ההומוגניזציה ההרסני ביותר) והנחת הצינור על קרח מיד לאחר כל הומוגניזציה למשך 5 דקות כדי להתקרר.
   2. צנטריפוגה לזמן קצר ב-2,000 × גרם ו-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מניחים את הצינור המלא בחזרה על קרח ומוסיפים את הנפח המתאים של מתנול (≥ 99.9%, פי 10 ממשקל הרקמה). מערבולת ביסודיות במשך 15 שניות.
      הערה: עבור 20 מ"ג רקמה, יש להשתמש ב-200 μL של מתנול. מתנול משמש לזירוז חלבונים מהומוגנט רקמות ואינו מפריע לשיטת הכימילומינסנציה. אם נעשה שימוש בשיטת משקעי חלבון אחרים, בדוק את תאימותו לכימילומינסנציה.
   3. הומוגני פעם נוספת דגירה על קרח במשך 30 דקות. צנטריפוגה את הדגימות במשך 35 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ו 3,500 × גרם. שאפו את הסופר-נטנט ומדדו את רמות הניטריט/ניטראט, או אחסנו בטמפרטורה של -80°C לשימוש מאוחר יותר.
2. הומוגנייזר חרוזים (איור 2)
   1. מניחים את רקמת שריר השלד בצינור המכיל חרוזים (יחס של 1:5 לרקמה: תמיסת עצירה מדוללת) והומוגניים פעמיים במשך 45 שניות במהירות הגבוהה ביותר הקיימת במכשיר בו נעשה שימוש. מניחים את הצינור על קרח מיד לאחר כל הומוגניזציה למשך 5 דקות כדי להתקרר.
   2. צנטריפוגה לזמן קצר באמצעות צנטריפוגה שולחנית קטנה (2,000 x גרם) למשך 5 שניות. מניחים את הצינור בחזרה על קרח ומוסיפים נפח מתאים של מתנול (טוהר ≥ 99.9%, פי 10 ממשקל הרקמה). מערבולת ביסודיות במשך 15 שניות.
      הערה 1: עבור 20 מ"ג רקמה, יש להשתמש ב-200 μL של מתנול.
      הערה 2: מתנול משמש לזירוז חלבונים מהומוגנט רקמתי ואינו מפריע לשיטת הכימילומינסנציה. אם נעשה שימוש בשיטת משקעי חלבון אחרים, בדוק את תאימותו לכימילומינסנציה.
   3. הומוגניזציה פעם נוספת במשך 45 שניות במהירות הגבוהה ביותר הקיימת במכשיר שבו נעשה שימוש. דגירה על קרח במשך 30 דקות. צנטריפוגה ב 17,000 x גרם, 4 °C, 30 דקות. שאפו את הסופר-נטנט ומדדו את רמות הניטריט/ניטראט, או אחסנו בטמפרטורה של -80°C לשימוש מאוחר יותר.
3. פולברייזר (איור 3)
   1. הכינו צינורות המכילים תמיסת עצירה מדוללת (פי 5 ממשקל הרקמה) ושקלו אותם. רשום את המשקל (צינור + תמיסת עצירה).
   2. הניחו את כלי פולברייזר החנקן הנוזלי על קרח יבש והמתינו כ-30 דקות עד שהוא יגיע לטמפרטורה הרצויה.
   3. באמצעות פינצטה מקוררת בחנקן נוזלי, מעבירים דגימה אחת (משקל הרקמה כבר נמדד) לפולברייזר. הוסיפו כפית קטנה של חנקן נוזלי כדי לוודא שהרקמה נמצאת בטמפרטורת חנקן נוזלי.
   4. לאחר ש-95% מהחנקן הנוזלי התאדה, הניחו את כלי הריסוק על גבי הרקמה ולחצו בחוזקה. אתה צריך להרגיש את המדגם לרסק. באמצעות mallet, להכות את כלי ריסוק 3-5x.
   5. בדוק את הדגימה עבור כל הגושים הנותרים באמצעות כף מקורר בחנקן נוזלי. לאחר קירור בחנקן נוזלי, השתמשו בפיסת נייר טישו כדי לנגב מים קפואים לפני שאתם נוגעים ברקמה. אם נתח קיים, להזיז אותו למרכז, ולאחר מכן להכות 5-6 פעמים נוספות עם mallet.
   6. לאחר שהדגימה כולה נגנזה, השתמש בכף המקוררת בחנקן נוזלי כדי להעביר ישירות את הרקמה המרוסקת לתוך הצינור השקול מראש המכיל את תמיסת העצירה המדוללת (שלב 3.3.1). הקפד לבצע שלב זה במהירות כמו כאשר שריר השלד מרוסק מתחמם, זה נהיה דביק וקשה להעביר.
   7. וורטקס במשך 15 שניות. בדוק שאף רקמה לא תקועה בחלק העליון של הצינור על ידי פתיחת הצינור. אם יש, נסה להיפטר ממנו ואז מערבולת שוב.
   8. צנטריפוגה את הדגימה עבור 2-3 שניות באמצעות צנטריפוגה שולחנית קטנה. שוקלים שוב את הצינור. חשב את משקל הרקמה על ידי ניכוי משקל הצינור המקורי (שלב 3.3.1) ממשקל חדש זה. מניחים את הצינור על קרח.
      הערה: המשקלים המדויקים יעזרו לקבוע את משקל הרקמה המדויק וכמה רקמה אבדה במהלך הפולבריזציה.
   9. לאחר עיבוד כל הדגימות עד שלב 3.3.8, הוסף נפח מתאים של מתנול (≥ 99.9%, פי 10 ממשקל הרקמה). מערבולות ביסודיות במשך 15 שניות, ודוגרות על קרח במשך 30 דקות.
      הערה: עבור 20 מ"ג רקמה, יש להשתמש ב-200 μL של מתנול. מתנול משמש לזירוז חלבונים מהומוגנט רקמות ואינו מפריע לשיטת הכימילומינסנציה. אם נעשה שימוש בשיטת משקעי חלבון אחרים, בדוק את תאימותו לכימילומינסנציה.
   10. צנטריפוגה ב 17,000 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, 30 דקות. שאפו את הסופר-נטנט ומדדו את רמות הניטריט/ניטראט, או אחסנו בטמפרטורה של -80°C לשימוש מאוחר יותר.

4. מדידת ניטריט/ניטראט עם אנלייזר תחמוצת החנקן (NOA)

1. הכינו את כל הדגימות באחת משלוש שיטות הומוגניזציה שונות שתוארו לעיל והזריקו אותן ל-NOA למדידת חנקות וניטריטים.
   הערה: פרוטוקולים מפורטים לשימוש NOA פורסמו בעבר¹⁹.

תוצאות

כדי להשיג תוצאות מייצגות, רקמות שריר השלד מ 8 חולדות Wistar (זכרים ונקבות, משקל 250 ± 50 גרם) שימשו. הומוגנאטים של שרירי שלד חולדה (50 מ"ג של שריר גלוטאוס מקסימוס לכל שיטה) הוכנו על ידי שלושה כלי הומוגניזציה שונים (הומוגנייזר סיבובי, הומוגנייזר חרוזים ופולברייזר). לאחר מכן, תכולת החנקות והניטריטים של...

Discussion

כדי לעקוב אחר שינויים במטבוליטים NO, חנקות וניטריט, כפונקציה של התערבויות פיזיולוגיות, זה הכרחי כדי למדוד את רמות יונים אלה באיברים השונים כי הם קריטיים בחילוף החומרים שלהם. כמו המוגלובין בדם יגיב עם NO ואת המטבוליטים שלה, חשוב גם להסיר את הדם במהירות מדגימות רקמות ככל האפשר. לפיכך, בעלי חיים...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentleMACS dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235
gentle MACS M tube	Miltenyi Biotec	130-093-236	Length: 87 mm; Diameter: 30 mm
Heparin Sodium	Hospira	NDC-0409-7620-13
Isoflurane	Baxter	NDC-10019-360-60
Methanol	Sigma	646377
Minilys bead homogenizer	Bertin Instruments	P000673-MLYS0-A
NEM; N-ethylmaleimide	Sigma	4260
Nitric Oxide analyzer	GE	Sievers NOA 280i
NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol	Sigma	74385
Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6	Sigma	702587
Precellys lysing kit	Bertin Instruments	P000911-LYSK0-A	contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization
Pulverizer kit	Cellcrusher	Cellcrusher kit